ניתוח תפקוד אוטונומי של תאים של חלבון פיגור שכלי X שביר במעגל שמיעתי על ידי אלקטרופורציה של In Ovo

Summary

תוך שימוש באלקטרופורציה של ovo , פיתחנו שיטה לטרנספציה סלקטיבית של האוזן הפנימית השמיעתית וגרעין השבלול בעוברי עוף כדי להשיג פגיעה ספציפית לקבוצת התאים של חלבון פיגור שכלי X שביר במהלך תקופות בדידות של הרכבת מעגלים.

Abstract

חלבון פיגור שכלי X שביר (FMRP) הוא חלבון קושר mRNA המווסת את תרגום החלבון המקומי. אובדן FMRP או תפקוד לקוי מוביל לפעילות עצבית וסינפטית חריגה בתסמונת X שביר (FXS), המאופיינת במוגבלות אינטלקטואלית, הפרעות חושיות ובעיות תקשורת חברתית. מחקרים על תפקוד FMRP ופתוגנזה של FXS נערכו בעיקר עם Fmr1 (הנוקאאוט של FMRP המקודד גנים בבעלי חיים מהונדסים. כאן אנו מדווחים על שיטת in vivo לקביעת התפקוד האוטונומי של FMRP במהלך תקופת הרכבת המעגלים והיווצרות סינפטית באמצעות עוברי עוף. שיטה זו משתמשת באלקטרופורציה ספציפית לשלב, לאתר ולכיוון של מערכת וקטורית הניתנת להשראה לתרופות המכילה Fmr1 RNA קטן של סיכות שיער (shRNA) וכתב EGFP. בשיטה זו, השגנו נוק-דאון סלקטיבי של FMRP בגנגליון השמיעתי (AG) ובאחת ממטרות גזע המוח שלו, הגרעין מגנוצלולריס (NM), ובכך סיפקנו מניפולציה ספציפית לרכיב בתוך מעגל AG-NM. בנוסף, תבנית הפסיפס של ההעברה מאפשרת בקרות בתוך בעלי חיים והשוואות נוירונים/סיבים שכנים לאמינות ורגישות משופרות בניתוח נתונים. מערכת הווקטורים האינדוקטיביים מספקת בקרה זמנית על הופעת עריכת גנים כדי למזער את ההשפעות ההתפתחותיות המצטברות. השילוב של אסטרטגיות אלה מספק כלי חדשני לנתח את הפונקציה התאית-אוטונומית של FMRP בפיתוח סינפטי ומעגלים.

Introduction

תסמונת X שביר (FXS) היא הפרעה נוירו-התפתחותית המאופיינת על ידי מוגבלות אינטלקטואלית, הפרעות חושיות והתנהגויות אוטיסטיות. ברוב המקרים, FXS נגרמת על ידי אובדן גלובלי של חלבון פיגור שכלי X שביר (FMRP; מקודד על ידי הגן Fmr1) החל משלבים עובריים מוקדמים¹. FMRP הוא חלבון קושר RNA המתבטא בדרך כלל ברוב תאי העצב ותאי הגליה במוח, כמו גם באיברי החישה ^2,3,4. במוחות של יונקים, FMRP קשור ככל הנראה למאות mRNA המקודדים חלבונים החשובים לפעילויות עצביות שונות⁵. מחקרים על חיות נוקאאוט Fmr1 קונבנציונליות הראו כי ביטוי FMRP חשוב במיוחד להרכבה ולפלסטיות של העברה עצבית סינפטית⁶. מספר מודלים של נוקאאוט מותנה ופסיפס הראו עוד כי פעולות ואותות FMRP משתנים בין אזורי מוח, סוגי תאים ואתרים סינפטיים במהלך מספר אירועים התפתחותיים, כולל הקרנה אקסונלית, דפוס דנדריטי ופלסטיות סינפטית 7,8,9,10,11,12,13,14 . תפקוד חריף של FMRP בוויסות ההעברה הסינפטית נחקר על ידי העברה תוך תאית של נוגדני FMRP מעכבים או FMRP עצמו בפרוסות מוח או נוירונים בתרבית^15,16,17,18. עם זאת, שיטות אלה אינן מציעות את היכולת לעקוב אחר ההשלכות הנגרמות על ידי ביטוי שגוי של FMRP במהלך הפיתוח. לפיכך, פיתוח שיטות in vivo כדי לחקור את הפונקציות התאיות-אוטונומיות של FMRP הוא נחוץ מאוד, וצפוי לעזור לקבוע אם האנומליות המדווחות בחולי FXS הן השלכות ישירות של אובדן FMRP בנוירונים ובמעגלים הקשורים, או השלכות משניות הנגזרות משינויים ברחבי הרשת במהלך הפיתוח¹⁹.

גזע המוח השמיעתי של עוברי עוף מציע מודל בעל יתרון ייחודי לניתוחים תפקודיים מעמיקים של ויסות FMRP בהתפתחות מעגלים וסינפסות. הגישה הקלה למוחות של תרנגולות עובריות והטכניקה המבוססת היטב של אלקטרופורציה של אובו למניפולציה גנטית תרמו רבות להבנתנו את התפתחות המוח בשלבים עובריים מוקדמים. במחקר שפורסם לאחרונה, טכניקה זו שולבה עם כלים מולקולריים מתקדמים המאפשרים שליטה זמנית של ביטוי שגוי של FMRP^20,21. כאן, המתודולוגיה מתקדמת כדי לגרום למניפולציות סלקטיביות של נוירונים קדם-סינפטיים ופוסט-סינפטיים בנפרד. שיטה זו פותחה במעגל גזע המוח השמיעתי. אות אקוסטי מזוהה על ידי תאי שערה באוזן הפנימית השמיעתית ולאחר מכן מועבר לגנגליון השמיעתי (AG; נקרא גם גנגליון ספירלי ביונקים). נוירונים דו-קוטביים ב-AG innervates את תאי השערה עם התהליכים ההיקפיים שלהם, ובתורם שולחים הקרנה מרכזית (עצב השמיעה) לגזע המוח, שם הם מסתיימים בשני גרעיני שבלול עיקריים, הגרעין מגנוצלולריס (NM) והגרעין הזוויתי (NA). תאי עצב ב-NM דומים מבחינה מבנית ותפקודית לתאי השיח הכדוריים של גרעין השבלול האנטרו-בנטרלי של היונקים. בתוך ה-NM, סיבי עצב השמיעה (ANFs) סינפסה על הסומטה של נוירוני NM דרך הקצה הגדול של הדקים²². במהלך ההתפתחות, נוירונים NM נובעים מרומבומרים 5 ו -6 (r5/6) במוח האחורי²³, בעוד נוירונים AG נגזרים נוירובלסטים השוכנים באוטוציסט²⁴. כאן אנו מתארים את הפרוצדורה לדיכוי סלקטיבי של ביטוי FMRP בנוירוני AG הקדם-סינפטיים ובנוירוני NM הפוסט-סינפטיים בנפרד.

Protocol

ביציות ועוברי תרנגולות טופלו בזהירות ובכבוד בהתאם לפרוטוקולים של בעלי חיים שאושרו על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת ג'ינאן.

1. הכנת ביצים ופלסמידים

1. הכנת ביצים
   1. השיגו ביצי עוף מופרות טריות (Gallus gallus) מהאוניברסיטה החקלאית של דרום סין ואחסנו בטמפרטורה של 16 מעלות צלזיוס לפני הדגירה. לקבלת כדאיות אופטימלית, קבעו את כל הביצים לדגירה תוך שבוע מהגעתן.
   2. מניחים ביצים בצורה אופקית ודוגרים בטמפרטורה של 38 מעלות צלזיוס למשך 46-48 שעות עד שלב המבורגר והמילטון (HH) 12²⁵ להעברת התעלה העצבית, או למשך 54-56 שעות עד HH13 להעברת אוטוציזם. מכיוון שהקוטב החייתי של הביצה קל יותר מהקוטב הצמחי, מיקום אופקי ממקם את העובר על החלק העליון של הביצית למניפולציה קלה. היזהר כדי לשמור על הביצה אופקית זה ובכל השלבים הבאים.
   3. מיקום העובר מופיע כאזור כהה על קליפת הביצה בעת הטלת אור מתחתית הביצה באמצעות פנס. בשלבי HH הרצויים, השתמש בשיטת פנס זו כדי לסמן את מיקום העובר על קליפת הביצה בעיפרון.
   4. נגבו את הביצים בגזה המכילה 75% אתנול. קודחים חור בקצה המחודד של הביצים באמצעות קצה המספריים ומסירים 2 מ"ל אלבומין עם מזרק מחט 18 גרם. ודא שהחור גדול מספיק כדי לאפשר החדרת מחט. נגבו כל אלבומין דולף עם גזה וסתום את החור בנייר דבק שקוף.
   5. כדי למזער סדקים ולמנוע נפילת פסולת קליפה במהלך החלון, כסו את החלק העליון של הביצים בנייר דבק שקוף, ובמרכזו האזור הכהה המסומן בעיפרון.
2. מיצוי דנ"א פלסמיד
   1. שיבוט עוף Fmr1 shRNA באמצעות מערכת Tet-on מבוססת טרנספוזון כפי שתואר קודם^{לכן 20}. מערכת זו מכילה שלושה פלסמידים: pCAGGS-T2TP, pT2K-CAGGS-rtTA-M2, ו-pT2K-BI-TRE-EGFP-Fmr1 shRNA, המספקים מערכת וקטורית הניתנת להשראה לתרופות שבאמצעותה הביטוי של Fmr1 shRNA ו-EGFP מושתק לאחר הטרנספקציה וניתן להפעיל אותו על ידי אינדוקציה של דוקסיציקלין (Dox).
      הערה: פלסמידים אלה אינם זמינים כעת במאגר. המחברים מסכימים לספק את הפלסמידים על פי בקשה סבירה.
   2. חלץ DNAs פלסמידים באמצעות ערכת הכנה ללא אנדוטוקסין על פי הוראות היצרן וזרז על ידי הוספת 1/15 נפח של 7.5 M נתרן אצטט ונפח אחד של 100% איזופרופנול.
   3. מזרזים פלסמידים בטמפרטורה של -20°C למשך הלילה וצנטריפוגות בטמפרטורה של 13,000 x g למשך 10 דקות. ממיסים את הכדור עם חיץ Tris-EDTA המסופק בערכה לריכוז סופי של 4-5 מיקרוגרם/μL. ניתן לאחסן פלסמידים בטמפרטורה של -20°C למשך 12 חודשים ללא יעילות העברה מופחתת.
   4. ביום האלקטרופורציה, מערבבים היטב 2 μL מכל פלסמיד בצינור צנטריפוגה סטרילי באמצעות קצה פיפטה. הנפח המתקבל של 6 μL של תערובת הפלסמיד מספיק כדי לחשמל שלושה תריסר ביצים. כדי לעזור לדמיין את הפלסמיד במהלך האלקטרופורציה, הוסף 1 μL של 0.1% ירוק מהיר (מוכן ב ddH₂O סטרילי) עבור כל 6 μL של תערובת DNA²⁶, אשר הופך את תערובת פלסמיד כחול.

2. באלקטרופורציה של אובו

1. חלון ביציות וזיהוי עוברים
   1. ביום של electroporation, להסיר את הביצים מן האינקובטור, תריסר ביצים בכל פעם. הרחקת ביצים מהאינקובטור שלהן למשך יותר משעה גורמת לשינויים התפתחותיים ומפחיתה את הכדאיות.
   2. נגב את כל כלי הניתוח עם גזה המכילה 75% אתנול.
   3. מניחים כל ביצה במחזיק קצף בהתאמה אישית. נגבו את האזור המכוסה בנייר דבק ב-75% אתנול וחתכו חלון (1-2 ס"מ²) סביב היקף סימן העיפרון באמצעות זוג מספריים קטן (איור 1A). בעת החיתוך, החזיקו את המספריים שטוחים כדי למנוע פגיעה בעובר שמתחת.
   4. מניחים את ביצית החלון מתחת לסטריאומיקרוסקופ עם עינית 10x וזום 2x ומזהים את העובר. התאם את הזווית והבהירות של מקור האור לתצוגה חזותית טובה יותר.
      הערה: נדרש תרגול וניסיון כדי לדמיין את העובר ולזהות את הצינור העצבי בשלב זה.
      1. למתחילים, השתמש בהזרקת הדיו האופציונלית הבאה כדי להקל על זיהוי העובר. הכן מראש תמיסת דיו הודי של 10% בתמיסת מלח עם אגירת פוספט (PBS) ואוטוקלאב בנפח 0.01 M. מלא מזרק של 1 מ"ל בתמיסת הדיו ולאחר מכן התאם מחט 27G. כופפו את המחט לזווית של 45° בעזרת מלקחיים.
      2. מתחת למיקרוסקופ, לתקוע בזהירות מקצה האופקה באזור ולהחדיר את המחט מתחת לעובר. להזריק ~ 50 μL של דיו, אשר יתפזר מתחת לאזור pellucida להדמיית העובר. הדיו יהווה רקע כהה להדמיה ברורה של העובר.
         הערה: יש להוציא את האוויר מהמזרק לפני ההחדרה וההזרקה. כאשר אתה מיומן בהדמיה חזותית, הימנע משלב הזרקת הדיו מכיוון שהוא מפחית את שיעור ההישרדות.
2. הזרקת צינורות עצביים ואלקטרופורציה
   הערה: הליך זה מבוצע ב- HH12 עבור טרנספקציה של נוירוני NM בגזע המוח.
   1. משוך נימי זכוכית (~ 1 מ"מ קוטר ו 100 מ"מ אורך) לתוך פיפטות באמצעות מושך פיפטה. תחת מיקרוסקופ ניתוח, בזהירות לפתוח את קצה המחט נימי לקוטר 10-20 מיקרומטר עם מלקחיים. אחסנו את הפיפטות (בדרך כלל 5-10 בבת אחת) בקופסת אחסון עד לשימוש.
   2. מלאו פיפטה נימית עם 0.5-1 μL של תערובת פלסמיד על ידי הפעלת לחץ שלילי דרך צינור גומי בסוף הפיפטה. זה יכול להיות מושגת על ידי מזרק או משאבת אוויר.
   3. מניחים את הביצית מתחת למיקרוסקופ כך שהעובר מכוון אנכית עם הזנב קרוב אליכם (או אופקית להזרקת פיפטות נימיות באמצעות מניפולטור בעל שלושה צירים). החזיקו את הפיפטה הנימית ביד אחת או עם מניפולטור שלושת הצירים והניעו את קצה הפיפטה ל-r5/6 בכיוון זנב-אל-ראש.
      הערה: אזור המוח האחורי הקדמי ביותר הוא r1 וכל בליטה עוקבת לאורך הצינור העצבי היא רומבומרה בודדת. R5/6 נמצא באותה רמה אנטרופוסטרית כמו האוטוציסט, שהוא מבנה דמוי שניתן לזהותו בקלות (איור 1B-C).
   4. בעדינות לדחוף את הקצה דרך קרום vitelline לתוך הצינור העצבי הגבי ולאחר מכן למשוך את פיפטה קצת כך הקצה הוא לומן של הצינור העצבי. הזריקו את תערובת הפלסמיד על ידי הפעלת לחץ אוויר עד שהפלסמיד הכהה מתפזר במלואו ל-r5/6 ומתרחב ל-r3 ו-r4.
      הערה: אין צורך לבצע חריץ על קרום vitelline להזרקה.
   5. בדקו אם יש הזרקה מוצלחת, שמושגת כאשר תמיסת הפלסמיד הכחולה מתפזרת במהירות במורד התעלה העצבית מבלי לדלוף (איור 1B-C). כאשר מתרחשת דליפה, הכחול דוהה במהירות.
   6. מיד לאחר ההזרקה, הניחו אלקטרודת פלטינה דו-קוטבית משני צדי התעלה העצבית (איור 1D). ספק שתי פעימות של 12 וולט ומשך 50 אלפיות השנייה באמצעות אלקטרופורטור. שימו לב לבועות אוויר בקצות האלקטרודה הדו קוטבית, עם יותר בצד השלילי.
   7. בדוק אם אלקטרופורציה מוצלחת, אשר מושגת כאשר תערובת פלסמיד כהה נכנס לרקמת הצינור העצבי ליד הצד החיובי של האלקטרודה. לאחר אלקטרופורציה, להסיר בזהירות את האלקטרודה דו קוטבית.
   8. מכסים את החלון על קליפת הביצה בחתיכת סרט שקוף שנחתך מראש ל-2 ריבועים ומרוסס ב-75% אתנול. החזירו את הביצה לאינקובטור שלה.
   9. נקו את האלקטרודה הדו-קוטבית על ידי העברת 10-20 פולסים של 12 וולט ו-50 מילישניות במי מלח לפני שתמשיכו לביצה הבאה.
3. הזרקת אוטוציסט ואלקטרופורציה
   הערה: הליך זה מבוצע ב- HH13 עבור טרנספקציה של תאי שיער ונוירוני AG באוזן הפנימית.
   1. ב- HH13 (שהוא ~יום עוברי 2.5), העובר הסתובב כך שהצד הימני של הראש פונה כלפי מעלה. מתחת למיקרוסקופ, מניחים את הביצית כך שהעובר יהיה אנכי, כשהזנב קרוב אליכם. החזיקו את הפיפטה הנימית ודחפו בעדינות את האוטוציסטה הימנית בכיוון הגבי (איור 2A).
      הערה: בשלב זה, האוטוציסט מופיע כמבנה מעגלי קטן בחלק העליון של הגוף באותה רמה אנטרופוסטרית כמו r5/6.
   2. מזריקים את תערובת הפלסמיד בלחץ אוויר עד שהאוטוציסט מתמלא בתמיסה כחולה²⁷. בדוק אם יש הזרקה מוצלחת, אשר מושגת כאשר תערובת הפלסמיד הכחול כלואה בתוך האוטוציסט ואינה דולפת.
   3. מיד לאחר ההזרקה, הניחו את האלקטרודה הדו-קוטבית על האוטוציסט כפי שמתואר באיור 2B. מקם את הצדדים החיוביים והשליליים הקדמיים והאחוריים לאוטוציסט, בהתאמה. ספק שתי פעימות של 12 וולט ומשך 50 אלפיות השנייה עם האלקטרופורטור.
   4. בדוק אם אלקטרופורציה מוצלחת, אשר מושגת כאשר תערובת פלסמיד כחול נכנס לרקמה של otocyst ליד הצד החיובי של האלקטרודה. לאחר אלקטרופורציה, להסיר בזהירות את האלקטרודה דו קוטבית. מכסים את החלון על קליפת הביצה בסרט שקוף ומחזירים את הביצה לאינקובטור.

3. ניהול דוקס ליזום ולתחזק תמלול פלסמיד

1. הכנת תמיסת דוקס
   1. מדוד 100 מ"ג של אבקת Dox מתחת למכסה מנוע כימי והמיס אותה ב-100 מ"ל של PBS סטרילי כדי ליצור תמיסת עבודה של 1 מ"ג/מ"ל. סנן את התמיסה עם מסנן 0.22 מיקרומטר ואחסן 1 מ"ל aliquots ב -20 °C. הגנה מפני אור^20,28.
2. המינהל של דוקס
   1. לעריכת גנים בעוצמה מלאה, 24 שעות לפני הגיל הרצוי, הפשירו אליקוט דוקס על קרח. זרוק 50 μL של דוקס ישירות על הקרום chorioallantoic של הביצה באמצעות מזרק חודר את הסרט שקוף. אטמו את חור המחט עם סרט שקוף או סרט לאחר ההזרקה.
   2. כדי לשמור על אפקט ההדחה, יש לתת את Dox אחת ליומיים עד לקצירת הרקמות בשלב ההתפתחותי הרצוי.

4. דיסקציה וחתך רקמות

1. גזע המוח
   1. עבור עוברים בשלב עוברי 3 (E3) ו- E6, לפתוח את קליפת הביצה לחתוך את הקרום הקשור עם מספריים. הוציאו את העובר החוצה וטבלו אותו ב-4% פרפורמלדהיד (PFA) במאגר פוספט של 0.1 M.
   2. עבור עוברי E9, פתחו את קליפת הביצה, ערפו את העובר במספריים והעבירו את הראש לצלחת עם תחתית סיליקון מלאה ב-PBS. מצמידים את הראש למטה דרך המסלולים וחותכים את החלק העליון של הגולגולת לגזרים. מניחים בזהירות את המלקחיים מתחת למוח משני הצדדים ומרימים את המוח כולו מהגולגולת עם כתפי המלקחיים. לטבול את המוח ב-4% PFA.
   3. עבור עוברי E15 ו-E19, פתחו את קליפת הביצה, ערפו את העובר במספריים והניחו את הראש על צלחת עם תחתית סיליקון מלאה ב-PBS. חותכים לפתוח את העור על גבי הראש כדי לחשוף את הגולגולת.
   4. חותכים דרך הגולגולת אנכית עם סכין גילוח כדי להפריד בין המוח הקדמי לבין המוח הקאודאלי. לטבול את הבלוק caudal ב PBS, להסיר את החלק העליון של הגולגולת, ולאחר מכן לקחת את המוח מן הגולגולת.
   5. הצמד את המוח למטה דרך האונה האופטית והפרד את המוח הקטן ואת גזע המוח. היזהר לא לפגוע בגזע המוח השמיעתי, אשר ממוקם ממש מתחת למוח הקטן. הסר כמה שיותר דורה מגזע המוח ולאחר מכן טבל אותו ב-4% PFA.
   6. שמור על עוברים ורקמות מוח ב-4% PFA בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה, למעט גזעי מוח E19, אותם יש לשמור באותו מצב במשך 24 שעות.
   7. לאחר קיבוע, לייבש את הרקמה ב- PBS המכילה 30% סוכרוז עד שהיא שוקעת, מה שבדרך כלל לוקח 1-3 ימים, תלוי בגיל.
   8. חתכו את גזע המוח (E15 ו-E19) ב-30 מיקרומטר במישור הקורונלי באמצעות מיקרוטום מחליק. לאסוף חלקים ב- PBS ולאחסן ב 4 °C לפני immunostaining.
   9. עבור עוברי E3 ו- E6 וגזעי מוח E9, חתך ב 50 מיקרומטר רוחבי. לאסוף חלקים PBS ולאחסן ב 4 °C (64 °F). הרכיבו את החלקים על גבי שקופיות מיקרוסקופ מצופות ג'לטין לפני החיסון. איסוף חתכים עבים יותר לגילאים אלה מקל על הטיפול ברקמות.
2. צינור השמיעה
   1. לאחר הסרת גזעי המוח מעוברי E9, E15 ו- E19, צינור השמיעה, המוטבע בעצם הטמפורלית, ניתן לזיהוי בקלות שוכב מתחת לגולגולת, והעצם הטמפורלית ניתנת להפרדה בקלות מהגולגולת שמסביב. עבור עוברי E9, תקן את כל העצם הטמפורלית ב-4% PFA. עבור עוברים מבוגרים יותר, הסר את המבנה הגרמי של העצם הטמפורלית כדי לבודד את צינור השמיעה ולתקן את צינור השמיעה ב 4% PFA.
   2. יש לשמור את כל העצמות הטמפורליות וצינורות השמיעה ב-4% PFA בטמפרטורה של 4°C למשך הלילה לפני הטמעת הרקמות.
   3. בצע הטמעת רקמות כמתואר. הכינו את תמיסת ההטבעה באופן הבא: משרים 10% ג'לטין (מעור בקר) במים קרים עד שגרגירי הג'לטין מתנפחים ומתיישבים (כ-30 דקות). מחממים את התערובת ל~50°C כדי להמיס את הג'לטין ומוסיפים 20% סוכרוז לתמיסת הג'לטין ומערבבים עד להתמוססות. אחסנו את תמיסת הג'לטין-סוכרוז בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך עד חודש.
   4. לשימוש, מחממים את תמיסת הג'לטין-סוכרוז בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. משרים את העצמות הטמפורליות/צינורות השמיעה בתמיסת הג'לטין-סוכרוז החמה על צלחת של 96 מעלות צלזיוס בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עד שהן שוקעות, בדרך כלל 30-60 דקות.
   5. מרפדים את תחתית הבארות של צלחת בת 12 בארות ברצועת סרט שקוף. מוסיפים שכבה של תמיסת ג'לטין-סוכרוז חמה ומחכים עד שהיא תתמצק. מעבירים עצם זמנית/צינור שמיעתי לכל באר.
   6. להשתיל את הרקמה עם שכבה שנייה של תמיסת ג'לטין-סוכרוז חם. התאם את מיקום הרקמה כך שהיא תהיה במרכז הג'ל וצינור השמיעה מכוון אופקית. מעבירים בזהירות את הצלחת למקרר של 4 מעלות צלזיוס ומחכים עד שהג'ל יתקשח.
   7. משכו את רצועת הסרט השקופה כדי להזיז את גוש רקמת הג'ל אל מחוץ לבאר. חותכים ג'ל נוסף לגוש מרובע וחותכים פינה של הבלוק כדי לזהות את הכיוון. עוטפים את גוש הג'לטין בנייר כסף, מקפיאים על קרח יבש, ואז מאחסנים בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד לחתך.
   8. חתך את הבלוק ב 20 μm לאורך קו האורך של צינור השמיעה עם cryostat. הרכיבו את החלקים ישירות על שקופיות מיקרוסקופ מצופות ג'לטין. יש לאחסן את המגלשות בטמפרטורה של -80°C לפני תחילת ההצבעה.
   9. לפני החיסון, טבלו את השקופיות ב-PBS שחומם מראש (45 מעלות צלזיוס) למשך 5 דקות כדי להמיס את הג'לטין, ולאחר מכן שטפו את השקופיות פי 3 עם PBS בטמפרטורת החדר כדי להסיר שאריות ג'לטין.

5. אימונוסטינינג והדמיית מיקרוסקופ

הערה: שני סוגים של אימונוסטינינג מבוצעים בהתאם לשאלה אם חלקים מותקנים על שקופיות או צפים בחופשיות ב- PBS.

1. מכתמי חיסון בשקופיות
   1. לשטוף את השקופיות 3x במשך 10 דקות כל אחד עם PBS. הקיפו את האזור המכיל את החלקים בעט שמן כדי למנוע דליפת נוזלים במהלך הכתמים. מכסים את החלקים בתמיסת חסימה המכילה 5% סרום עיזים רגיל ב-PBS ומדגרים במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
   2. לדלל את הנוגדנים העיקריים (עבור הריכוז הסופי המשמש עיין טבלת החומרים) ב- PBS המכיל 0.3% TritonX-100 ו -5% סרום עיזים רגיל. הסר את תמיסת החסימה ולאחר מכן כסה את החלקים עם תמיסת הנוגדנים העיקרית. דגרו את המגלשות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה בקופסה המכילה שכבה של מים מזוקקים בתחתית.
   3. שטפו את השקופיות 3x למשך 10 דקות עם PBS. יש למרוח נוגדנים משניים פלואורסצנטיים המדוללים בשעה 1:500 ב-PBS המכילים 0.3% TritonX-100 על שקופיות. לדגור על המגלשות בטמפרטורת החדר למשך 4 שעות, מוגן מפני אור.
   4. שטפו את השקופיות 3x עם PBS. יש להשליך בעדינות שתי טיפות של מדיום הרכבה על השקופיות ולכסות את החלקים בכיסויים. היזהרו שלא ליצור בועות אוויר בין הכיסוי למגלשה.
2. חיסון לעוברים שלמים ולחלקים צפים חופשיים
   1. שטפו את העוברים / החלקים עם PBS 3x במשך 10 דקות כל אחד בצלחת באר. יש לדלל את הנוגדנים העיקריים ב-PBS המכילים 0.3% TritonX-100 ו-5% סרום עיזים רגיל בצינורות צנטריפוגליים. מעבירים כל עובר/חתך לצינור עם וו זכוכית ודוגרים על שייקר ב-60 סל"ד למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס.
   2. לשטוף עוברים / חלקים 3x עם PBS במשך 10 דקות כל אחד בצלחת באר. מעבירים כל עובר/חתך לצינור צנטריפוגלי כהה מלא בתמיסת נוגדנים משנית פלואורסצנטית ודוגרים בטמפרטורת החדר למשך 4 שעות על השייקר.
   3. שטפו את העוברים/מקטעים פי 3 עם PBS בצלחת באר. השתמשו במברשת כדי להרכיב את החלקים על שקופיות מיקרוסקופ מצופות ג'לטין בכלי בגודל 15 ס"מ המכיל PBS. לאחר שהמגלשות מתייבשות מעט (~5 דקות), יש למרוח שתי טיפות של מדיום הרכבה ולהניח כיסוי. היזהרו שלא ליצור בועות אוויר בין הכיסוי למגלשה. שמור את כל רקמות ההר ב- PBS להדמיה.
3. דימות
   1. דמיינו את כל רקמות ההרכבה ב-PBS בצלחת עם תחתית סיליקון המכילה אבקת פחמן, המספקת רקע שחור. צלם ועבד תמונות באמצעות חבילת תוכנה מסחרית לעיבוד תמונה אולימפוס, כפי שתואר קודם^{לכן 29}.
   2. דמיינו את הקטעים בשקופיות במיקרוסקופ קונפוקלי כפי שתואר קודם^{לכן 20}. צלם את המקטעים במישור מוקד יחיד עם מטרות של 10x, 20x ו- 63x. צלם את כל התמונות מאותה חיה באמצעות אותם פרמטרים. הקפד להתאים את רמת הלייזר ואת הגדרות רכישת ההדמיה כדי למנוע רוויית אות.
   3. בצע עיבוד תמונה באמצעות תוכנת פיג'י. לשם המחשה, התאם את הבהירות, הניגודיות והגמא של התמונה באמצעות תוכנה מקצועית לעריכת תמונות.

תוצאות

על ידי ביצוע אלקטרופורציה של ovo באתרים שונים ובשלבי התפתחות שונים, השגנו נפילת FMRP סלקטיבית בפריפריה השמיעתית או בגזע המוח השמיעתי.

נוק-דאון של FMRP ב-NM
RNA סיכת שיער קטנה (shRNA) כנגד התרנגולת Fmr1 תוכנן ושוכפל למערכת הווקטורית Tet-On כפי שתואר קודם^{לכן 20}

Discussion

כדי לקבוע את הפונקציה התאית-אוטונומית של FMRP, יש צורך במניפולציה של הביטוי שלה בקבוצות תאים בודדות או בסוגי תאים. מכיוון שאחד התפקידים העיקריים של FMRP הוא לווסת את ההיווצרות והפלסטיות הסינפטית, מניפולציה סלקטיבית של כל רכיב סינפטי של מעגל מסוים היא תנאי מוקדם להבנה מלאה של...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Egg incubation
16 °C refrigerator	MAGAT		Used for fertilized egg storage.
Egg incubator	SHANGHAI BOXUN	GZX-9240MBE
Fertilized eggs	Farm of South China Agricultural University		Eggs must be used in one week for optimal viability.
Plasmid preparation
Centrifuge	Sigma	10016
Fast green	Solarbio	G1661	Make 0.1% working solution in distilled water and autoclave.
Plasmid Maxi-prep kit	QIAGEN	12162	Dissolve plasmid DNA in Tris-EDTA (TE) buffer; endotoxin-free preparation kit
Sodium Acetate	Sigma-Aldrich	S2889	Make 7.5M working solution in nuclase-free water.
Electroporation and Doxycycline Administration
Electroporator	BTX	ECM399
1 mL / 5 mL Syringe	GUANGZHOU KANGFULAI
Dissecting microscope	CNOPTEC	SZM-42
Doxcycline	Sigma-Aldrich	D9891	Use fresh aliquots for each dose and store at -20 °C.
Glass capillary	BEIBOBOMEI	RD0910	0.9-1.1 mm*100 mm
Laboratory parafilm	PARAFILM	PM996	transparent film
Pipette puller	CHENGDU INSTRUMENT FACTORY	WD-2	Pulling condition: 500 °C for 15 s
Platinum elctrodes	Home made		0.5 mm diameter, 1.5 mm interval.
Rubber tube	Sigma-Aldrich	A5177
Tissue Dissection and Fixation
Forceps	RWD	F11020-11	Tip size: 0.05*0.01 mm
Other surgery tools	RWD
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127	Freshly made 4% PFA solution in phosphate-buffered saline can be stored in 4 °C for up to 1 week.
SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit	DOW	01673921	For black background plates, food-grade carbon powder is applied.
Sectioning
Cryostat	LEICA	CM1850
Gelatin	Sigma-Aldrich	G9391	From bovine skin.
Sliding microtome	LEICA	SM2010
Immunostaining
Alexa Fluor 488 goat anti-Mouse	Abcam	ab150113	1:500 dilution, RRID: AB_2576208
Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit	Abcam	ab150078	1:500 dilution, RRID: AB_2722519
DAPI	Abcam	ab285390	1: 1000 dilution
Fluoromount-G mounting medium	Southern Biotech	Sb-0100-01
FMRP antibody	Y. Wang, Florida State University	#8263	1:1000 dilution, RRID: AB_2861242
Islet-1 antibody	DSHB	39.3F7	1:100 dilution, RRID: AB_1157901
Netwell plate	Corning	3478
Neurofilament antibody	Sigma-Aldrich	N4142	1:1000 dilution, RRID: AB_477272
Parvalbumin antibody	Sigma-Aldrich	P3088	1:10000 dilution, RRID: AB_477329
SNAP25 antibody	Abcam	ab66066	1:1000 dilution, RRID: AB_2192052
Imaging
Adobe photoshop	ADOBE		image editing software
Confocal microscope	LEICA	SP8
Fluorescent stereomicroscope	OLYMPUS	MVX10
Olympus Image-Pro Plus 7.0	OlYMPUS		commercial image processing software package