הכנת RNA ארוך ציטופלזמי וגרעיני מתאים ראשוניים ותאי תרבית

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מציע שיטה יעילה וגמישה לבודד RNA משברים גרעיניים וציטופלזמיים באמצעות תאים בתרבית, ולאחר מכן לאמת באמצעות qPCR. זה משמש למעשה כתחליף לערכות הכנת RNA אחרות.

Abstract

ההפרדה של רכיבים תוך-תאיים היא כלי מרכזי בביולוגיה התאית כבר שנים רבות, והיא מסוגלת לספק תובנה שימושית לגבי האופן שבו מיקומם יכול להשפיע על תפקודם. בפרט, ההפרדה בין RNA גרעיני וציטופלזמי הפכה חשובה בהקשר של תאים סרטניים והחיפוש אחר מטרות חדשות לתרופות. רכישת ערכות למיצוי RNA גרעיני-ציטופלזמי יכולה להיות יקרה כאשר רבים מהחומרים הדרושים נמצאים בסביבת מעבדה טיפוסית. בשיטה הנוכחית, שיכולה להחליף ערכות יקרות יותר או תהליכים אחרים שגוזלים זמן, נדרשים רק חיץ ליזיס תוצרת בית, צנטריפוגה וספסל ועמודות טיהור בידוד RNA כדי לבודד RNA גרעיני וציטופלזמי. חיץ ליזיס משמש לליזה עדינה של הקרום החיצוני של התא מבלי להשפיע על שלמות מעטפת הגרעין, ומאפשר שחרור מרכיביו התוך-תאיים. לאחר מכן, ניתן לבודד את הגרעינים על ידי צעד צנטריפוגה פשוט מכיוון שהם בעלי צפיפות גבוהה יותר מתמיסת הליזיס. צנטריפוגה משמשת להפרדת אזורים אלה בהתבסס על הבדלי הצפיפות שלהם כדי לבודד יסודות תת-תאיים בגרעין מאלה שבציטופלסמה. לאחר שהצנטריפוגה בודדה את הרכיבים השונים, נעשה שימוש בערכת ניקוי RNA לטיהור תכולת הרנ"א, ומתבצע qPCR כדי לאמת את איכות ההפרדה, המכומתת על ידי כמות הרנ"א הגרעיני והציטופלזמי בשברים השונים. הושגו רמות מובהקות סטטיסטית של הפרדה, הממחישות את יעילות הפרוטוקול. בנוסף, ניתן להתאים מערכת זו לבידוד סוגים שונים של RNA (סה"כ, רנ"א קטן וכו'), מה שמאפשר מחקר ממוקד של אינטראקציות ציטופלסמה-גרעין, ומסייע בהבנת ההבדלים בתפקוד הרנ"א השוכנים בגרעין ובציטופלסמה.

Introduction

שבירה תאית לרכיבים תת-תאיים מאפשרת בידוד ולימוד של תחומים ביוכימיים מוגדרים ומסייעת בקביעת לוקליזציה של תהליכים תאיים ספציפיים וכיצד זה עשוי להשפיע על תפקודם¹. בידוד הרנ"א ממקומות תוך-תאיים שונים יכול לאפשר דיוק משופר של ניתוח גנטי וביוכימי של אירועים ברמת השעתוק ואינטראקציות אחרות בין הגרעין לציטופלסמה, המשמש כמטרה העיקרית של פרוטוקול² הנוכחי. פרוטוקול זה פותח כדי להבטיח בידוד של רנ"א ציטופלזמי וגרעיני, לקבוע את תפקידם בהתאמה בייצוא גרעיני, ולהבין כיצד לוקליזציה תת-תאית של רנ"א בגרעין ובציטופלסמה עשויה להשפיע על תפקודם בתהליכים תאיים. באמצעות שימוש בחומרים מסביבת מעבדה טיפוסית, ניתן היה להשיג שבר גרעיני וציטופלזמי בצורה יעילה יותר וזולה יותר מאשר פרוטוקולים שנקבעו בעבר מבלי לסכן את איכות התוצאות³.

בנוסף, חילופי מולקולות בין הציטופלסמה לגרעין יכולים להיחקר ישירות על ידי הפרדת אזורים אלה. באופן ספציפי יותר, הבנת התמליל חיונית להבנת התפתחות ומחלות. עם זאת, רנ"א עשוי להיות ברמות הבשלה שונות בכל זמן נתון ויכול לסבך את הניתוח במורד הזרם. פרוטוקול זה מאפשר את היכולת לבודד RNA משברים תת-תאיים גרעיניים וציטופלזמיים, מה שיכול לסייע במחקרים של RNA ולאפשר הבנה טובה יותר של RNA מסוים מעניין, כגון לוקליזציה של RNA לא מקודד או ניתוח של צמתים splice בתוך הגרעין.

פרוטוקול זה הותאם לבידוד רנ"א ארוך ציטופלזמי וגרעיני, כולל mRNAs, rRNA ורנ"א ארוך שאינו מקודד (lncRNAs), בשל סלקטיביות הגודל של עמודת טיהור הרנ"א המנוצלת, הניתנת לשינוי כדי לבודד רנ"א אחרים בעלי עניין. בעבר, תפקודם של רנ"א ארוך, כגון mRNA ו-lncRNAs, היה תלוי מאוד בלוקליזציה שלהם בתוך התא ^4,5. לכן, חקר הייצוא מהגרעין לתחומים תת-תאיים נעשה ממוקד יותר לקראת הבנת התפקיד שיכול להיות לייצוא רנ"א או רכיבים תאיים אחרים על התא. lncRNA משמשים דוגמה מצוינת לכך, שכן תרגומם והשפעותיהם לאחר מכן מסתמכים במידה רבה על קרבה ואינטראקציות עם צורות אחרות של RNA⁶. יתר על כן, חילופי יסודות תאיים בין אזורים גרעיניים וציטופלזמיים קשורים למנגנוני עמידות לטיפולים שונים בסרטן⁷. בידודם של תאים תוך-תאיים איפשר פיתוח מעכבי יצוא גרעיני, אשר הפחית את ההשפעות של מנגנוני התנגדות לטיפולים שונים⁸.

לאחר הפרדת RNA גרעיני וציטופלזמי, מבוצעים צעדים לטיהור הרנ"א מעניין. מכיוון שערכות טיהור RNA נמצאות בדרך כלל במעבדות ותפקידן לטהר ולבודד רנ"א ארוך, הן משרתות היטב את מטרת פרוטוקול זה. עבור טיהור RNA, יצירת יחסים של 260:280 גדולים מ-1.8 היא קריטית כדי להבטיח את איכות הדגימות לריצוף RNA או הליכים דומים אחרים הדורשים רמות גבוהות של טוהר ובידוד. ערכים לא סדירים של 260:280 מצביעים על זיהום פנול, מה שמדגים בידוד לקוי ומניב תוצאות לא מדויקות⁹.

לאחר השלמת טיהור הרנ"א ואושר כי ערכי 260:280 גבוהים מטווח מקובל, נעשה שימוש ב-qPCR כדי לאמת את תוצאות הבידוד של שברים גרעיניים וציטופלזמיים. בעשותם כן, נעשה שימוש בפריימרים ספציפיים לאזור העניין כדי להדגים את רמות השבר הגרעיני והציטופלזמי. בפרוטוקול זה, MALAT1 ו- TUG1 שימשו כסמנים גרעיניים וציטופלזמיים, בהתאמה¹⁰. יחד, הם מאפשרים הדגמה של רמות גבוהות של שבר גרעיני עם MALAT1, בעוד שבר ציטופלזמי צפוי להיות נמוך. לעומת זאת, כאשר משתמשים ב-TUG1, רמות השבר הציטופלזמי צפויות להיות גבוהות יותר מרמות השבר הגרעיני.

באמצעות פרוטוקול זה ניתן היה לבודד רנ"א על סמך מיקום פעולתם בתוך התא. בשל גישה נרחבת לחומרים רבים ושימוש רק בחיץ ליזה ובטכניקות צנטריפוגות מבוססות צפיפות במהלך ניסוי זה, היישום על סוגי RNA אחרים ורכיבים תאיים אחרים הוא נרחב. זה יכול לספק מידע חשוב על ידי שפיכת אור על אירועי ביטוי ספציפיים למיקום שאחרת לא ניתן היה להבחין בהם ללא הפרדה.

Protocol

תאי K562 משמשים במחקר הנוכחי. פרוטוקול זה עבר אופטימיזציה לעבודה עבור 1 x 10 6-5 x 10⁶ מיליון תאים. עם זאת, ניתן להגדיל את ההליך עבור כמויות תאים גדולות יותר על ידי הגדלת הנפחים כראוי.

1. הכנת חיץ ליזיס 0.25x

1. הכן מאגר ליזיס 0.25x על-ידי ערבוב הרכיבים הבאים המופיעים בטבלה 1A.
   הערה: הדגימות דורשות כ- 300 μL של מאגר ליזיס 0.25x. נפח מומלץ = מספר הדגימות x 300 μL.

2. הפרדת שברים גרעיניים וציטופלזמיים

1. גלולה את התאים באמצעות צינורות 1.5 מ"ל באמצעות צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 2000 x גרם (טמפרטורת החדר). השליכו את הסופרנאטנט בעזרת פיפטה שואפת.
   הערה: תאי K562 נוצלו במהלך פרוטוקול זה. עם זאת, ניתן להתאים את הפרוטוקול לקווי תאים שונים.
2. השהה מחדש את הגלולה ב 300 μL של חיץ ליזיס קר כקרח 0.25x.
   הערה: יש לשמור על קרח למשך 2 דקות ולסובב את הצינור כל 45 שניות כדי להבטיח ליזה תקינה של התאים.
3. סובב את הצינורות במהירות הגבוהה ביותר (12,000 x גרם) ב- 4 ° C למשך 2 דקות.
4. לאחר הצנטריפוגה, בזהירות להסיר את supernatant ומניחים אותו בתוך צינור חדש 1.5 מ"ל. זה יהיה החלק הציטופלזמי. כ 300 μL של החלק הציטופלזמי יושג.
5. הגלולה הנותרת תהיה החלק הגרעיני. הוסף 500 μL של PBS קר כקרח לגלולה ולצנטריפוגה ב 2,000 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
   הערה: במהלך שלב זה, דנ"א עודף מוסר.

3. ניקוי RNA באמצעות ערכת טיהור RNA

הערה: פרוטוקול זה הושג באמצעות ערכת טיהור RNA זמינה מסחרית (ראה טבלת חומרים).

1. הפרידו בין דגימות הרנ"א הציטופלזמי לבין הדגימות הציטופלזמיות הגרעיניות (מכיוון ששלבי השבר משתנים ביניהן).
   1. כדי להפריד את החלק הציטופלזמי, הוסף 1,050 μL של חיץ ליזה RLT 3.5x (ראה טבלת חומרים) ומערבולת לזמן קצר. לאחר מכן, הוסף 750 μL של 90% אתנול וטען אותו על העמוד מתוך ערכת ניקוי RNA.
      הערה: הפתרון חייב להיות מעורבב היטב לפני הטעינה על העמודה.
   2. כדי להפריד את החלק הגרעיני, הוסף 600 μL של חיץ ליזה 3.5x ומערבולת. לאחר מכן, להוסיף 600 μL של 70% אתנול.
2. טען שברים ציטופלזמיים וגרעיניים על עמודות RNA (ראה טבלת חומרים).
   הערה: במשך שארית שלב 3, הן הדגימה הציטופלזמית והן הדגימה הגרעינית עוקבות אחר אותו הליך. עם זאת, ודא כי דגימות אלה נשארות בלתי תלויות זו בזו.
   1. טען הן שברים ציטופלזמיים והן גרעיניים על עמודות RNA והסתובב במשך 30 שניות ב 8,000 x גרם בטמפרטורת החדר. השליכו את עודפי הזרימה דרכה.
   2. הוסיפו 350 מיקרוליטר של חיץ כביסה מערכת טיהור מסחרית (מאגר RW1, ראו טבלת חומרים), סובבו שוב והשליכו את הזרימה.
   3. הוסף תמיסת DNAse (1U/uL) למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הוסיפו 350 מיקרוליטר של חיץ כביסה, סובבו שוב והשליכו את הזרימה.
   4. הוסיפו 500 מיקרוליטר של חיץ כביסה עדין (RPE, ראו טבלת חומרים), סחררו שוב והשליכו את הזרימה. מוסיפים 500 μL של חיץ כביסה עדין, מסתובבים שוב, אבל רק למשך 2 דקות.
   5. העבר את העמוד לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש של 1.5 מ"ל והוסף 30 מיקרוליטר מים לעמוד הסחרור. הניחו לטור לשבת דקה אחת לפני הסיבוב כלפי מטה.

4. אימות ההפרדה הגרעינית-ציטופלזמית

1. ביצוע סינתזת cDNA
   1. לאחר מיצוי וטיהור תאים תת-תאיים של RNA, אשרו את הפרדת התאים באמצעות qPCR. לשם כך, ראשית, המירו את הרנ"א ל-cDNA באמצעות ערכה מסחרית בהתאם להוראות היצרן (ראו טבלת חומרים).
   2. הכן מאסטרמיקס תמלול הפוך. הוסף RNA של תבנית. לדגור תגובות thermocycler.
      הערה: עבור הקסמרים אקראיים, פרמטרי הרכיבה המשמשים מופיעים בטבלה 2A. השתמש מיד בתגובת התעתיק ההפוך או אחסן בטמפרטורה של -20°C (טבלה 1B).
2. בצע את תגובת השרשרת הכמותית של פולימראז (qPCR) וניתוח.
   1. לדלל את סינתזת cDNA עם מי DEPC (ראה טבלה של חומרים) כדי לקבל ריכוז סופי של 20 ng/mL.
   2. באמצעות תערובת מאסטר PCR, הכן את התגובה עבור כל דגימה באמצעות הוראות ידניות כמפורט להלן.
   3. לרכוש בדיקות מסחריות הדרושות כדי לזהות שבר ציטופלזמי וגרעיני. השתמש ב- MALAT1 כסמן גרעיני וב- TUG1 כסמן ציטופלזמי (ראה טבלת חומרים).
      הערה: רצפים עבור MALAT1 ו- TUG1 מוצגים בטבלה 3.
   4. חשב את הנפח של כל רכיב על-ידי הכפלת כל רכיב ב- 3 עבור כל אחד מהעותקים הטכניים המשוכפלים עבור המדגם הבודד.
   5. עבור כל דגימה גרעינית וציטופלזמית, רכוש את התערובות הבאות עבור כל אחת מהן: (א) שבר גרעיני עם MALAT1, (ב) מקטע ציטופלזמי עם MALAT1, (ג) שבר גרעיני עם TUG1, ו-(ד) שבר ציטופלזמי עם TUG1 (טבלה 1C).
   6. מערבלים לזמן קצר כדי לערבב תמיסות ולהעביר 20 μL מהתערובת לכל באר של צלחת תגובה אופטית (ראה טבלת חומרים).
   7. כסו את הצלחת בסרט דבק שקוף המשמש ל-qPCR (ראו טבלת חומרים) וצנטריפוגו את הצלחת לזמן קצר כדי למנוע בועות אוויר, ולאחר מכן סובבו את הדגימה כלפי מטה ב-300 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
   8. באמצעות תוכנת תכנון וניתוח (ראה טבלת חומרים), בחר את העקומה הסטנדרטית עבור פרמטרי המחזור (טבלה 2B).
   9. באמצעות תוכנת qPCR, בחר הגדר הפעלה (איור משלים 1).
   10. בדף מאפייני קובץ נתונים, בחר פרמטרים של שיטה ומחזור קלט מטבלה 2B (איור משלים 2).
   11. לאחר הזנת פרמטרים של מחזור, בחר בכרטיסיה צלחת והזן את הדגימות שיש להפעיל (איור משלים 3). בחר התחל הפעלה.
       הערה: השלבים המתוארים בוצעו במכשיר qPCR באמצעות תערובת אב זמינה מסחרית (ראה טבלת חומרים).
3. ביצוע ניתוח נתונים
   1. לאחר השלמת ההפעלה, צור גיליון אלקטרוני של נתונים עם שם המדגם, שם היעד ומחזור הכימות (Cq) (טבלה משלימה 1).
   2. התחל עם דגימות MALAT1 כדי לחשב את החלק הגרעיני. החסר את המקטע הציטופלזמי MALAT1 מהמקטע הגרעיני MALAT1 (טבלה 4).
   3. לאחר מכן, חשב את ΔCq (2^(-value)) (טבלה 5).
   4. המשך עם דגימות MALAT1 כדי לחשב את המקטע הציטופלזמי, החסר את החלק הגרעיני MALAT1 מהמקטע הציטופלזמי MALAT1, ולאחר מכן חשב את ΔCq (2^(-value)) (טבלה 6).
      הערה: כאשר מסתכלים על ΔCq, נצפה כי לשבר MALAT1 הגרעיני (הדגשה ירוקה) יש סמן MALAT1 גדול יותר מאשר לציטופלסמה (הדגשה אדומה), אך כעת נדרש אישור כדי להבטיח שהמקטע הציטופלזמי הוא בעיקר ציטופלסמה וכי החלק הגרעיני אינו מכיל זיהום ציטופלזמי.
   5. עם דגימות TUG1, בצע את אותו חישוב כמו לעיל (שלבים 4.3.2-4.3.4) (טבלה 7).
      הערה: כשמסתכלים על ΔCq, רואים שלשבר TUG1 הציטופלזמי (הדגשה ירוקה) יש סמן TUG1 גדול יותר מהשבר הגרעיני (הדגשה אדומה), ובכך מאשר הפרדה טובה בין שברים ציטופלזמיים וגרעיניים (טבלה 8, איור 1).

תוצאות

כדי להבטיח בידוד גרעיני וציטופלזמי, בוצע qPCR כדי לאמת את התוצאות. בעשותם כן, נעשה שימוש בפריימרים ספציפיים לאזור העניין כדי להדגים את רמות השבר הגרעיני והציטופלזמי. במחקר זה, MALAT1 ו- TUG1 שימשו כפריימרים גרעיניים וציטופלזמיים, בהתאמה. יחד, הם מאפשרים הדגמה של רמות גבוהות של שבר גרעיני עם MALAT1 כב?...

Discussion

לאורך הפרוטוקול, ננקטו כמה צעדים כדי לייעל את האלמנטים כדי להיות היעילים ביותר עבור קו התא של עניין. בעוד השלבים בתוך הפרוטוקול הם פשוטים יחסית, ניתוח והתאמות קלות במהלך היבטים קריטיים של הפרוטוקול עשויים להיות נחוצים. השלב הקריטי ביותר בפרוטוקול הוא שינוי ריכוז חיץ הליזיס לריכוז תקין בה?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agilent Tapestation	Agilent	G2991BA	The Agilent TapeStation system is an automated electrophoresis solution for the sample quality control of DNA and RNA samples.
0.5% Nonidet P-40	Thermo-Fischer	28324	Used in the making of lysis buffer
50 mM Tris-Cl pH 8.0	Thermo-Fischer	15568025	Used in the making of lysis buffer
MALAT1 GE Assay	Thermo-Fischer	Hs00273907_s1	Utilized for confirmation of Nuclear fraction.
MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode	Thermo-Fischer	4326659	The Applied Biosystems MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode is optimized to provide unmatched temperature accuracy and uniformity for fast, efficient PCR amplification. This plate, constructed from a single rigid piece of polypropylene in a 96-well format, is compatible with Applied Biosystems 96-Well Real-Time PCR systems and thermal cyclers.
MicroAmp Optical Adhesive Film	Thermo-Fischer	4311971	The Applied Biosystems MicroAmp Optical Adhesive Film reduces the chance of well-to-well contamination and sample evaporation when applied to a microplate during qPCR
PBS	Gibco	20012-023	Phosphate-buffered saline (PBS) is a balanced salt solution that is used for a variety of cell culture applications, such as washing cells before dissociation, transporting cells or tissue samples, diluting cells for counting, and preparing reagents.
Qiagen RNA Clean Up Kit-Rneasy Mini Kit	Qiagen	74106	RNA cleanup kits enable efficient RNA cleanup of enzymatic reactions and cleanup of RNA purified by different methods. Includes RW1, RLT, RW1 buffers mentioned throughout protocol.
QuantStudio 6	Thermo-Fischer	A43180	qPCR software utilized during protocol. Includes Design and Analysis Software for analyzing fractionation samples
RLT Buffer	Qiagen	79216	Lysis Buffer from RNA clean-up kit
RPE Buffer	Qiagen	1018013	Wash Buffer from RNA clean-up kit
RW1 Buffer	Qiagen	1053394	Wash Buffer from RNA clean-up kit
Taqman Gene Expression Assays	Thermo-Fischer	4331182	Applied Biosystems TaqMan Gene Expression Assays represent the largest collection of predesigned assays in the industry with over 2.8 million assays across 32 eukaryotic species and numerous microbes. TaqMan Gene Expression assays enable you to get results fast with no time wasted optimizing SYBR Green primers and no extra time spent running and analyzing melt curves.
TaqMan Universal PCR Master Mix	Thermo-Fischer	4305719	TaqMan Universal PCR Master Mix is the ideal reagent solution when you need a master mix for multiple 5' nuclease DNA applications. Applied Biosystems reagents have been validated with TaqMan assays and Applied Biosystems real-time systems to ensure sensitive, accurate, and reliable performance every time.
TUG1 GE Assay	Thermo-Fischer	Hs00215501_m1	Utilized for confirmation of Cytoplasmic fraction.
UltraPure DEPC-Treated Water	Thermo-Fischer	750024	UltraPure DEPC-treated Water is suitable for use with RNA. It is prepared by incubating with 0.1% diethylpyrocarbonate (DEPC), and is then autoclaved to remove the DEPC. Sterile filtered.