JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את הביו-הנדסה של שלפוחיות הממברנה החיצונית כפלטפורמת חיסון "Plug-and-Display", כולל ייצור, טיהור, ביו-קונגציה ואפיון.

Abstract

ננו-חלקיקים ביומימטיים המתקבלים מחיידקים או מווירוסים משכו עניין רב במחקר ובפיתוח חיסונים. שלפוחיות הממברנה החיצונית (OMVs) מופרשות בעיקר על ידי חיידקים גראם-שליליים במהלך גדילה ממוצעת, עם קוטר בגודל ננומטרי ופעילות אדג'ובנטית עצמית, שעשויה להיות אידיאלית להעברת חיסונים. OMVs תפקדו כמערכת אספקה רבת פנים לחלבונים, חומצות גרעין ומולקולות קטנות. כדי לנצל את מלוא המאפיינים הביולוגיים של OMVs, נעשה שימוש ב-OMVs שמקורם ב-Escherichia coli שעברו הנדסה ביולוגית כנשא ותחום קשירת קולטן SARS-CoV-2 (RBD) כאנטיגן לבניית פלטפורמת חיסון "הכנס-והצג". תחומי SpyCatcher (SC) ו- SpyTag (ST) בסטרפטוקוקוס פיוגנס יושמו כדי להצמיד OMVs ו- RBD. הגן Cytolysin A (ClyA) תורגם עם הגן SC כחלבון היתוך לאחר טרנספקציה פלסמידית, והשאיר אתר תגובתי על פני השטח של OMVs. לאחר ערבוב RBD-ST במערכת חיץ קונבנציונלית בן לילה, נוצר קשירה קוולנטית בין OMVs ו- RBD. כך הושג חיסון OMV רב-ערכי. על ידי החלפה באנטיגנים מגוונים, פלטפורמת החיסון OMVs יכולה להציג ביעילות מגוון אנטיגנים הטרוגניים, ובכך למנוע במהירות מגיפות של מחלות זיהומיות. פרוטוקול זה מתאר שיטה מדויקת לבניית פלטפורמת החיסון OMV, כולל ייצור, טיהור, ביו-קונגציה ואפיון.

Introduction

כפלטפורמת חיסון פוטנציאלית, שלפוחיות הממברנה החיצונית (OMVs) משכו יותר ויותר תשומת לב בשנים האחרונות 1,2. OMVs, המופרשים באופן טבעי בעיקר על ידי חיידקים גראם שליליים3, הם חלקיקים ננומטריים כדוריים המורכבים מדו-שכבת שומנים, בדרך כלל בגודל של 20-300 ננומטר4. OMVs מכילים רכיבים שונים של חיידקי הורים, כולל אנטיגנים חיידקיים ותבניות מולקולריות הקשורות לפתוגנים (PAMPs), המשמשים כפוטנציאטורים חיסוניים מוצקים5. הודות למרכיביהם הייחודיים, מבנה השלפוחית הטבעי ואתרי שינוי נהדרים בהנדסה גנטית, OMVs פותחו לשימוש בתחומים ביו-רפואיים רבים, כולל חיסונים חיידקיים6, אדג'ובנטים7, תרופות אימונותרפיות לסרטן8, וקטורים למתן תרופות9 ודבקים אנטי-בקטריאליים10.

מגיפת SARS-CoV-2, שהתפשטה ברחבי העולם מאז 2020, גבתה מחיר כבד מהחברה העולמית. תחום קשירת הקולטן (RBD) בחלבון ספייק (חלבון S) יכול להיקשר עם אנזים ממיר אנגיוטנסין אנושי 2 (ACE2), אשר לאחר מכן מתווך את כניסת הנגיף לתא11,12,13. לפיכך, נראה כי RBD הוא יעד עיקרי לגילוי חיסונים14,15,16. עם זאת, RBD מונומרי הוא אימונוגני גרוע, והמשקל המולקולרי הקטן שלו מקשה על מערכת החיסון לזהות, ולכן אדג'ובנטים נדרשים לעתים קרובות17.

על מנת להגביר את האימונוגניות של RBD, נבנו OMVs המציגים RBDs רב-ערכיים. מחקרים קיימים המשתמשים ב-OMV להצגת RBD בדרך כלל ממזגים RBD עם OMV כדי להתבטא בחיידקים18. עם זאת, RBD הוא חלבון שמקורו בנגיף, וביטוי פרוקריוטי עשוי להשפיע על פעילותו. כדי לפתור בעיה זו, נעשה שימוש במערכת SpyTag (ST)/SpyCatcher (SC), הנגזרת מ-Streptococcus pyogenes, ליצירת איזופפטיד קוולנטי עם OMV ו-RBD במערכת חיץ קונבנציונלית19. תחום ה-SC בא לידי ביטוי עם ציטוליזין A (ClyA) כחלבון היתוך על ידי קולי Escherichia מהונדס ביולוגית, ו-ST התבטא עם RBD באמצעות מערכת הביטוי התאית HEK293F. OMV-SC ו- RBD-ST היו מעורבים ודוגרו בן לילה. לאחר טיהור על ידי ultracentrifugation או כרומטוגרפיה אי הכללת גודל (SEC), OMV-RBD התקבל.

Protocol

1. בנייה פלסמידית

  1. הכנס את רצף SpyCatcher המקודד DNA (קובץ משלים 1) לתוך פלסמיד pThioHisA-ClyA עמיד לאמפיצילין (ראה טבלת חומרים) בין אתרי BamH I ו- Sal I כדי לבנות את הפלסמיד pThioHisA ClyA-SC בעקבות דו"חשפורסם בעבר 20.
  2. ליגייט את גן ההיתוך SpyTag-RBD-Histag המסונתז (קובץ משלים 1) לפלסמיד pcDNA3.1 (ראה טבלת חומרים) בין אתרי BamH I ו- EcoR I כדי לבנות את הפלסמיד pcDNA3.1 RBD-ST בעקבות דו"חשפורסם בעבר 19.

2. הכנת OMV-SC

  1. בצע המרה של ClyA-SC בהתאם לשלבים הבאים.
    1. הוסיפו 5 μL של תמיסת פלסמיד pThioHisA ClyA-SC (50 ננוגרם/מיקרול) ל-50 מיקרוגרם של זן BL21 מוכשר, נשפו בעדינות והניחו להתקרר על קרח למשך 30 דקות.
    2. מניחים את התמיסה במשך 90 שניות באמבט המים ב 42 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן מיד לשים את הפתרון המעורב על קרח במשך 3 דקות.
    3. הוסיפו 500 μL של מדיום LB לתרחיף החיידקי, ולאחר הערבוב, תרבית ב-220 סל"ד ב-37°C למשך שעה אחת.
    4. צלחת את כל הטרנספורמציה על צלחת אגר LB המכילה אמפיצילין (100 מיקרוגרם / מ"ל, ראה טבלת חומרים) ותרבית לילה ב 37 מעלות צלזיוס.
      הערה: בניסויים מאוחרים יותר, האמפיצילין נשמר באותו ריכוז בתווך. אם לא, זה עלול לגרום לאובדן פלסמידים בחיידקים.
  2. עבור ייצור OMV-SC, בצע את השלבים הבאים.
    1. לבודד מושבה בודדת מהצלחת (שלב 2.1.4.) עד 20 מ"ל של LB (עמיד לאמפיצילין) בינוני ותרבות לילה ב-220 סל"ד ב-37 מעלות צלזיוס.
    2. לחסן את התמיסה החיידקית (משלב 2.2.1.) למדיום 2 ליטר, תרבית ב 220 סל"ד, 37 מעלות צלזיוס במשך 5 שעות עד שלב הצמיחה הלוגריתמית (OD600nm הוא בין 0.6 ל 0.8).
    3. כאשר ה-OD ב-600 ננומטר של תמיסת החיידקים מגיע ל-0.6-0.8, הוסיפו איזופרופיל בטא-D-thiogalactopyranoside (IPTG, ראו טבלת חומרים) כדי שהריכוז הסופי של תמיסת החיידקים יהיה 0.5 mM, ולאחר מכן תרבית לילה ב-220 סל"ד ב-25 מעלות צלזיוס.
  3. בצע טיהור OMV-SC.
    1. צנטריפוגה של תמיסת החיידקים ב-7,000 x g ב-4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
    2. סנן את הסופר-נטנט עם מסנן ממברנה של 0.22 מיקרומטר, ולאחר מכן רכז אותו באמצעות ממברנת אולטרה-סינון של 100 kD או עמודת סיבים חלולים (ראה טבלת חומרים).
    3. סנן את התרכיז דרך מסנן ממברנה של 0.22 מיקרומטר, לאחר מכן צנטריפוגה ב-150,000 x גרם ב-4 מעלות צלזיוס למשך שעתיים באמצעות אולטרה-צנטריפוגה (ראו טבלת חומרים), והשלך את הסופר-נטנט עם פיפטה.
    4. להשעות את המשקעים עם PBS ולאחסן אותו ב -80 מעלות צלזיוס. הפתרון יכול לשמור על יציבות לטווח ארוך ב -80 מעלות צלזיוס.

3. הכנת RBD-ST

  1. בצע טרנספקציה של RBD-ST לפי השלבים הבאים.
    1. בחר מערכת ביטוי אאוקריוטית מתאימה (למשל, HEK293F) ותרבת את התאים במשך הלילה ב-130 סל"ד ב-37 מעלות צלזיוס לאחר ההתאוששות.
    2. הוסף 20 μL של תמיסת תאי HEK293F לתוך מונה התאים האוטומטי (ראה טבלת חומרים), תעד את מספר התאים, התאם את הריכוז ל-1 x 106 תאים למ"ל, ולאחר מכן תרבית את התאים ב-130 סל"ד ב-37 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות.
    3. סנן פלסמיד RBD-ST דרך מסנן ממברנה של 0.22 מיקרומטר, והוסף 300 מיקרוגרם של פלסמידים למדיום תרבית התא (ראה טבלת חומרים) עד שהנפח הסופי הוא 10 מ"ל; לנער במשך 10 שניות.
    4. יש לחמם PEI (1 מ"ג/מ"ל, ראו טבלת חומרים) ל-65°C באמבט המים, לערבב 0.7 מ"ל של PEI עם 9.3 מ"ל של מדיום תרבית תאים, ולנער לסירוגין במשך 10 שניות.
      הערה: אין לנער את התמיסה במרץ. אחרת, הבועות המתקבלות עשויות להשפיע על יעילות הטרנספקציה.
    5. מוסיפים תמיסת פלסמיד לתמיסת PEI, מנערים את התערובת לסירוגין במשך 10 שניות ומדגרים אותה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
    6. מוסיפים את התערובת ל-280 מ"ל של תרבית תאים בינונית ותרבית ב-130 סל"ד ב-37 מעלות צלזיוס למשך 5 ימים.
  2. בצע טיהור RBD-ST.
    1. צנטריפוגה של התאים ב 6,000 x גרם ב 25 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות ולהשתמש פיפטה כדי לאסוף את supernatant.
    2. מלאו את העמודה ב-2 מ"ל של אגרוז Ni-NTA (ראו טבלת חומרים) ושטפו אותה פי 3 עם 3x PBS.
    3. הוסיפו אימידזול (ראו טבלת חומרים) לסופרנטנט של התא כדי להגיע לריכוז הסופי של 20 מ"מ, והעמיסו את הסופרנטנט של התא פי 2.
    4. הוסיפו 3 נפחי עמודות (CV) של PBS המכילים 20 מ"מ של אימידזול לכביסה, ואספו את חלק הכביסה.
    5. גרדיאנט אלוטה עם 3 CV של PBS המכיל ריכוזים נמוכים עד גבוהים (למשל, 0.3 M, 0.4 M, 0.5 M) של imidazole; elute 2x עבור כל ריכוז.
    6. השתמש ב- SDS-PAGE21 כדי לזהות את RBD-ST במעברי ריכוז שונים.

4. ביו-קונגציה וטיהור OMV-RBD

  1. קבעו את ריכוז החלבון בשיטת BCA (ראו טבלת חומרים).
    1. לדלל באופן סדרתי את תמיסת חלבון ה-BSA הסטנדרטית מ-2 מ"ג/מ"ל ל-0.0625 מ"ג/מ"ל, לדלל את ה-OMV-SC המטוהר ואת RBD-ST 10x, ולאחר מכן לערבב פתרונות עבודה של BCA A ו-B (המסופקים בערכת הבדיקה) ביחס של 50:1 (v/v).
    2. מוסיפים תמיסת חלבון מדולל (25 μL/well) ומערבבים עם תמיסה עובדת BCA (200 μL/well); לדגור ב-37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
    3. מדוד את הספיגה (OD) ב-562 ננומטר של כל באר וחשב את ריכוז החלבון מהעקומה הסטנדרטית22.
  2. בצע התאמה ביולוגית של OMV-SC ו- RBD-ST לפי השלבים הבאים.
    1. ערבב OMV-SC ו-RBD-ST ב-PBS ביחס של 40:1 (w/w).
    2. סובבו אנכית כדי למזג את התערובת למשך הלילה ב-15 סל"ד ב-4 מעלות צלזיוס.
      הערה: אנטיגנים שונים עשויים להגיב בפרופורציות שונות. אפשר לנסות יחסי תגובה שונים המבוססים על מאפייני האנטיגן.
  3. ודא את יעילות התגובה.
    1. הכן 10 μL של OMV-SC, RBD-ST ואת מוצר התגובה (שלב 4.2.). הוסף 2.5 μL של מאגר העמסה פי 5 (ראה טבלת חומרים), וחמם את הדגימות ב-100 °C למשך 5 דקות. יש להעמיס את הדגימות לתוך הג'ל (10 μL/well). בצע אלקטרופורזה ב 60 V במשך 20 דקות ולשנות את המצב ל 120 V במשך שעה אחת.
    2. מעבירים את החלבון מהג'ל לממברנות PVDF מערביות (ראו טבלת חומרים) בטמפרטורה של 100 וולט למשך 70 דקות.
    3. הכניסו את הממברנה לאבקת חלב 5% ללא שומן/TBST ונערו במשך שעה אחת. לאחר מכן, יש לשטוף 3x עם TBST במשך 5 דקות לכל כביסה עם טלטול.
    4. הכניסו את הממברנה לנוגדן His-Tag/TBST של 0.1% (ראו טבלת חומרים) ונערו במשך שעה אחת, ולאחר מכן שטפו 3x עם TBST למשך 5 דקות לכל כביסה עם טלטול.
    5. הכניסו את הממברנה לנוגדן IgG1 נגד עכברים (HRP)/TBST (ראו טבלת חומרים) ונערו במשך 40 דקות, ולאחר מכן שטפו 3 פעמים עם TBST למשך 5 דקות לכל כביסה עם טלטול.
    6. מוסיפים תמיסת כימילומינסנציה משופרת (ראו טבלת חומרים) וחושפים את הממברנה.
  4. בצע טיהור של OMV-RBD.
    1. יש לדלל 1 מ"ל של תמיסת OMV-RBD מגיבה ל-10 מ"ל, ולבצע צנטריפוגה של דילול ב-150,000 x גרם ב-4 מעלות צלזיוס למשך שעתיים.
    2. השתמש פיפטה כדי להשליך את supernatant ולהשעות את השאריות עם 10 מ"ל של PBS. צנטריפוגה המתלים ב 150,000 x גרם ב 4 °C במשך 2 שעות.
    3. השליכו את הסופר-נטנט והשעו את השאריות עם 1 מ"ל של PBS.
      הערה: אם המסיסות של האנטיגן נמוכה בהרבה, ניתן להשיג את אותו אפקט הפרדה על ידי כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל19.

5. אפיון

  1. בצע פיזור אור דינמי (DLS).
    1. דלל את הדגימות לריכוז של 100 מיקרוגרם/מ"ל והוסף 1 מ"ל דגימה לתא הדגימה.
    2. בחר "גודל" עבור "סוג מדידה", "חלבון" עבור "חומר מדגם", "מים" עבור "פיזור", "25 °C" עבור "טמפרטורה", ולאחר מכן טען דגימות ומדוד באופן אוטומטי23.
  2. צלם תמונות באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים (TEM).
    1. יש לדלל את הדגימות ל-100 מיקרוגרם/מ"ל. קח רשת נחושת של 200 רשת, הוסף לה 20 μL של דגימה, ואפשר לה להיספג במשך 10 דקות.
    2. השתמש בנייר סינון כדי לפתות את התמיסה, הוסף 20 μL של 3% אורניל אצטט לסרט התמיכה, והכתים במשך 30 שניות.
    3. יש לפות את האורניל אצטט ולייבש את הסרט באופן טבעי בטמפרטורת החדר למשך שעה.
    4. טען את הדגימות למערכת TEM (ראה טבלת חומרים) ולכוד תמונות ב- 80 kV.

תוצאות

תרשים הזרימה של פרוטוקול זה מוצג באיור 1. פרוטוקול זה יכול להיות גישה כללית לשימוש ב-OMVs כפלטפורמת חיסונים; צריך רק לבחור את מערכות הביטוי המתאימות על סמך סוג האנטיגנים.

איור 2 מספק סכימת תכנון פלסמידית אפשרית. הגן SC מחובר לגן ClyA באמצעות מקשר גמ...

Discussion

כדי ליצור פלטפורמת חיסון ננו-חלקיקים "Plug-and-Display", ClyA שהתמזגה ב-SC באה לידי ביטוי בזני BL21(DE3), שהוא אחד המודלים הנפוצים ביותר לייצור חלבונים רקומביננטיים בגלל יתרונותיו בביטוי חלבונים24, כך שיהיה מספיק מקטע SC המוצג על פני השטח של ה-OMVs במהלך תהליך התפשטות החיידקים. במקביל, אנטיגן מטר...

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי תוכנית המפתח של קרן מדעי הטבע של צ'ונגצ'ינג (לא. cstc2020jcyj-zdxmX0027) ופרויקט הקרן הלאומית הסינית למדעי הטבע (מס' 31670936, 82041045).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Ampicillin sodiumSangon BiotechA610028
Automated cell counterCountstarBioTech
BCA protein quantification Kitcwbiocw0014s
ChemiDoc Touching Imaging SystemBio-rad
Danamic Light ScatteringMalvernZetasizer Nano S90
Electrophoresis apparatusCavoyPower BV
EZ-Buffers H 10X TBST BufferSangon BiotechC520009
Goat pAb to mouse IgG1Abcamab97240
High speed freezing centrifugeBioridgeH2500R
His-Tag mouse mAbCell signaling technology2366s
ImidazoleSangon BiotechA600277
Isopropyl beta-D-thiogalactopyranosideSangon BiotechA600118
Ni-NTA His-Bind SuperflowQiagen70691
Non-fat powdered milkSangon BiotechA600669
OPM-293 cell culture mediumOpm biosciences81075-001
pcDNA3.1 RBD-ST plasmidWuhan genecreat biological techenology
Phosphate buffer salineZSGB-bioZLI-9061
Polyethylenimine LinearPolysciences23966-1
Prestained protein ladderThermo26616
pThioHisA ClyA-SC plasmidWuhan genecreat biological techenology
PVDF Western Blotting MembranesRoche03010040001
Quixstand benchtop systems (100 kD hollow fiber column)GE healthcare
SDS-PAGE loading buffer (5x)BeyotimeP0015
Sodium chlorideSangon BiotechA100241
Supersignal west pico PLUS (enhanced chemiluminescence solution)Thermo34577
Suspension instrumentLife TechnologyHula Mixer
Transmission Electron MicroscopeHitachiHT7800
TryptoneOxoidLP0042B
UltracentrifugeBeckman coulterXPN-100
Ultraviolet spectrophotometerHitachiU-3900
Yeast extractSangon BiotechA610961

References

  1. Li, M., et al. Bacterial outer membrane vesicles as a platform for biomedical applications: An update. Journal of Controlled Release. 323, 253-268 (2020).
  2. Micoli, F., MacLennan, C. A. Outer membrane vesicle vaccines. Seminars in Immunology. 50, 101433 (2020).
  3. Toyofuku, M., Nomura, N., Eberl, L. Types and origins of bacterial membrane vesicles. Nature Reviews Microbiology. 17 (1), 13-24 (2019).
  4. Sartorio, M. G., Pardue, E. J., Feldman, M. F., Haurat, M. F. Bacterial outer membrane vesicles: From discovery to applications. Annual Review of Microbiology. 75, 609-630 (2021).
  5. Kaparakis-Liaskos, M., Ferrero, R. L. Immune modulation by bacterial outer membrane vesicles. Nature Reviews Immunology. 15 (6), 375-387 (2015).
  6. Petousis-Harris, H., Radcliff, F. J. Exploitation of Neisseria meningitidis group B OMV vaccines against N-gonorrhoeae to inform the development and deployment of effective gonorrhea vaccines. Frontiers in Immunology. 10, 683 (2019).
  7. Gnopo, Y. M. D., Watkins, H. C., Stevenson, T. C., DeLisa, M. P., Putnam, D. Designer outer membrane vesicles as immunomodulatory systems - Reprogramming bacteria for vaccine delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 114, 132-142 (2017).
  8. Zhang, Y. X., Fang, Z. Y., Li, R. Z., Huang, X. T., Liu, Q. Design of outer membrane vesicles as cancer vaccines: A new toolkit for cancer therapy. Cancers. 11 (9), 1314 (2019).
  9. Berleman, J., Auer, M. The role of bacterial outer membrane vesicles for intra- and interspecies delivery. Environmental Microbiology. 15 (2), 347-354 (2013).
  10. Huang, W. L., Meng, L. X., Chen, Y., Dong, Z. Q., Peng, Q. Bacterial outer membrane vesicles as potential biological nanomaterials for antibacterial therapy. Acta Biomaterialia. 140, 102-115 (2022).
  11. Hoffmann, M., et al. SARS-CoV-2 cell entry depends on ACE2 and TMPRSS2 and is blocked by a clinically proven protease inhibitor. Cell. 181 (2), 271-280 (2020).
  12. Robbiani, D. F., et al. Convergent antibody responses to SARS-CoV-2 in convalescent individuals. Nature. 584 (7821), 437-442 (2020).
  13. Wang, M. Y., et al. SARS-CoV-2: Structure, Biology, and Structure-Based Therapeutics Development. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 587269 (2020).
  14. Yang, S., et al. Safety and immunogenicity of a recombinant tandem-repeat dimeric RBD-based protein subunit vaccine (ZF2001) against COVID-19 in adults: Two randomised, double-blind, placebo-controlled, phase 1 and 2 trials. The Lancet Infectious Disease. 21 (8), 1107-1119 (2021).
  15. Wang, Z., et al. mRNA vaccine-elicited antibodies to SARS-CoV-2 and circulating variants. Nature. 592 (7855), 616-622 (2021).
  16. Amanat, F., et al. SARS-CoV-2 mRNA vaccination induces functionally diverse antibodies to NTD, RBD, and S2. Cell. 184 (15), 3936-3948 (2021).
  17. Tan, H. X., et al. Immunogenicity of prime-boost protein subunit vaccine strategies against SARS-CoV-2 in mice and macaques. Nature Communication. 12 (1), 1403 (2021).
  18. Thapa, H. B., Mueller, A. M., Camilli, A., Schild, S. An intranasal vaccine based on outer membrane vesicles against SARS-CoV-2. Frontiers in Microbiology. 12, 752739 (2021).
  19. Ma, X., et al. Nanoparticle vaccines based on the receptor binding domain (RBD) and heptad repeat (HR) of SARS-CoV-2 elicit robust protective immune responses. Immunity. 53 (6), 1315-1330 (2020).
  20. Yang, Z., et al. RBD-modified bacterial vesicles elicited potential protective immunity against SARS-CoV-2. Nano Letters. 21 (14), 5920-5930 (2021).
  21. Rhinesmith, T., Killinger, B. A., Sharma, A., Moszczynska, A. Multimer-PAGE: A method for capturing and resolving protein complexes in biological samples. Journal of Visualized Experiments. (123), e55341 (2017).
  22. Arslan, A., et al. Determining total protein and bioactive protein concentrations in bovine colostrum. Journal of Visualized Experiments. (178), e63001 (2021).
  23. Alves, N. J., Turner, K. B., Walper, S. A. Directed protein packaging within outer membrane vesicles from Escherichia coli: Design, production and purification. Journal of Visualized Experiments. (117), e54458 (2016).
  24. Kim, S., et al. Genomic and transcriptomic landscape of Escherichia coli BL21(DE3). Nucleic Acids Research. 45 (9), 5285-5293 (2017).
  25. Daleke-Schermerhorn, M. H., et al. Decoration of outer membrane vesicles with multiple antigens by using an autotransporter approach. Applied and Environmental Microbiology. 80 (18), 5854-5865 (2014).
  26. Kuipers, K., et al. Salmonella outer membrane vesicles displaying high densities of pneumococcal antigen at the surface offer protection against colonization. Vaccine. 33 (17), 2022-2029 (2015).
  27. Veggiani, G., et al. Programmable polyproteams built using twin peptide superglues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (5), 1202-1207 (2016).
  28. Saunders, K. O., et al. Neutralizing antibody vaccine for pandemic and pre-emergent coronaviruses. Nature. 594, 553-559 (2021).
  29. van Saparoea, H. B. V., Houben, D., Kuijl, C., Luirink, J., Jong, W. S. P. Combining protein ligation systems to expand the functionality of semi-synthetic outer membrane vesicle nanoparticles. Frontiers in Microbiology. 11, 890 (2020).
  30. Needham, B. D., et al. Modulating the innate immune response by combinatorial engineering of endotoxin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (4), 1464-1469 (2013).
  31. Zanella, I., et al. Proteome-minimized outer membrane vesicles from Escherichia coli as a generalized vaccine platform. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (4), 12066 (2021).
  32. Wang, J. L., et al. Truncating the structure of lipopolysaccharide in Escherichia coli can effectively improve poly-3-hydroxybutyrate production. ACS Synthetic Biology. 9 (5), 1201-1215 (2020).
  33. Liu, Q., et al. Outer membrane vesicles from flagellin-deficient Salmonella enterica serovar Typhimurium induce cross-reactive immunity and provide cross-protection against heterologous Salmonella challenge. Scientific Reports. 6, 34776 (2016).
  34. Balhuizen, M. D., Veldhuizen, E. J. A., Haagsman, H. P. Outer membrane vesicle induction and isolation for vaccine development. Frontiers in Microbiology. 12, 629090 (2021).
  35. Hua, L., et al. A novel immunomodulator delivery platform based on bacterial biomimetic vesicles for enhanced antitumor immunity. Advanced Materials. 33 (43), 2103923 (2021).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

185

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved