תרבית ראשונית של תאי אפיתל פיגמנט רשתית חזירית

Summary

כאן מוצגת שיטה קלה למעקב לתרבית תאי אפיתל פיגמנט רשתית חזיריים ראשוניים במבחנה .

Abstract

אפיתל פיגמנט הרשתית (RPE) הוא חד-שכבתי של תאי אפיתל פיגמנטיים מקוטבים, הממוקמים בין הכורואיד לנוירוארטינה ברשתית. פונקציות מרובות, כולל פאגוציטוזיס, הובלת חומרים מזינים / מטבוליטים, מטבוליזם של ויטמין A וכו ', מבוצעות על ידי RPE על בסיס יומי. תאי RPE הם תאי אפיתל ממוינים עם יכולת התחדשות מועטה או ללא יכולת התחדשות. אובדן תאי RPE גורם למחלות עיניים מרובות המובילות לליקוי ראייה, כגון ניוון מקולרי הקשור לגיל. לכן, הקמת מודל תרבית במבחנה של תאי RPE ראשוניים, הדומה יותר ל-RPE in vivo מאשר לקווי תאים, היא קריטית למחקרים האופייניים והמכניסטיים של תאי RPE. בהתחשב בעובדה שמקור גלגלי העיניים האנושיים מוגבל, אנו יוצרים פרוטוקול לתרבית תאי RPE חזיריים ראשוניים. על ידי שימוש בפרוטוקול זה, ניתן לנתק בקלות תאי RPE מגלגלי עיניים חזיריים בוגרים. לאחר מכן, תאים מנותקים אלה מתחברים לתרביות/תוספות, מתרבים ליצירת מונו-שכבה מתמזגת, ומבססים מחדש במהירות תכונות מרכזיות של רקמת אפיתל in vivo תוך 2 שבועות. על ידי qRT-PCR, הוכח כי תאי RPE חזיריים ראשוניים מבטאים גנים חתימה מרובים ברמות דומות לרקמת RPE מקורית, בעוד שהביטויים של רוב הגנים הללו הולכים לאיבוד/מופחתים מאוד בתאים דמויי RPE אנושיים, ARPE-19. יתר על כן, צביעת האימונופלואורסצנציה מראה את התפלגות הצומת ההדוק, קוטביות הרקמה וחלבוני השלד, כמו גם את נוכחותו של RPE65, איזומראז חיוני לחילוף החומרים של ויטמין A, בתאים ראשוניים בתרבית. בסך הכל, פיתחנו גישה קלה למעקב לתרבית תאי RPE חזיריים ראשוניים עם טוהר גבוה ותכונות RPE מקוריות, שיכולה לשמש מודל טוב להבנת הפיזיולוגיה של RPE, לחקר רעילות תאים ולהקלה על בדיקות סמים.

Introduction

אפיתל פיגמנט הרשתית (RPE) ממוקם בין פוטורצפטורים וכוריוקפילריס בשכבה החיצונית של הרשתית¹ עם פונקציות מרובות, כולל יצירת מחסום הדם-רשתית, הובלה והחלפה של חומרים מזינים ומטבוליטים ברשתית, מיחזור ויטמין A כדי לשמור על מחזור ראייה תקין, ופאגוציטוזה ופינוי של מקטעים חיצוניים של פוטורצפטור (POSs)^2,3 . מכיוון שנקודות תורפה דורשות התחדשות עצמית מתמדת כדי ליצור ראייה, תאי ה-RPE צריכים לבלוע ברציפות נקודות מכירה מנותקות כדי לשמור על הומאוסטזיס רשתית⁴. לכן, תפקוד לקוי של RPE גורם למחלות עיניים מסנוורות רבות, כגון ניוון מקולרי הקשור לגיל (AMD)⁴, רטיניטיס פיגמנטוזה (RP)⁵, אמורוזיס מולד לבר⁶, רטינופתיה סוכרתית⁷ וכו '. עד כה, הפתוגנזה המדויקת של רוב המחלות הללו נותרה חמקמקה. כתוצאה מכך, תרבית תאי RPE הוקמה כדי לחקור ביולוגיה של תאי RPE, שינויים פתולוגיים ומנגנונים בסיסיים.

כמודל הפשוט ביותר לחקר הביולוגיה של התא, התרבית של תאי RPE החלה כבר בשנות^ה-20 של המאה ה-20. למרות ש-ARPE-19 נמצא בשימוש נרחב כתאי RPE, אובדן פיגמנטציה, מורפולוגיה מרוצפת, ובמיוחד תפקודי המחסום בקו תאים זה מעלים חששות רבים⁹. לשם השוואה, התרבית של תאי RPE אנושיים ראשוניים מציעה תרחיש מציאותי יותר למחקרים פיזיולוגיים ופתולוגיים⁹. עם זאת, הזמינות המוגבלת יחסית מגבילה את השימוש בהם וסוגיות אתיות קיימות תמיד. בנוסף, מספר קבוצות השתמשו במודלים של עכברים כדי לתרבת תאי RPE. עם זאת, גודל עין העכבר הוא קטן, ותרבות אחת בדרך כלל דורש עכברים רבים, וזה לא נוח⁹. לאחרונה, מדענים פיתחו שיטות חדשות לשימוש בתאי גזע עובריים אנושיים או בתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים כדי להפיק תאי RPE. למרות שלטכניקה זו יש פוטנציאל מיוחד לטיפול בהפרעות RPE תורשתיות, היא גוזלת זמן ובדרך כלל דורשת מספר חודשים כדי ליצור תאי RPE בוגרים¹⁰. כדי להתגבר על בעיות אלה, כאן אנו מציגים פרוטוקול קל למעקב כדי לבודד ולתרבת תאי RPE בטוהר גבוה במעבדה באופן שגרתי. בתנאי תרבית מתאימים, תאים אלה יכולים להציג פונקציות RPE אופייניות ולהציג מורפולוגיות RPE טיפוסיות. לכן, שיטת תרבות זו יכולה לספק מודל טוב להבנת הפיזיולוגיה של RPE, לחקור ציטוטוקסיות, לחקור מנגנונים פתולוגיים של מחלות עיניים קשורות ולבצע בדיקות סמים.

Protocol

השימוש בחיות ניסוי עמד בתקנות האגודה למחקר בראייה וברפואת עיניים (ARVO) ואושר על ידי ועדת האתיקה לניהול ניסויים בבעלי חיים באוניברסיטת שיאמן.

1. הכנת מכשירים כירורגיים ניסיוניים, אנזים לעיכול רקמות וחיץ תרביות תאים

1. הכינו את המכשירים הכירורגיים הניסיוניים, על ידי ניקוי ואוטוקלאבינג של שני זוגות מספריים ומלקחיים כירורגיים עיניים יום לפני נתיחת גלגל העין, ולאחר מכן ייבוש הקופסה עם מכשירי ניתוח בתנור פרוטוקול כללי בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
2. הכנת מדיה תרבותית.
   1. יש להכין תוסף DMEM/Basic עם סרום בקר עוברי של 10% (v/v), 2 מ"מ L-גלוטמין ו-1% (v/v) פניצילין (100 U/mL) וסטרפטומיצין (100 U/mL).
   2. יש להכין מדיית DMEM/F12 בתוספת FBS של 1% (v/v) ופניצילין 1% (v/v) (100 U/mL) וסטרפטומיצין (100 U/mL).
   3. יש להכין את MEM-Nic 11, על ידי תוספת MEM אלפא עם 2 mM L-גלוטמין, 1% FBS, 1% (v/v) פניצילין (100 U/mL) וסטרפטומיצין (100 U/mL), 0.1 mM NEAA, 1% (v/v) תוסף^N1, טאורין (0.25 מ"ג/מ"ל), הידרוקורטיזון (20 ננוגרם/מ"ל), טריאודו-תירונין (0.013 ננוגרם/מ"ל) ו-10 mM ניקוטין-אמיד.
      הערה: כדי לשפר את הכדאיות וההתרבות של התאים, ניתן להגדיל את אחוז ה-FBS ל-20% כדי לנטרל אנזימי עיכול ולזרוע את התאים המנותקים. עבור תרבית תאים ארוכת טווח, ניתן להוריד את אחוז ה-FBS ל-1%¹².
3. במהלך הניסוי הפשרה של אנזים עיכול הרקמות אליקוט (0.25% (w/v) תמיסת טריפסין/EDTA בתוספת 0.91 mM EDTA, להלן תמיסת טריפסין/EDTA) במהלך הניסוי.
   הערה: יש להשתמש בתמיסת טריפסין/EDTA טרייה בכל פעם כדי להשיג תוצאות מיטביות. Aliquot 10 מ"ל של תמיסת טריפסין/EDTA טרייה לכל צינור צנטריפוגה סטרילי של 15 מ"ל והקפאת האליקוטים במקרר בטמפרטורה של -20°C עד לשימוש.
4. פתרון דיסקציה.
   1. יש לעקר 1x פוספט מלח מופרך (PBS) (pH 7.2) בתוספת 2% (v/v) פניצילין (100 U/mL) וסטרפטומיצין (100 U/mL) על ידי סינון התמיסה דרך יחידת מסנן מזרק 0.22 מיקרומטר.
5. מצפים את צלחות התרבית ותוספות טרנסוול.
   1. לשטוף את הבארות ואת תוספות transwell עם 1x PBS. הסר את PBS מבארות ו transwells עם פיפטה, ולאחר מכן להוסיף 1 מ"ל של 1x PBS טרי לתא התחתון ו 600 μL של 10 מיקרוגרם / מ"ל של תמיסת laminin לתא העליון.
   2. לדגום את הצלחות/טרנסוול באינקובטור תרבית התאים למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO₂. הסר את תמיסת הלמינין מהתא העליון ושטוף עם 1 מ"ל של PBS קר 1x פעמיים לפני זריעת התאים.

2. דיסקציה של תאי RPE של גלגל העין חזירי

1. הכנת הכלים.
   1. נקו את מכסה המנוע עם 75% אתנול ואור UV. הכן שלושה צינורות צנטריפוגה סטריליים של 50 מ"ל המכילים ~ 25 מ"ל של 75% אתנול, שלושה צינורות צנטריפוגה סטריליים של 50 מ"ל המכילים ~ 25 מ"ל של PBS 1x, ושלושה כלי תרבית תאים סטריליים בגודל 10 ס"מ המכילים ~ 15 מ"ל של PBS אחד.
      הערה: הגדרות אלה משמשות בדרך כלל לניתוח ארבעה גלגלי עיניים חזיריים. אנא הרחב כאשר נעשה שימוש בגלגלי עיניים נוספים. כדי לשפר את כדאיות התא, יש ליצור מראש מאגר PBS 1x על הקרח למשך 30 דקות לפחות. גם 75% אתנול וגם אור UV נחוצים כדי להבטיח שמכשירים ותאים ניסיוניים אינם מזוהמים. הדליקו את מנורת ה-UV מראש כדי לעקר את כל שולחן הניתוחים למשך 15 דקות לפחות.
2. נקו את גלגלי העיניים החזיריים.
   1. השיגו גלגלי עיניים טריים מבית מטבחיים והשאירו אותם על הקרח עד לנתיחה. השרו ארבעה גלגלי עיניים חזיריים לתוך ~ 15 מ"ל של 75% אתנול בצלחת פטרי בגודל 10 ס"מ והשתמשו בזוג מספריים ומלקחיים כדי לנתק את כל שאריות רקמות החיבור והשרירים.
      הערה: יש להסיר כמה שיותר רקמות מחוץ לסקלרה כדי להפחית את הזיהום. אין לחתוך את עצב הראייה בשלב זה כדי להקל על העברת גלגלי עיניים במהלך deontamination ו לשטוף שלב. לאחר שלב זה, כל ההליכים צריכים להתבצע במכסה מנוע זרימה למינרית.
3. לנטרל את גלגלי העיניים החזיריים על ידי השריה ושטיפה של ארבעה גלגלי עיניים חזיריים בשלושה צינורות צנטריפוגה סטריליים של 50 מ"ל מלאים ב-75% אתנול באופן רציף; כל גלגל עיניים טבול לפחות 5 דקות בכל צינור. לאחר מכן, לשטוף את גלגלי העיניים חזיר בשלושה צינורות צנטריפוגה סטרילית 50 מ"ל מלא 1x PBS באופן רציף; שטפו כל גלגל עיניים במשך 5 דקות לפחות בכל צינור (איור 1A). הפוך את הצינורות כל דקה כדי לשטוף את גלגלי העיניים ביסודיות.
4. דיסקציה של גלגלי עיניים חזיריים.
   1. העבירו את ארבעת גלגלי העיניים החזיריים לתוך צלחת תרבית תאים סטרילית באורך 10 ס"מ המכילה PBS אחד. חתוך שוב את המשטח החיצוני של כל גלגל עיניים כדי להסיר את עצב הראייה ואת הפסולת הקטנה (איור 1B). השתמשו במספריים כדי לבצע חתך קטן בצומת של הלימבוס והסקלרה, ולאחר מכן הסירו את הקרנית, הקשתית, העדשה, הגוף הזגוגי והרשתית העצבית (למבנים מפורטים של הרקמות האלה, ראו איור 1).
   2. העבירו את קומפלקס RPE-כורואיד-סקלרה לתוך צלחת תרבית תאים חדשה בקוטר 10 ס"מ ובצעו ארבעה חיתוכים כדי לנפח את העין בצורת תלתן בעל ארבעה עלים (איור 1C).
5. בצעו עיכול תמיסת טריפסין/EDTA על ידי הכנסת ארבעת קומפלקסי RPE-כורואיד-סקלרה לצלחת חדשה באורך 10 ס"מ. יוצקים 20 מ"ל של תמיסת טריפסין/EDTA טרייה כדי למזג את קומפלקסי RPE-כורואיד-סקלרה ומכניסים את המנה לחממה של תרבית תאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך ~30 דקות.
   הערה: השתמש בתמיסת טריפסין/EDTA טרייה כדי לנתק את תאי ה-RPE. שלוט בזהירות בזמן העיכול של תמיסת טריפסין/EDTA, שכן זמן דגירה ארוך יותר (יותר מ-30 דקות) עלול להגביר את הזיהום של סוגים אחרים של תאים.

3. בידוד ותרבית של תאי RPE חזיריים של גלגל העין

1. דיסוציאציה של RPE.
   1. הוציאו את המנה מהאינקובטור לאחר 30 דקות של דגירה עם תמיסת טריפסין/EDTA והוסיפו 20 מ"ל של מדיית תרבית שחוממה מראש (עם 10% FBS) למנה כדי לנטרל את תמיסת טריפסין/EDTA.
      הערה: בשלב זה, נעשה שימוש במדיה DMEM/Basic בלבד. כאשר תאים מגיעים למפגש, ניתן להשתמש בשלוש מדיות תרבית בהתאם לתנאי הניסוי: DMEM/מדיה בסיסית, מדיה DMEM/F12 ומדיה MEM-Nic.
   2. השתמש פיפטה העברה של 5 מ"ל כדי לנתק את תאי ה- RPE על ידי פיפטינג עדין מספר פעמים. לאסוף מתלי תאים לתוך צינורות צנטריפוגה 15 מ"ל. השתמש בעוד 10 מ"ל של מדיית תרבית טרייה (10% FBS) כדי לשטוף את קומפלקסי RPE-choroid-sclera על המנה על ידי פיפטינג עדין כדי להשיג כמה שיותר תאי RPE.
      הערה: אין לבצע טריטורציה נמרצת מדי של התאים. הקפידו למלא ולרוקן את הפיפטה בקצב של כ-3 מ"ל/שנייה. הימנע מבעבע את השעיית התא.
2. אסוף תאי RPE על ידי צנטריפוגה של הצינורות ב 200 x g במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. שאפו את הסופר-נאטנט באמצעות פיפטה והוסיפו עוד 5 מ"ל של מדיית תרבית (10% FBS) כדי להשעות את התאים והצנטריפוגה ב-200 x גרם למשך 5 דקות נוספות. לנטרל את הסופר-נאטנט ולהחיות את התאים עם 12 מ"ל של מדיה תרבית.
   הערה: בעת שאיפת הסופר-נטנט, יש להשאיר כ-1 מ"ל של מדיה כדי למנוע שבירה של גושי תאים.
3. זריעת תאי RPE.
   1. זרעים ~ 1-2 x 10⁵ תאים / באר לתוך 12-באר צלחות תרבית או תוספות transwell. בדרך כלל, כ 1.5 x 10 6^{תאים RPE} מתקבלים ארבעה גלגלי עיניים חזיר. יש לשנות את מדיית התרבית כל יומיים ולהפחית את ריכוז הסרום ל-1% כאשר התאים מכסים באופן מלא את פני הבארות/התוספות.
      הערה: אין להזיז את צלחת תרבית התאים לעתים קרובות מדי לפני שהתאים מתחברים לצלחת התרבית/התוספות.
4. שנה את מדיית התרבית כל יומיים עד שהתאים נקטפים.
   הערה: ניתן להפחית את ריכוז ה-FBS לאחר שהתאים מגיעים למפגש, וניתן לתרבת תאים למשך עד מספר חודשים כדי לאפשר התמיינות והבשלה מלאות.

4. אפיון תאי RPE חזיריים ראשוניים

1. תרבית את התאים במפגש במשך 1 או 2 שבועות, ולאחר מכן לקצור את התאים לניתוח נוסף.
2. קציר תאים לניתוח PCR כמותי בזמן אמת (qRT-PCR).
   1. הסר את מדיה תרבית, לשטוף את התאים עם 1 מ"ל של PBS קר 1x, ולאחר מכן להוסיף 500 μL של מיצוי RNA פתרון לתוך כל באר כדי לאסוף ליזאט התא מ 1 x 10^{6 תאים} .
   2. חלץ mRNA¹³; כ-4 מיקרוגרם של RNA מופקים מכל דגימה. השתמש 100 ng של mRNA כדי לבצע שעתוק הפוך¹⁴; לדלל את ה-cDNA פי 40 לצורך ניתוח PCR כמותי בזמן אמת. פריימרים מפורטים בטבלה 1.
3. קצירת תאים לצביעת אימונופלואורסצנציה.
   1. הסר את מדיית התרבית, שטף את התאים עם 1 מ"ל של PBS 1x קר, ולאחר מכן הוסף 500 μL של 4% (w / v) paraformaldehyde ב 1x PBS כדי לתקן את התאים (כ 1 x 10^{6 תאים} / טוב) במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, שטפו את התאים עם 1x PBS פעמיים ובצעו צביעה אימונופלואורסצנטית עם נוגדנים ראשוניים (1:100 ב-PBS 1x בתוספת 1% (w/v) אלבומין בסרום בקר) ב-4 מעלות צלזיוס למשך הלילה ונוגדנים משניים (1:200 ב-1x PBS בתוספת 1% (w/v) אלבומין בסרום בקר) בטמפרטורת החדר למשך שעתיים על פי פרוטוקולים מקוונים¹⁵.
   2. תמונות האימונופלואורסצנציה נרכשות על ידי מיקרוסקופ קונפוקלי בעקבות המדריך המקוון¹⁶.
4. קציר תאים לניתוח כתם מערבי.
   1. הסר את מדיית התרבית, שטף את התאים עם PBS 1x קר פעמיים, ולאחר מכן הוסף 80 μL של חיץ RIPA (עם מעכב פרוטאז 1x) לתוך כל באר והשתמש מגרדי תאים כדי לגרד כ 1 x 10^{6 תאים} מן הכלים / תוספות.
   2. לאסוף את התא lysate מכל באר / להכניס לתוך צינור microcentrifuge 1.5 מ"ל. מרתיחים את התא ליזטים במשך 10 דקות ולאחר מכן למדוד את ריכוזי החלבון באמצעות ערכות BCA; ריכוז החלבון בכל דגימה הוא כ-2 מ"ג/מ"ל. השתמש ב-25 מיקרוגרם חלבונים מכל דגימה לניתוח כתמים מערביים על פי פרוטוקולים מקוונים¹⁷.
   3. עבור כתם מערבי, דגירה של הממברנות ב-5 מ"ל של תמיסת נוגדנים ראשונית (דילול של 1:1,000 נוגדנים ראשוניים בתמיסת TBST אחת בתוספת 5% (w/v) אלבומין בסרום בקר) בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה על שייקר רב-תכליתי מסתובב.
   4. לאחר מכן, דגירה על הממברנה עם כ-15 מ"ל של תמיסת נוגדנים משנית נגד ארנב או נגד עכבר (דילול של 1:5,000 נוגדנים משניים בתמיסת TBST אחת בתוספת חלב 5% (w/v) ללא שומן) בטמפרטורת החדר למשך שעתיים על שייקר מסלולי, על פי מקור הנוגדן העיקרי המשמש.
5. מדידת התנגדות טרנס-אפיתליאלית (TER).
   1. לשטוף את האלקטרודות chopstick עם 70% אתנול סטרילי 1x PBS באופן רציף. לאחר מכן הנח את הקצה הקצר יותר של האלקטרודה בתא העליון ואת הקצה הארוך יותר בתא התחתון של תוספות הטרנסוול ולחץ על הכפתור במד המתח האפיתל עבור המדידות. רשום את מדידות ה- TER של כל באר במשולשים.

תוצאות

תאי ה-RPE החזיריים העיקריים (pRPE) גודלו בתרבית במדיה DMEM/Basic עם 10% FBS, והמורפולוגיה של התאים תחת מיקרוסקופ אור צולמה ביומיים (איור 2A), 6 ימים (איור 2B) ו-10 ימים (איור 2C) לאחר הזריעה. לאחר 1 שבועות, נצפתה שכבה חד-שכבתית משולבת של תאי pRPE פיגמנטיים עם מורפול...

Discussion

כאן תואר פרוטוקול מפורט וממוטב לבידוד, תרבית ואפיון של תאי RPE מגלגלי עיניים חזיריים, המייצר מודל טוב לאפיון חוץ גופי של תאי RPE ומחקרי הפרעות הקשורות ל-RPE. שיטות לבידוד ה-RPE מעיני אדם, עכבר וחולדה תוארו בעבר^23,24,25. עם זאת, קשה להשיג גלגלי עי...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
ARPE-19 cells	CCTCC	GDC0323
Bovine serum albumin	Yeasen	36101ES60
Confocal microscopy	Zeiss	LSM 880 with Airyscan
ChemiDoc Touch	Bio-Rad	1708370
Cell scraper	Sangon	F619301
10 cm culture dish	NEST	121621EH01
12-well culture plate	NEST	29821075P
DMEM F12 Medium	Gibco	C11330500BT
DMEM basic Medium	Gibco	C11995500BT
EVOM2	World Precision Instruments	EVOM2	For TER measurement
Fetal bovine serum	ExCell Bio	FSP500
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	ThermoFisher Scientific	A-11034
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594	ThermoFisher Scientific	A-11012
Goat anti Mouse IgG (H/L):HRP	Bio-Rad	0300-0108P
Goat anti Rabbit IgG (H/L):HRP	Bio-Rad	5196-2504
hydrocortisone	MCE	HY-N0583/CS-2226
Hoechst 33342 solution (20 mM)	ThermoFisher Scientific	62249
LightCycler 96 Instrument	Roche	5815916001
Liothyronine	MCE	HY-A0070A/CS-4141
laminin	Sigma-Aldrich	L2020-1MG
MEM(1X)+GlutaMAX Medium	Gibco	10566-016
MEM NEAA(100X)	Gibco	11140-050
Millex-GP syringe filter unit	Millipore	SLGPR33RB
N1	Sigma-Aldrich	SLCF4683
NcmECL Ultra	New Cell&Molecular Biotech	P10300
Non-fat Powdered Milk	Solarbio	D8340
Nicotinamide	SparkJade	SJ-MV0061
Na+-K+ ATPase antibody	Abcam	ab76020	Recognize both human and porcine proteins
PAGE Gel Fast Preparation Kit(10%)	Epizyme	PG112
primary Human RPE cells	-	-	Generous gift from Shoubi Wang lab
Pierce BCA Protein Assay Kit	ThermoFisher Scientific	23225
Prism	GraphPad by Dotmatics	version 8.0
Protease Inhibitor Cocktails	APExBIO	K1024
PRE65 antibody	Proteintech	17939-1-AP	Recognize both human and porcine proteins
PEDF antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-390172	Recognize both human and porcine proteins
100 x penicillin/streptomycin	Biological Industries	03-031-1BCS
Phosphate buffered saline (PBS)	RARBIO	RA-9005
ReverTra Ace qPCR RT Master Mix	Toyobo	FSQ-201
RIPA buffer	ThermoFisher Scientific	89900
15 mL sterile centrifuge tubes	NEST	601052
50 mL sterile centrifuge tubes	NEST	602052
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco	25200-056
Taurine	Damas-beta	107-35-7
Trizol	Thermo-Fisher	15596026	RNA extraction solution
TB Green Fast qPCR Mix	Takara	RR430A
12-well transwell inserts	Labselect	14212
VEGF antibody	Proteintech	19003-1-AP	Recognize both human and porcine proteins
VEGF ELISA kit	Novusbio	VAL106
ZO-1 antibody	ABclonal	A0659	Recognize both human and porcine proteins