JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

במאמר זה אנו מתארים טכניקה פשוטה המיועדת לייצור יעיל של עכברים מהונדסים גנטית הנקראת CRISPR RNP Electroporation of Zygotes (CRISPR-EZ). שיטה זו מספקת ריאגנטים לעריכה על ידי אלקטרופורציה לעוברים ביעילות המתקרבת ל-100%. פרוטוקול זה יעיל עבור מוטציות נקודתיות, החדרות גנומיות קטנות ומחיקות בעוברי יונקים.

Abstract

עם יעילות, דיוק וקלות יוצאי דופן, מערכת CRISPR/Cas9 שיפרה באופן משמעותי את עריכת הגנום בתרביות תאים ובניסויים בחיות מעבדה. בעת יצירת מודלים של בעלי חיים, אלקטרופורציה של זיגוטות מציעה יעילות גבוהה יותר, פשטות, עלות ותפוקה, כחלופה לשיטת תקן הזהב של מיקרו-הזרקה. אלקטרופורציה היא גם עדינה יותר, עם כדאיות גבוהה יותר, ומספקת באופן אמין Cas9/Single guide RNA (sgRNA) ribonucleoproteins (RNPs) לתוך הזיגוטה של זני עכברי מעבדה נפוצים (למשל, C57BL/6J ו-C57BL/6N) שמתקרבים ל-100% יעילות מסירה. טכניקה זו מאפשרת החדרה/מחיקה (indels) מוטציות, מוטציות נקודתיות, מחיקה של גנים שלמים או אקסונים, והחדרות קטנות בטווח של 100-200 bp כדי להכניס LoxP או תגים קצרים כמו FLAG, HA או V5. תוך שיפור מתמיד, כאן אנו מציגים את המצב הנוכחי של CRISPR-EZ בפרוטוקול הכולל ייצור sgRNA באמצעות שעתוק חוץ גופי , עיבוד עוברים, הרכבת RNP, אלקטרופורציה וגנוטיפ של עוברים טרום השרשה. חוקר ברמת בוגר עם ניסיון מינימלי במניפולציה של עוברים יכול להשיג עוברים ערוכים גנטית תוך פחות משבוע באמצעות פרוטוקול זה. כאן, אנו מציעים שיטה פשוטה, זולה, יעילה ובעלת קיבולת גבוהה שניתן להשתמש בה עם עוברי עכבר.

Introduction

עריכת גנום בעכברים חיים פשטה במידה ניכרת והפכה לנגישה וזולה יותר מאז הופעתה של עריכת CRISPR 1,2,3. ניסיונות עריכה ראשוניים של בעלי חיים השתמשו במיקרו-הזרקה כדי להעביר CRISPR Cas9 mRNA/sgRNA לעובריםבשלב הגרעיני 4,5,6. בעוד מיקרו-הזרקה יעילה למדי, כמות התרגול הנדרשת כדי לשלוט בה באופן מלא עשויה שלא להתאים למתאמנים ולסטודנטים וגם דורשת ציוד יקר שמעבדה במימון צנוע אינה יכולה להרשות לעצמה. מיקרו-הזרקה מבוצעת בדרך כלל על ידי טכנאים מומחים במתקנים טרנסגניים עם לוחות זמנים ומחירי שירות המגבילים את התעריף עבור חוקרים רבים. גישה נגישה יותר היא זו של אלקטרופורציה, אשר הוכחה כיעילה למדי להעברת CRISPR Cas9 mRNA/sgRNA לעוברים בשלב גרעיני7. שיפורים נוספים באסטרטגיות העריכה והמסירה של גנום CRISPR הצביעו על כך ש-RNPs שהורכבו מראש וכבר עוסקים ב-sgRNA עשויים להיות אמצעי יעיל להפחתת פסיפס8.

הרציונל מאחורי הפיתוח והשימוש בפרוטוקול זה היה לעקוף רבות מהמגבלות והמכשולים הקשורים למיקרו-הזרקה. כפי שהשם מרמז, שיטה קלה, פנימית וחסכונית שיכולה לקבוע במהירות אם תכנוני sgRNA שלא נבדקו יהיו כדאיים לשימוש במהלך ניסוי מיקרו-הזרקה תהיה שלב בקרת איכות מעבר ראשון נוח מאוד (איור 1). בעוד ששיטה זו אינה יכולה להחליף מיקרו-הזרקה לאסטרטגיות מורכבות יותר, כמו החדרת רצפי דנ"א ארוכים של תורמים לתוצאות מבוססות רקומבינציה, היא אידיאלית לאסטרטגיות פחות מורכבות כמו מחיקות קטנות או החדרות ותיוג גנים. שיטה זו מתאימה לחוקרים בעלי מיומנויות בסיסיות של מניפולציה בעוברים שיש להם צרכי עריכה פשוטים, המעוניינים לבחון את ההשערה שלהם במסגרת הזמן של התפתחות טרום השרשה, או מעדיפים לבדוק sgRNA בעוברים לפני קביעת פגישה עם מומחה מיקרו-הזרקה. כאן, ריאגנטים עורכים מועברים באופן זמני לעוברים בשלב הגרעיני כמו Cas9/sgRNA RNPs באמצעות אלקטרופורציה (סדרה של פולסים חשמליים) כדי למקסם את היעילות תוך הפחתת פסיפס8. בשיטת גנוטיפ עוברי, תוצאות העריכה זמינות תוך כשבוע9, ובכך מפחיתות את הצורך ביישומי מיקרו-הזרקה שונים בעלות מופחתת משמעותית.

יעילותה של שיטה זו מגיעה לשיאה בשלב העובר הפרו-גרעיני, כאשר העובר עדיין לא התיך את גרעיני האם והאב או נכנס לשלב S (איור 2). סופרביולציה משמשת למקסום מספר הזיגוטה אך מייצרת גם זיגוטות פרו-גרעיניות וגם ביציות לא מופרות. ניתן גם לבחור מראש זיגוטים בריאים לפני אלקטרופורציה כדי להגביר את היעילות הכוללת. מכיוון שפרוטוקולי אלקטרופורציה אחרים ערכו זיגוטות ביעילות ללא צורך לכלול שלב דומה 7,10,11,12,13,14,15, שלב אופציונלי בפרוטוקול זה הוא שחיקה קלה של הזונה פלוצ'ידה (ZP). ZP היא שכבת גליקופרוטאין המסייעת לקשירת זרעונים, תגובת אקרוזום והפריה סביב עוברים בשלב הגרעיני. מניסיוננו, מצאנו כי שחיקה עדינה על בסיס חומצה של ZP מספקת אספקת אלקטרופורציה Cas9 RNP אמינה עם השפעה שולית בלבד על הכדאיות.

ראינו קצבי העברת RNP של עד 100% יעילות באמצעות אלקטרופורציה בזני עכברים המשמשים בדרך כלל במחקר כמו C57BL/6J ו- C57BL/6N 9,16. קבוצות עצמאיות פיתחו גם נהלים מבוססי אלקטרופורציה עם יעילות גדולה או תואמת מיקרו-הזרקה 11,12,13,14,15,17, עם פרוטוקולי אלקטרופורציה המתפקדים היטב בחולדות18,19, חזיר 20,21,22 ופרה 23 לכן אנו מציעים לקוראים להשוות את הפרוטוקולים כדי למצוא את התנאים המתאימים ביותר לצרכי הניסוי והציוד שלהם., המערכת המתוארת כאן משתמשת בחומרים ובציוד נפוצים, הדורשים רק מיומנויות בסיסיות של מניפולציה עוברית. טכניקה זו יעילה למגוון אסטרטגיות עריכה, מה שהופך שיטה זו לנגישה באופן נרחב לקהילת המחקר.

תכנון רנ"א מדריך קטן אידיאלי (sgRNAs) חיוני לעריכה יעילה. אנו ממליצים לסנן שתיים עד שלוש אסטרטגיות sgRNA לכל אתר מטרה ישירות בעוברי עכברים, במיוחד אם רוצים ליצור קו עכבר. לאחר התכנון, שיטות ללא שיבוט כמו שעתוק חוץ גופי (IVT) לייצור sgRNA באיכות גבוהה מומלצות3. ה-RNPs וה-sgRNA מעורבבים עם 30-50 עוברים מעובדים בשלב הגרעיני ונחשפים לסדרה של פולסים חשמליים כדי לחדור תחילה באופן זמני את ה-ZP ואת קרום התא, עם פולסים עוקבים כדי לשמור על הנקבוביות פתוחות ואלקטרופורזה של ה-RNPs דרך הזיגוטה24. לאחר אופטימיזציה, מצאנו כי שישה פולסים של 3 מילישניות ב- 30 V עבור עוברים בתפזורת (~ 50) היו אופטימליים ליעילות עריכה וכדאיות, וסיפקו משלוח יעיל ביותר של Cas9/sgRNA RNP 9,16,25. ניתן לאשר עריכת אירועים במורולה של עכבר בודד באמצעות מגוון אסטרטגיות אימות נפוצות לעריכת קריספר, כגון פולימורפיזם אורך מקטע הגבלה (RFLP), עיכול אנדונוקלאז T7 וריצוף סנגר של אזור העניין26.

השיטה הנוכחית מתאימה ביותר לסכמות עריכה פשוטות (איור 3), כגון הכנסה/מחיקות (indels), מחיקות בגודל אקסון בסדר גודל של 500-2000 bp, והעברת מוטציות נקודתיות ותוספות קטנות כגון תגי C- או N-Terminal (לדוגמה, FLAG, HA או V5)9,16,27. הפוטנציאל לעריכת גנום מורכבת, כמו החדרות גדולות של תגים פלואורסצנטיים או אללים מותנים, נותר לא ברור והוא המוקד הנוכחי של שיפורים עתידיים.

קל לשלוט בשיטה הזו, וניתן להשתמש בה כדי לבדוק במהירות sgRNA בעוברי עכברים בתרבית בשבוע9 (איור 1). בעבודה זו מוצג פרוטוקול בן שישה שלבים, הכולל 1) תכנון sgRNA; 2) סינתזת sgRNA; 3) ביוץ יתר והזדווגות; 4) תרבית עוברים, איסוף ועיבוד; 5) הרכבת RNP והתחשמלות; 6) תרבית עוברים וגנוטיפ. מידע על כל החומרים בהם נעשה שימוש מסופק (טבלת חומרים). כבקרה חיובית, ריאגנטים לעריכת מוקד הטירוזינאז (Tyr) 9,16 נכללו בטבלה המשלימה 1.

Protocol

כל הטיפול והשימוש בבעלי חיים לאורך פרוטוקול זה דבקו במדיניות חוק רווחת בעלי החיים, במדריך ILAR לטיפול ושימוש בחיות מעבדה ועקבו אחר הנחיות AVMA להמתת חסד וההנחיות והמדיניות של הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת פנסילבניה (IACUC). פרוטוקול הטיפול והשימוש בבעלי חיים נבדק ואושר על ידי IACUC של אוניברסיטת פנסילבניה עבור פרויקט זה. כעניין של ציות וזהירות, אנא חפש את כל האישורים הדרושים לפני שתנסה פרוטוקול זה.

1. sgRNA ועיצוב אוליגו תורם אופציונלי

  1. עיצוב sgRNA
    1. בחר sgRNA מועמדים מכל אלגוריתמים מקוונים נפוצים, כגון סריקת רצף עבור CRISPR (SSC; http://crispr.dfci.harvard.edu/SSC/)28 או CRISPick (https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public)29. מכיוון שכל פלטפורמה היא ייחודית, אנא קרא בעיון את הוראות המשתמש על מנת לעצב sgRNA אידיאלי. עבור ניסויי in/del, בחר שניים עד שלושה sgRNA לבדיקה. עבור מחיקות, sgRNA המקיפים את אזור המטרה מוצעים, למשל, שני sgRNA במעלה הזרם של המטרה ושני sgRNA במורד הזרם של המטרה.
      הערה: בעוד אלגוריתמי sgRNA מקוונים שונים לוקחים בחשבון מטרות מחוץ למטרות כדי להימנע מתכנוני sgRNA פגומים, כלי BLAST של NCBI עוזר לאשר את האיכות של רצפי sgRNA שנבחרו.
    2. הכנס 19-20 נוקלאוטידים (nt) שנקבעו מהשלב הקודם (1.1.1) לאזור המשתנה של אוליגו sgRNA (טבלה משלימה 1) ורכוש sgRNA מסונתז כאוליגוס DNA מותאם אישית.
      הערה: אין צורך בטיהור עמוד.
  2. (אופציונלי) עיצוב אוליגו תורם לתיקון מכוון הומולוגיה (HDR) בתיווך נוק-אין.
    1. תכנן את האוליגודאוקסינוקלאוטיד החד-גדילי המתאים (ssODN) בהתבסס על תוצאת הניסוי הרצויה (מוטציה מדויקת נקודתית, החדרת loxP, החדרת תג קטן וכו '), תוך שמירה על אורך כולל של 100-200 nt עם זרועות הומולוגיה של 50 nt או יותר המאגפות את אזור המרכז.
    2. כדי להבטיח יעילות דפיקה גבוהה יותר, תכננו את ה-sgRNA כך שישלים את ה-ssODN30, והחליפו את רצף המוטיב הסמוך לפרוטוספייסר (PAM) במוטציה שקטה כדי למנוע חיתוך חוזר על ידי האנזים Cas9.
    3. הזמינו ssODN באמצעות אפשרות אוליגו מותאמת אישית.

2. סינתזת sgRNA

  1. יצירת תבניות לתמלול חוץ גופי (IVT)
    1. כדי ליצור את תבנית ה-DNA עבור sgRNA IVT באמצעות PCR, הכינו תגובת IVT בצינור רצועת PCR נטול RNAse. (ראה טבלה משלימה 2).
    2. השתמש בתנאי המחזור התרמי הבאים:
      95 °C למשך 2 דקות; 30 מחזורים של 95 ° C במשך 2 דקות, 57 ° C עבור 10 שניות, ו 72 ° C עבור 10 שניות; ואז 72 °C למשך 2 דקות
    3. כדי לאמת את ההצלחה של תגובת PCR של תבנית sgRNA DNA, אלקטרופורזה 5 μL של המוצר בשילוב עם 1 μL של 6x טעינת צבע על ג'ל אגרוז 2% (wt/vol).
      הערה: גודל המוצר הצפוי הוא 127 bp. כל תגובת PCR שנותרה יכולה להיות מאוחסנת ב -20 ° C למשך עד 5 חודשים.
  2. שעתוק חוץ גופי (IVT) של sgRNA
    1. כדי ליצור את ה-sgRNA, הכינו את תערובת התגובה (T7 IVT לפי הוראות היצרן) בצינור PCR ולחצו כדי לערבב את הריאגנטים.
      הערה: ראה טבלה משלימה 3 לקבלת דוגמת הגדרת התגובה. תגובת IVT רגישה לזיהום RNase; לכן, לעשות כל מאמץ כדי לספק סביבה נטולת RNase.
    2. כדי לאפשר לתגובה להתחיל ולהמשיך, יש לדגור על תערובת תגובת IVT במשך >18 שעות ב-37°C במחזור תרמי או בבלוק חום.
    3. כדי לפרק את תבנית הדנ"א המקורית (שלב 2.1.3), הכנס 1 μL של DNase I (2 יחידות לכל תגובה) ודגור על התגובה במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
    4. כדי לקדם את קשירת RNA לחרוזי הטיהור המגנטיים, שלבו 129 μL של 100% אתנול בתגובה, שכעת תהיה 150 μL.
    5. כדי להשעות מחדש את חרוזי טיהור, אשר נוטים להתיישב במהלך האחסון, מערבל את aliquot לפחות 10 שניות.
    6. כדי לטהר את sgRNAs, הוסף 100 μL של חרוזים מרחפים מחדש (שלב 2.2.5) לתגובת IVT (שלב 2.2.4) וערבב בעדינות על ידי pipeting למעלה ולמטה 10x.
    7. כדי לאפשר קשירה, הניחו לתערובת לנוח על RT למשך 5 דקות.
    8. כדי לבודד את ה-sgRNA מתוצרי התגובה הלא משולבים, הניחו את התגובה על המעמדים המגנטיים למשך 5 דקות ב-RT והמתינו עד שתיווצר גלולה קטנה.
    9. כדי לשטוף את sgRNAs, תחילה בזהירות להשליך את supernatant ולאחר מכן להוסיף 200 μL של 80% אתנול מן הכדור.
      הערה: במהלך שלב שטיפת האתנול 80% (vol/vol), חיוני להימנע מהפרעה לגלולה על ידי פיפטציה, שכן זה יפחית את ריכוזי sgRNA במידה ניכרת. במקום זאת, פיפטה עדינה את 80% אתנול כך הגלולה הוא שקוע, בעדינות להסיר את נפח עם פיפטה.
    10. חזור על השלב הקודם (שלב 2.2.9) וייבוש באוויר את הגלולה במשך לא יותר מ 5-6 דקות או sgRNA יהיה קשור לצמיתות עם החרוזים.
    11. הצהירו את ה-sgRNA עם 20μL של מים נטולי נוקלאז על ידי פיפטציה של הגלולה פי 10, דגירה למשך 2 דקות ב-(RT), ולאחר מכן הנחתה בחזרה על המעמד המגנטי כדי להפריד את החרוזים מה-sgRNA המטוהר כעת.
    12. כדי להעריך את האיכות והכמות של sgRNA, השתמש במכשיר כמו ספקטרופוטומטר או ביואנלייזר. לחלופין, על ג'ל אגרוז 2%, להפעיל 2 μL של sgRNAs, בדומה לשלב 2.1.3.
      הערה: האיכות מאושרת על-ידי פס שקוף יחיד. ניתן להשתמש בשארית ה-sgRNA באופן מיידי או לאחסן בתנאים של -80°C.

3. סופרביוץ

  1. כדי לספק מספיק עוברים כדי לבדוק כל עיצוב sgRNA, סופרביוץ שתיים עד שלוש נקבות C57BL/6J בנות 3-5 שבועות, כפישתואר קודם 9. מומלץ לבצע אלקטרופורציה של 20-30 עוברים לכל sgRNA כדי לייצר מספיק תוצאות כדי לאשר את יעילותם.
    הערה: אם ההפריה מוצלחת, צפו ל-10-20 עוברים בכל הזדווגות.
  2. כדי לגרום לביוץ, בצע את לוח הזמנים הזה הזרקת הורמונים:
    1. יום 1: מתן 5 IU של גונדוטרופין בסרום סוסה בהריון (PMSG) (100 μL) באמצעות הזרקה intraperitoneal (IP) באמצעות מזרק 26 G לתוך עכברות בנות 3-5 שבועות.
    2. יום 3: לאחר 46-48 שעות של הזרקת PMSG, יש להזריק 5 IU של גונדוטרופין כוריוני אנושי (hCG) (100 μL) באמצעות הזרקת IP כדי לגרום לביוץ.
    3. כדי לבסס רבייה, זיווג נקבות 1:1 עם זכר של רבייה אמינה מיד לאחר הזרקת hCG.
      הערה: כדי למנוע מהורמונים להתפרק ולאבד פעילות, יש לבצע זריקות מתחת ל-30 דקות של הפשרה.

4. איסוף עוברים ועיבודם

  1. איסוף עוברים
    1. כדי להרדים נקבות ולאחזר את החומר הדרוש, כפי שתואר קודם לכן31, הקפד לאשר תחילה את השיטה המתאימה בהתאם למדיניות המוסדית. לדוגמה, השתמש בחנק CO2 , נקע צוואר הרחם ו / או שיטות מאושרות אחרות.
      הערה: בדרך כלל, >75% מהנקבות המגורות הורמונים מציגות תקעים כפייתיים, המעידים על הזדווגות מוצלחת.
    2. כדי למנוע משערות להקשות על איסוף רקמות, הניחו את הנקבות המורדמות על גבן וריססו אתנול 70% (vol/vol) על אזור הבטן לפתיחה כירורגית.
      הערה: מנקודה זו ואילך, מומלץ לבצע את השלבים הכירורגיים במכסה מנוע מאוורר על מנת לשמור על סביבה אספטית ולהפחית את פוטנציאל הזיהום.
    3. כדי לפתוח את חלל הבטן ולהסיר את הביציות, חתכו את שכבת העור/שיער (תת עורית) עם מספריים כירורגיים, ואתרו את השחלות (איור 4), שנמצאות ליד הכליה וחולקות קטע של כרית שומן. הביציות ממוקמות פרוקסימליות לשחלות (איור 4). הסירו בניתוח את שתי האובידוקט מהנקבה והכניסו אותן לטיפות בודדות של 50 μL של M2+BSA (4 מ"ג/מ"ל BSA) בינוני (איור 5A).
      הערה: ניתן להציג הוראות מפורטות עבור חלק זה של ההליך באופן חזותי31 או לעקוב אחר שלב9 באמצעות פרוטוקולים שפורסמו בעבר.
    4. כדי לשחרר את קומפלקסי הקומולוס-ביציות (CoCs) המכילים ביציות (איור 4), השתמשו במלקחיים לדיסקציה כדי לנקב את האמפולה של האובידוקט בזמן צפייה דרך סטריאומיקרוסקופ.
    5. כדי להפחית את כמות הפסולת (דם, שומן, רקמות), העבירו ושלבו כל CoC לטיפה אחת של 50 μL של מדיה M2+BSA עם פיפטה ידנית המוגדרת ל 20-30 μL כדי למנוע נשיאה של פסולת.
  2. הסרת תאי קומולוס
    1. כדי להתחיל בהסרה של תאי קומולוס מהזיגוטות (איור 4), העבירו CoCs עם כמה שפחות מדיה נוספת לטיפה של 100 μL M2+היאלורונידאז (איור 5B), וערבבו בעדינות על-ידי פיפטציה של CoCs עד שהעוברים מופרדים באופן נראה לעין מתאי הקומולוס הקטנים בהרבה. הקפד לשמור על חשיפה מינימלית של M2+היאלורונידאז לעוברים, שכן זה עלול להשפיע על הכדאיות.
      הערה: ניתן לחמם מראש (37°C) או להוסיף 50 μL נוספים של M2+היאלורונידאז אם העוברים אינם נפרדים מתאי הקומולוס תוך 2 דקות.
    2. כדי לדלל היאלורונידאז ולפנות תאי קומולוס רופפים מהזיגוטות, השתמשו בפיפט המופעל על ידי הפה כדי להעביר את הזיגוטה לטיפה טרייה של 50 μL M2+BSA.
      הערה: רוב השלבים מעבר לנקודה זו דורשים שימוש בפיפטה המופעלת על ידי הפה, אלא אם כן צוין אחרת. בעוד הסיכון לזיהום מהמשתמש נמוך, מומלץ להשתמש במסנן אוויר מוטבע כדי לשמור על סביבה אספטית. אנא עיין בשיטות שתוארו קודם לכן כדי להכין ולהשתמש במכשיר זה 9,31.
    3. באמצעות פיפטה בפה, העבירו את העוברים דרך לפחות ארבע עד חמש טיפות נוספות של 50 μL M2+BSA כדי להפחית את מספר תאי הקומולוס.
  3. (אופציונלי) דילול של zona pellucida עם תמיסת חומצה tyrode (AT).
    1. כדי לשחוק את הזונה פלוצ'ידה של העובר ולהפחית מכשולים פיזיים נוספים ללידה ריאגנטית, העבירו את העוברים לטיפה 100 מיקרוליטר של תמיסת AT שחוממה מראש (37°C) על צלחת בקוטר 60 מ"מ (איור 5C). התבוננו ברציפות בזיגוטה באמצעות סטריאומיקרוסקופ עד שכ-30% מהזונה פלוצ'ידה נשחקת9. החשיפה הכוללת ל- AT חייבת להיות 60-90 שניות. חשיפה ממושכת ל- AT יכולה להמיס לחלוטין את הזונה פלוצ'ידה ולסכן את כדאיות העובר.
      הערה: לקבלת הוראות מפורטות ותמונות של חלק זה של הנוהל, עיין בשיטות 9,16 שפורסמו בעבר.
    2. כדי לדלל את AT, השתמש פיפטה הפה כדי להעביר את העוברים דרך לפחות ארבע טיפות 50 μL של M2 + BSA.
    3. כדי לקבוע אם מספר מתאים של עוברים עובדו, השתמש בסטריאומיקרוסקופ כדי לספור את העוברים. בהתאם למספר נקבות העכברים בהן נעשה שימוש, ניתן לצפות לכ-10-20 זיגוטים בני קיימא לכל נקבה.
      הערה: בשלב זה, העוברים צריכים להיות נקיים יחסית מפסולת שתמנע הערכת כמות ואיכות. לדוגמה, אם משתמשים בחמש נקבות, מספרי הזיגוטה הצפויים יהיו ככל הנראה בין 50-100, ומונה תאים מכני יהיה מתאים כדי לעקוב אחר עוברים. מקובל לאבד כ-10%-20% מהעוברים עקב אי הפריה או ביוץ של ביציות באיכות נמוכה. בשלב הבא, אחסנו את העוברים בקצרה ב-50 מיקרוליטר של M2+BSA למשך לא יותר מ-30 דקות באינקובטור.

5. הרכבת RNP ואלקטרופורציה

  1. הרכבת RNP
    1. כדי להרכיב את קומפלקס ה-RNP, השתמש בטבלאות לדוגמה המצורפות כדי לשלב את תערובות התגובה המתאימות בהתבסס על אסטרטגיית העריכה הרצויה במאגר RNP (100 mM HEPES pH 7.5, 750 mM KCl, 5 mM MgCl 2, 50% גליצרול ו-100 mM Tris(2-carboxyethyl) פוספין הידרוכלוריד [TCEP] במים נטולי נוקלאז)
      הערה: TCEP הוא חומר מחזר נוח אך בעל זמן מחצית חיים קצר בתמיסות מימיות; לכן, הוסף TCEP ממש לפני הרכבה מורכבת RNP.
      1. עבור indels בתיווך הצטרפות קצה לא הומולוגית (NHEJ), עיין בטבלה משלימה 4.
      2. לעריכה בתיווך תיקון מכוון הומולוגיה (HDR), עיין בטבלה משלימה 5.
      3. למחיקות הנדסיות באמצעות sgRNA זוגי, עיין בטבלה משלימה 6.
        1. ללא קשר לאסטרטגיה, שלב את הריאגנטים הרצויים ב- RT בצינור PCR.
        2. כדי לאפשר היווצרות קומפלקס RNP, לדגור על התערובת במשך 10 דקות ב 37 ° C.
          הערה: ניתן לאחסן קומפלקס RNP ב- RT עד שעה אחת.
  2. אלקטרופורציה
    1. כדי לדלל את BSA לפני אלקטרופורציה, להעביר את העוברים דרך לפחות שתי טיפות של 50 μL של מדיה בסרום מופחת.
      הערה: BSA מגביר את ההתנגדות במהלך אלקטרופורציה ועלול לפגוע בזיגוטים.
    2. כדי להכין ולערבב את הזיגוטה (שלב 4.3.2) עם קומפלקס RNP (שלב 5.1.1.2) עבור electroporation, פיפטה הפה 25-30 עוברים לתוך טיפה 10 μL של מדיה בסרום מופחת, ולאחר מכן להשתמש פיפטה כף יד להוסיף 10 μL של קומפלקס RNP (שלב 5.1.1.2).
    3. כדי לדלל את הגליצרול הצמיג מקומפלקס RNP ולהפוך את הדגימה להומוגנית, מערבבים על ידי פיפטינג פי 10 או עד שהתערובת כבר לא מראה סימני צמיגות (תבנית מערבולת) באמצעות סטריאומיקרוסקופ.
    4. כדי להכין את הדגימה להחדרה לתוך אלקטרופורטור, פיפטה זו 20 μL של תערובת עובר + RNP לתוך קובטת אלקטרופורציה 0.1 ס"מ תוך הימנעות בועות.
    5. כדי להעביר את ריאגנטי העריכה לזיגוטה יש לחשמל את העוברים באמצעות פרוטוקול גל מרובע בתנאים הבאים: 30 וולט, 4-6 פולסים, אורך פולס של 3 אלפיות השנייה ו-100 מרווחי פעימות.
    6. כדי לאחזר זיגוטות מהקובטה, השתמש בפיפט ידני כדי להעביר 50 μL של KSOM+BSA (1mg/mL BSA) לחלק העליון של הקובטה כדי לשטוף את העוברים שאולי התיישבו למטה. מזלפים בעדינות את התערובת החוצה ועל צלחת בקוטר 60 מ"מ.
    7. חזור על שלב 5.2.6 לפחות 2x-3x ושלב כל סומק על צלחת 60 מ"מ עד שרוב העוברים מוחזרים.
      הערה: התאוששות טיפוסית היא >90% מהעוברים שנטענו במקור. כדי להבטיח את הישרדות העובר, בדוק את האינקובטור ובדוק את תאריכי התפוגה של כל הריאגנטים. עוברים רגישים לתנאי תרבית לא אידיאליים כגון טמפרטורה, רמת CO2 , לחות ו- pH.

6. תרבית עוברים וגנוטיפ

  1. תרבית עוברים
    1. כדי לגדל זיגוטות לשלב הרצוי, השתמשו בפיפטת פה כדי להעביר 20-30 זיגוטות לתוך טיפה של KSOM+BSA בצלחת תרבית מאוזנת מראש והעבירו את העוברים לטיפה (איור 5D). יש לדגור על הצלחת למשך הלילה ב-5% CO2, בטמפרטורה של 37°C, עם 95% לחות.
      הערה: יש לבצע שיווי משקל מראש על-ידי הצבת לוח תרבית מוכן בקוטר 35 מ"מ באינקובטור יום לפני או לפחות 4 שעות לפני הדגירה (איור 5D).
    2. כדי לקדם תנאי גדילה אידיאליים, העבירו רק עוברים דו-תאיים ביום המחרת לטיפה טרייה של תערובת KSOM+BSA באמצעות סטריאומיקרוסקופ וחזרו לאינקובטור. הקפד להשאיר או להשליך את העוברים המתים או הלא מופרים.
      הערה: עוברים בשלב הגרעיני בדרך כלל גדלים למורולה לאחר 72 שעות של תרבית ובלסטוציסטים לאחר 84 שעות.
  2. גנוטיפ
    1. כדי לדלל את מרכיבי המדיה שעלולים להפריע לתגובת PCR, שטפו את עוברי המורולה/בלסטוציסט באמצעות פיפטה בפה על ידי מעבר דרך שתי טיפות של DPBS.
    2. כדי לטעון עוברים בודדים עבור ליזיס, להעביר עוברים בודדים לבאר אחת של רצועת PCR 8 באר על ידי הגדרת פיפטה ל 1 μL, ולאחר מכן להוסיף 10 μL של חיץ ליזה (50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl ph 8.5, 2.5 mM MgCl 2, 0.1 מ"ג / מ"ל ג'לטין, 0.45% Nonidet P-40, 0.45% Tween 20, 0.2 מ"ג / מ"ל פרוטאינאז K ב H2 O ללא נוקלאז).
      הערה: יש להוסיף פרוטאינאז K ממש לפני הכנת מאגר הליזיס.
    3. כדי לשכב את העוברים, תכנת מחזור תרמי ל 55 ° C במשך 4 שעות, ולאחר מכן להשבית את proteinase K עם דגירה של 10 דקות ב 95 ° C.
      הערה: במיוחד עבור משתמשים בפעם הראשונה, נסה ניסוי עריכה ב- Tyr loci. זרימת עבודה זו עברה אופטימיזציה ויכולה לשמש כבקרה חיובית. במידת הצורך, לאחסן את העובר lysates ב 4 ° C במשך 2-3 ימים או במקפיא עד 2 שבועות לפני ניתוח PCR. יש למנוע מחזורי הקפאה-הפשרה חוזרים ונשנים.
    4. כדי להגדיל את הסיכויים לניתוח גנוטיפ מוצלח, בצע אסטרטגיית PCR מקוננת על ידי הגברת מקטעי DNA מעט ארוכים יותר המקיפים את אתר היעד, כמו גם אזורים שישמשו להגברת מקטע DNA מדויק יותר. בהתאם לתנאים בטבלה משלימה 7.
    5. עקוב אחר תנאי המחזור התרמי שהוזכרו להלן:
      95 °C למשך 2 דקות
      30+ מחזורים: 95°C למשך 2 דקות, 60°C למשך 10 שניות ו-72°C למשך 10 שניות
      72 °C למשך 2 דקות
    6. כדי להכין את השלב השני של אסטרטגיית PCR מקוננת, בצע דילול ביחס של 1:10 של מוצר ה-PCR הראשון (שלב 6.2.5) וטען 2 מיקרוליטר מזה לתגובת ה-PCR הבאה (עם פריימרים שתוכננו להיות בתוך המגבר הקודם).
      הערה: יש לדלל את תגובת ה-PCR הראשונה כדי להפחית את הנשיאה של פריימרים צמודים בתגובת ה-PCR השנייה. הכן את ה- PCR המקונן על-ידי ביצוע השלבים בטבלה משלימה 8.
    7. מקם את תגובת ה- PCR במחזור תרמי באמצעות תנאי הרכיבה הבאים:
      95 °C למשך 2 דקות
      30 מחזורים: 95°C למשך 2 דקות, 60°C למשך 10 שניות ו-72°C למשך 10 שניות
      72 °C למשך 2 דקות
      הערה: בדרך כלל, >90% מתגובות ה-PCR מצליחות כאשר גודל האמפליקון הוא 500 bp או פחות.
    8. (פקד אופציונלי) עבור מוטציות in/del בתיווך NHEJ המשתמשות ב-Tyr כבקרה חיובית, יש לעכל 10 μL של מוצרי ה-PCR המקוננים משלב 6.2.7 על ידי דגירה ב-37°C למשך 4 שעות באמצעות 10U של HinfI בתגובה של 20 μL (ראה טבלה משלימה 9). על ג'ל אגרוז 2%, הפעל את המוצר המעוכל כדי להעריך עריכה והשתמש במוצר PCR לא מעוכל כבקרת עומס. הפעל את הג'ל ב 135 V במשך 30 דקות.
      הערה: השימוש ב-HinfI כאנזים הגבלה מתאים נבחר בשל אתר HinfI הממוקם בנוחות באזור היעד של sgRNA שצפוי לעבור עריכה מוצלחת של NHEJ. שיטה מפורטת ותוצאות תוארו בעבר 9,16.
    9. (פקד אופציונלי) עבור מוטציות בתיווך HDR המשתמשות ב-Tyr כבקרה חיובית, יש לעכל 10 μL של מוצרי PCR מקוננים משלב 6.2.7 על ידי דגירה ב-37°C למשך 4 שעות באמצעות 10U של EcoRI בתגובה של 20 μL (ראה טבלה משלימה 10). על ג'ל אגרוז 2%, הפעל את המוצר המעוכל כדי להעריך עריכה והשתמש במוצר PCR לא מעוכל כבקרת עומס. הפעל את הג'ל ב 135 V במשך 30 דקות.
      הערה: הבחירה ב-EcoRI כאנזים הגבלה אבחוני מנצלת את הרצף המקורי שנמצא באזור היעד של sgRNA, שם, עם HDR מוצלח, אתר HinfI הטבעי מוחלף באתר EcoRI, ומוטציה של frameshift מאולצת שמפריעה לגן Tyr. עבור ניתוח HDR, בצע ניתוחי NHEJ (שלב 6.2.8) ו- HDR (שלב 6.2.9) בכל דגימה, מכיוון ששתי התוצאות יכולות להתרחש ויכולות לסייע בקביעת הפסיפס. שיטה מפורטת ותוצאות תוארו בעבר 9,16.

תוצאות

שיטה זו מייצרת יותר מ -100 מיקרוגרם של sgRNA (20 μL בריכוז >6,000 ng/L) להרכבה יעילה של Cas9/sgRNA RNP. שיטת הסופרביוץ השגרתית המתוארת כאן מייצרת בדרך כלל 10-20 עוברים בני קיימא לכל נקבה מחוברת. בשל טעויות טיפול והפסדים אופייניים הקשורים למניפולציה של עוברים, צפוי כי 80% מהעוברים מופרים, ברי קיימא ובמצב מצוין לא?...

Discussion

מוצגת כאן טכנולוגיה פשוטה ויעילה ביותר לעריכת גנום עכבר. אלקטרופורציה יכולה לשמש ליצירת עוברים שעברו שינוי תוך שבוע-שבועיים (איור 1) ויכולה לייצר עכברים ערוכים תוך 6 שבועות9. בהשוואה לפרוטוקולים מבוססי אלקטרופורציה שפותחו במקביל ומספקים RNPs 7,10,11,12,13,14,15,17,...

Disclosures

אין הצהרות כספיות רלוונטיות של המחברים.

Acknowledgements

איי.ג'.אם יצר את הקונספט המקורי שהוביל לפיתוח CRISPR-EZ והפיק את הדמויות. סי.קיי.די ליקט והתאים את הפרוטוקולים הפנימיים והמפורסמים לכתב היד הנוכחי. A.J.M. נתמך על ידי NIH (R00HD096108).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.1-cm-gap electroporation cuvetteBio-Radcat. no. 1652089Electroporation
26-G, 1/2-inch needleBDcat. no. 305111Superovulation
3–8-month-old male mice and 3- to 5-week-old female miceJAXcat. no. 000664Superovulation
35-mm Tissue culture dishGreiner Bio-One,cat. no. 627-160Embryo Culture
60-mm Tissue culture dishGreiner Bio-One,cat. no. 628-160Embryo Processing
6x loading dyeThermo Fisher Scientificcat. no. R0611sgRNA Synthesis and Genotyping
Acidic Tyrode's (AT) solution, embryo culture gradeSigma-Aldrich,cat. no. T1788Embryo Processing
BSA, embryo culture gradeSigma-Aldrichcat. no. A3311Embryo Processing and Culture
Cas9 proteinAlt-R S.p. Cas9 nuclease 3NLScat. no. 1074181Electroporation
DNase I, RNase-freeNew England BioLabs,cat. no. M0303sgRNA Synthesis
DPBS(calcium and magnesium free)Gibcocat. no. 14190-144Embryo Processing
EcoRINEBcat. no. R3101SGenotyping
EDTA, anhydrousSigma-Aldrichcat. no. EDS-100GRNP Buffer
EthanolKopteccat. no. V1016sgRNA Synthesis
Gelatin (powder) type B, laboratory gradeFisher,cat. no. G7-500Lysis Buffer
Glycerol, molecular-biology gradeFishercat. no. BP229RNP Buffer
Taq PolymerasePromegacat. no. M712Genotyping
HEPES, cell culture gradeSigma-Aldrichcat. no. H4034RNP Buffer
HinfI (10,000 U/mL)NEBcat. no. R0155SGenotyping
HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis KitNew England BioLabs,cat. no. E2040sgRNA Synthesis
Human chorion gonadotropin, lyophilized (hCG)Milliporecat. no. 230734Superovulation
Hyaluronidase/M2Milliporecat. no. MR-051-FEmbryo Processing
KSOMaa Evolve medium (potassium-supplemented simplex-optimized medium plus amino acids)Zenith Biotechcat. no. ZEKS-050Embryo Culture
LE agarose, analytical gradeBioExpresscat. no. E-3120-500sgRNA Synthesis and Genotyping
M2 mediumZenith Biotechcat. no. ZFM2-050Embryo Processing
Magnesium chloride, anhydrous (MgCl2)Sigma-Aldrichcat. no. M8266RNP and Lysis Buffer
Mineral OilMilliporecat. no. ES-005CEmbryo Culture
Nonidet P-40,substitute (NP-40)Sigma-Aldrichcat. no. 74385Lysis Buffer
Nuclease-free water, molecular-biology gradeAmbioncat. no. AM9937sgRNA Synthesis and Genotyping
Oligos for sgRNA synthesis, donor oligo and PCR primers for genotypingIntegrated DNA Technologiescustom orderssgRNA Design
Reduced serum mediumThermo Fisher Scientificcat. no. 31985062Embryo Culture
High-fidelity DNA polymeraseNew England BioLabs,cat. no. M0530sgRNA Synthesis
Potassium chloridemolecular-biology grade (KCl)Sigma-Aldrichcat. no. P9333RNP and Lysis Buffer
Pregnant mare serum gonadotropin lyophilizd ((PMSG)ProspecBiocat. no. HOR-272Superovulation
Proteinase K, molecular-biology gradeFishercat. no. BP1700-100Lysis Buffer
RNase-free 1.5-mL microcentrifuge tubeVWRcat. no. 20170-333sgRNA Synthesis and Genotyping
RNase-free eight-well PCR strip tubesVWRcat. no. 82006-606sgRNA Synthesis and Genotyping
Magnetic purification beadsGE Healthcarecat. no. 65152105050250sgRNA Synthesis
Tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP)Sigma-Aldrichcat. no. C4706RNP Buffer
Tris-HCl solution, pH 8.5 molecular-biology gradeTeknovacat. no. T1085Lysis Buffer
Tween 20 molecular-biology gradeSigma-Aldrichcat. no. P7949-500Lysis Buffer

References

  1. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  2. Xu, H., et al. Sequence determinants of improved CRISPR sgRNA design. Genome Research. 25 (8), 1147-1157 (2015).
  3. Lin, S., Staahl, B., Alla, R. K., Doudna, J. A. Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery. eLife. 3, 04766 (2014).
  4. Wang, B., et al. Highly efficient CRISPR/HDR-mediated knock-in for mouse embryonic stem cells and zygotes. Biotechniques. 59 (4), 201-208 (2015).
  5. Yang, H., Wang, H., Jaenisch, R. Generating genetically modified mice using CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Nature Protocols. 9 (8), 1956-1968 (2014).
  6. Fujii, W., Onuma, A., Sugiura, K., Naito, K. One-step generation of phenotype-expressing triple-knockout mice with heritable mutated alleles by the CRISPR/Cas9 system. Journal of Reproduction and Development. 60 (4), 324-327 (2014).
  7. Kaneko, T., et al. Simple genome editing of rodent intact embryos by electroporation. PLoS One. 10 (11), 0142755 (2015).
  8. Mehravar, M., Shirazi, A., Nazari, M., Banan, M. Mosaicism in CRISPR/Cas9-mediated genome editing. Developmental Biology. 445 (2), 156-162 (2019).
  9. Modzelewski, A. J., et al. Efficient mouse genome engineering by CRISPR-EZ technology. Nature Protocols. 13 (6), 1253-1274 (2018).
  10. Gurumurthy, C. B., et al. Creation of CRISPR-based germline-genome-engineered mice without ex vivo handling of zygotes by i-GONAD. Nature Protocols. 14 (8), 2452-2482 (2019).
  11. Hur, J. K., et al. Targeted mutagenesis in mice by electroporation of Cpf1 ribonucleoproteins. Nature Biotechnology. 34 (8), 807-808 (2016).
  12. Tröder, S. E., et al. An optimized electroporation approach for efficient CRISPR/Cas9 genome editing in murine zygotes. PLoS One. 13 (5), 0196891 (2018).
  13. Qin, W., et al. Efficient CRISPR/cas9-mediated genome editing in mice by zygote electroporation of nuclease. Genetics. 200 (2), 423-430 (2015).
  14. Hashimoto, M., Yamashita, Y., Takemoto, T. Electroporation of Cas9 protein/sgRNA into early pronuclear zygotes generates non-mosaic mutants in the mouse. Developmental Biology. 418 (1), 1-9 (2016).
  15. Teixeira, M., et al. Electroporation of mice zygotes with dual guide RNA/Cas9 complexes for simple and efficient cloning-free genome editing. Scientific Reports. 8, 474 (2018).
  16. Chen, S., Lee, B., Lee, A. Y. -. F., Modzelewski, A. J., He, L. Highly efficient mouse genome editing by CRISPR ribonucleoprotein electroporation of zygotes. Journal of Biological Chemistry. 291 (28), 14457-14467 (2016).
  17. Wang, W., et al. Delivery of Cas9 protein into mouse zygotes through a series of electroporation dramatically increased the efficiency of model creation. Journal of Genetics and Genomics. 43 (5), 319-327 (2016).
  18. Mizuno, N., et al. Intra-embryo gene cassette knockin by CRISPR/Cas9-mediated genome editing with adeno-associated viral vector. iScience. 9, 286-297 (2018).
  19. Remy, S., et al. Generation of gene-edited rats by delivery of CRISPR/Cas9 protein and donor DNA into intact zygotes using electroporation. Scientific Reports. 7, 16554 (2017).
  20. Tanihara, F., et al. Generation of PDX-1 mutant porcine blastocysts by introducing CRISPR/Cas9-system into porcine zygotes via electroporation. Animal Science Journal. 90 (1), 55-61 (2019).
  21. Zhou, X., Guo, H., Chen, K., Cheng, H., Zhou, R. Identification, chromosomal mapping and conserved synteny of porcine Argonaute family of genes. Genetica. 138 (7), 805-812 (2010).
  22. Nishio, K., et al. Effects of voltage strength during electroporation on the development and quality of in vitro-produced porcine embryos. Reproduction in Domestic Animals. 53 (2), 313-318 (2018).
  23. Camargo, L. S. A., Owen, J. R., van Eenennaam, A. L., Ross, P. J. Efficient one-step knockout by electroporation of ribonucleoproteins into zona-intact bovine embryos. Frontiers in Genetics. 11, 570069 (2020).
  24. Escoffre, J. M., et al. What is (still not) known of the mechanism by which electroporation mediates gene transfer and expression in cells and tissues. Molecular Biotechnology. 41 (3), 286-295 (2009).
  25. Chen, S., et al. CRISPR-READI: Efficient generation of knockin mice by CRISPR RNP electroporation and AAV donor infection. Cell Reports. 27 (13), 3780-3789 (2019).
  26. Sentmanat, M. F., Peters, S. T., Florian, C. P., Connelly, J. P., Pruett-Miller, S. M. A survey of validation strategies for CRISPR-Cas9 editing. Scientific Reports. 8, 888 (2018).
  27. Modzelewski, A. J., et al. A mouse-specific retrotransposon drives a conserved Cdk2ap1 isoform essential for development. Cell. 184 (22), 5541-5558 (2021).
  28. Xu, H., et al. Sequence determinants of improved CRISPR sgRNA design. Genome Research. 25 (8), 1147-1157 (2015).
  29. Sanson, K. R., et al. Optimized libraries for CRISPR-Cas9 genetic screens with multiple modalities. Nature Communications. 9 (1), 5416 (2018).
  30. Okamoto, S., Amaishi, Y., Maki, I., Enoki, T., Mineno, J. Highly efficient genome editing for single-base substitutions using optimized ssODNs with Cas9-RNPs. Scientific Reports. 9, 14811 (2019).
  31. Duselis, A. R., Vrana, P. B. Retrieval of mouse oocytes. Journal of Visualized Experiments. (3), e185 (2007).
  32. Takahashi, G., et al. GONAD: Genome-editing via oviductal nucleic acids delivery system: A novel microinjection independent genome engineering method in mice. Scientific Reports. 5, 11406 (2015).
  33. Tu, Z., et al. Promoting Cas9 degradation reduces mosaic mutations in non-human primate embryos. Scientific Reports. 7, 42081 (2017).
  34. Aida, T., et al. Cloning-free CRISPR/Cas system facilitates functional cassette knock-in in mice. Genome Biology. 16 (1), 87 (2015).
  35. Zhu, L., et al. Patterns of exon-intron architecture variation of genes in eukaryotic genomes. BMC Genomics. 10, 47 (2009).
  36. Quadros, R. M., et al. Easi-CRISPR: a robust method for one-step generation of mice carrying conditional and insertion alleles using long ssDNA donors and CRISPR ribonucleoproteins. Genome Biology. 18, 92 (2017).
  37. Gurumurthy, C. B., Saunders, T. L., Ohtsuka, M. Designing and generating a mouse model: frequently asked questions. Journal of Biomedical Research. 35 (2), 76-90 (2021).
  38. Nakajima, K., et al. Exome sequencing in the knockin mice generated using the CRISPR/ Cas system. Scientific Reports. 6, 34703 (2016).
  39. Iyer, V., et al. Off-target mutations are rare in Cas9-modified mice. Nature Methods. 12 (6), 479 (2015).
  40. Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

190

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved