טכניקה זעיר פולשנית, מדויקת ויעילה להזרקה תוך-תימית בעכברים

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מתאר הליך רדיולוגיה התערבותי שנקבע להזרקה תוך-תימית בעכברים כדי למנוע את הסיכון לניתוח פתוח ולשפר את הדיוק של זריקות מלעוריות עיוורות.

Abstract

הזרקה תוך-תימית במודלים של עכברים היא טכניקה חשובה לחקר תפקוד התימיק ומערכת החיסון, כולל הפרעות גנטיות ונרכשות בתאי T. לשם כך נדרשות שיטות לתצהיר ישיר של ריאגנטים ו/או תאים לתוך בלוטת התימוס של עכברים חיים. שיטות מסורתיות של הזרקה תוך תמית כוללות ניתוחי חזה או זריקות עיוורות מלעוריות זעיר פולשניות, שלשתיהן יש מגבלות משמעותיות. מכשירי הדמיית אולטרסאונד בתדר גבוה במיוחד אפשרו הזרקות מלעוריות מונחות תמונה בעכברים, ובכך שיפרו מאוד את דיוק ההזרקה של גישת ההזרקה המלעורית ואפשרו הזרקה של מטרות קטנות יותר. עם זאת, הזרקות מונחות תמונה מסתמכות על שימוש במערכת מסילות משולבת, מה שהופך את זה להליך נוקשה וגוזל זמן. כאן מוצגת שיטה ייחודית, בטוחה ויעילה להזרקות תוך תימיות מלעוריות בעכברים, המבטלת את ההסתמכות על מערכת המסילה להזרקות. הטכניקה מסתמכת על שימוש ביחידת מיקרו-אולטרסאונד ברזולוציה גבוהה כדי לדמות את בלוטת התימוס של העכבר באופן לא פולשני. באמצעות טכניקת יד חופשית, רדיולוג יכול למקם קצה מחט ישירות לתוך בלוטת התימוס של העכבר בהנחיה סונוגרפית. עכברים מנוקים ומורדמים לפני ההדמיה. עבור רדיולוג מנוסה המיומן בהליכים מונחי אולטרסאונד, תקופת הלמידה של הטכניקה המוצהרת היא קצרה למדי, בדרך כלל תוך פגישה אחת. לשיטה יש שיעור תחלואה ותמותה נמוך לעכברים והיא מהירה בהרבה מהטכניקות הקיימות כיום בסיוע מכני להזרקה מלעורית. היא מאפשרת לחוקר לבצע ביעילות זריקות מלעוריות מדויקות ואמינות של תימוזות בכל גודל (כולל איברים קטנים מאוד כמו תימוס של עכברים זקנים או מדוכאי חיסון) עם לחץ מינימלי על החיה. שיטה זו מאפשרת הזרקת אונות בודדות אם רוצים ומאפשרת ניסויים בקנה מידה גדול בשל האופי החוסך בזמן של ההליך.

Introduction

לתימוס יש תפקיד חיוני בהתפתחות תאי T ובחסינות. מחסור בתאי T, אשר יכול להיגרם על ידי התנוונות thymic, הפרעות גנטיות, זיהומים, וטיפולים בסרטן, בין היתר, מוביל לתמותה גבוהה ותחלואה ^1,2. מודלים של עכברים הם הכרחיים הן במחקר אימונולוגיה בסיסית והן במחקר אימונולוגיה תרגומית, והם שימשו במשך עשרות שנים לחקר ביולוגיה תימית והתפתחות תאי T, כמו גם לפיתוח טיפולים עבור אלה הסובלים מתפקוד לקוי של בלוטת התימוס ומחסור בתאי T ^3,4,5.

חלק מרכזי בחקר התימיקה היה הזרקה תוך-תמית של חומרים ביולוגיים כגון תאים, גנים או חלבונים במודלים של עכברים 6,7,8,9,10,11,12^. שיטות הזרקה תוך-תימיות קונבנציונליות משתמשות בכריתת בית החזה ולאחר מכן בהזרקה תוך-תימית בהדמיה ישירה או בהזרקה מלעורית "עיוורת" למדיאסטינום. הגישה הניתוחית מגדילה באופן משמעותי את הסיכון לפנאומוטורקס, בין היתר. יתר על כן, הלחץ המוגבר במהלך ניתוח זה גורם לדיכוי חיסוני, ובכך עלול לפגוע בנתונים אימונולוגיים¹³. חוקרים מנוסים, לאחר תרגול מסוים, יכולים לבצע את טכניקת ההזרקה העיוורת, אך גישה זו פחות מדויקת ולכן מגבילה את הנבדקים הניסיוניים לעכברים צעירים עם תימוס גדול.

השימוש בהנחיית אולטרסאונד הוכנס כחלופה מדויקת וזעיר פולשנית לגישות ההזרקה התוך-תימיות המסורתיות¹⁴. עם זאת, הליך זה גוזל זמן רב בעת שימוש במערכת המסילה המשולבת במקום בטכניקת היד החופשית. ביצוע הזרקות עם תושבת ההזרקה דורש אופטימיזציה ומיקום קפדניים של המתמר בעזרת החיבורים השונים כגון מעמד המתמר והרכבתו, מערכת המיקום X, Y ו- Z, כמו גם הפעלה מיומנת של בקרות המיקרו-מניפולציה והרחבות מערכת המסילה. טכניקה חלופית פשוטה, הזרקת תימי מונחית אולטרסאונד, מוצגת כאן על ידי רדיולוג באמצעות גישה ביד חופשית¹⁵, שהיא גם חלופה מהירה וגם מדויקת זעיר פולשנית לשיטות שתוארו לעיל. חשוב לציין, ניתן לבצע את הגישה הנוכחית עם כל מערכת הדמיית אולטרסאונד ברזולוציה גבוהה ללא צורך בתושבת הזרקה ומערכת מסילות משולבת. הוא שימושי במיוחד למחקרים הדורשים הזרקה של מספר גדול של עכברים¹¹, לניסויים הכוללים הזרקה של שתי האונות התימיות, או להזרקה מדויקת של תימוזים קטנים בעכברים מזדקנים, מוקרנים או מדוכאי חיסון¹².

Protocol

כל ההליכים בוצעו בהתאם להנחיות הטיפול בבעלי חיים במרכז לגילוי וחדשנות (פרוטוקול IACUC 290). עבור המחקר הנוכחי, C57BL/6 עכברים (נקבה, 4-6 שבועות), C57BL/6 עכברים (נקבה, בת 6 חודשים), עכברים נקבות J:NU, עכברי נקבות NOD scid gamma (NSG) ו-B6; עכברי CAG-luc, -GFP שימשו כמודל העכבר הצעיר, מודל העכבר הזקן, מודל העירום האתימי, מודל החיסון ומקור התא הביולוגי, בהתאמה. העכברים התקבלו ממקור מסחרי (ראו טבלת חומרים). הליך זה ידרוש בדרך כלל שני אנשים (אחד להישאר סטרילי בעת ביצוע הזריקות והשני לטפל בעכברים).

1. הכנת בעלי חיים

1. השרימו הרדמה בעכברים באמצעות גז איזופלורן 3%-4% ושמרו על הרדמה באמצעות גז איזופלורן 1%-3% הניתן באמצעות חרוט אף ומכשיר אידוי מכויל מדויק (ראו טבלת חומרים).
2. אשרו את עומק ההרדמה/חוסר ההכרה המתאימים על ידי חוסר תגובה לצביטת הכפה האחורית.
3. הסר את הפרווה מאזור החזה הקדמי של העכברים על ידי החלת שכבה דקה של קרם דפילציה במשך פחות מדקה אחת. השתמשו במגבת נייר רטובה כדי להסיר את הקרם לחלוטין יחד עם הפרווה הרופפת.
   הערה: מריחת קרם רב מדי תגרום לעור באזור החזה להיות מודלק.
4. הניחו עכבר אחד בכל פעם, בשכיבה, על הפלטפורמה המחוממת של תחנת ההדמיה של אולטרסאונד של בעלי חיים קטנים (ראו טבלת חומרים) עם חרוט האף במקומו (איור 1).
5. הצמידו את העכבר לשלב באמצעות סרט דבק רפואי בחלק האחורי ובגפיים הקדמיות (איור 1).
6. יש למרוח משחת עיניים על שתי העיניים כדי למנוע התייבשות של הקרנית.
7. יש לחטא את עור בית החזה העליון ללא פרווה באמצעות אפליקטור כלורהקסידין גלוקונאט (ראו טבלת חומרים).

2. הכנת מכשיר האולטרסאונד והשדה הסטרילי

1. הפעל את הבדיקה הליניארית בתדר הגבוה ביותר הזמינה, בדרך כלל הבדיקה עם הרזולוציה המרחבית הגבוהה ביותר עבור גודל החיה המצולמת. הפעל את הבדיקה על-ידי הקשה על הלחצן המתאים לאחר מסך האתחול.
   הערה: עבור יישום זה עם עכברים, הבדיקה המשמשת מיועדת במיוחד לשימוש עם עכברים וחולדות קטנות (ראה טבלת חומרים).
2. מטב את הגדרות האולטרסאונד להדמיה והזרקה בהתאם לשלבים הבאים.
   1. התאם את עומק שדה הראייה לגודל המתאים לחיית המטרה על-ידי התאמת המחוונים המכוונים אנכית בצד ימין של המסך (איור 2). הגדרת העומק המרבית תהיה בדרך כלל כ-6-8 מ"מ לעכברים צעירים.
   2. כוונן את רווח גווני האפור על-ידי החלקת הלחצן לאורך הסרגל האופקי בתחתית המסך (איור 2). המטרה היא להתחיל עם תמונה שהיא רק מעט כהה יותר מאשר מראה "אפור" טיפוסי.
   3. התאם את אזור המוקד (חץ כחול בצד ימין של המסך, איור 2) לרמה הצפויה של בלוטת התימוס. עבור עכברים צעירים, זה יהיה סביב עומק של 4 מ"מ.
   4. אם ברצונך לצלם תמונה, בדוק את הפונקציונליות של תמונת החנות ואחסן לחצני קליפ כדי לוודא שניתן לשמור את התמונות כראוי לאורך כל ההליך. בצע זאת על-ידי הקשה על לחצן שמור קליפ בפינה השמאלית התחתונה של המסך או על-ידי הקשה על לחצן הקפאה ולאחר מכן הקשה על שמור תמונה (איור 2).
3. יש למרוח כמות קטנה (~1 מ"ל) של ג'ל אולטרסאונד על משטח המתמר (ראו טבלת חומרים) כשהוא זקוף, כשהוא מונח במחזיק מכשיר האולטרסאונד או בידיו של עוזר.
4. הכינו שדה סטרילי קטן ליד הפלטפורמה המחוממת. המיקום האופטימלי לכך הוא בדרך כלל בין הפלטפורמה למכשיר האולטרסאונד.
   1. רוקנו את הפריטים האלה לשדה הסטרילי: כיסוי בדיקה סטרילי, גומייה, כפפות סטריליות וג'ל אולטרסאונד סטרילי (ראו טבלת חומרים).
   2. עם הקמת השדה הסטרילי והפריטים במקום, לבשו את הכפפות הסטריליות.
   3. מניחים בזהירות את כיסוי הבדיקה הסטרילי מעל מתמר האולטרסאונד (כמו גם מעל הג'ל שהונח בתחילה על הבדיקה). לשמור על סטריליות ולגעת רק בכיסוי הסטרילי, שום דבר אחר. החליקו את הגומייה הסטרילית מעל כיסוי הבדיקה הסטרילי כדי לשמור אותה במקומה.
      הערה: מוקדי האוויר, ללא קשר לגודלם, עלולים להפריע להדמיית אולטרסאונד. לפיכך, חיוני להחיל את ג'ל האולטרסאונד בין המתמר לכיסוי הבדיקה הסטרילית, ועל גבי כיסוי הבדיקה כדי להבטיח ממשק ללא אוויר בין בדיקת האולטרסאונד לבין החיה.
   4. יש להניח כמות מתונה (2-3 מ"ל) של ג'ל אולטרסאונד סטרילי על המתמר.
      הערה: המשתמש מוכן כעת לצלם עכבר מורדם.

3. הדמיה ואיתור בלוטת התימוס

1. תוך שמירה על סטריליות, הניחו את הבדיקה בעלת ג'ל האולטרסאונד במאונך על החלק המחוטא של דופן החזה הקדמית של העכבר לצורך הדמיה ראשונית.
   1. קח רגע להסתכל על תמונת האולטרסאונד ולייעל אותה עוד יותר. חזור לשלב 2.2 והתאם את עצמך כדי לקבל מראה דומה לזה של איור 3.
2. סרוק את החזה הקדמי של העכבר במישור רוחבי. בצעו זאת על ידי החזקת המתמר במאונך והזזתו מעלה ומטה מהצוואר אל הבטן בתנועה דמוית מכחול או "סוחפת".
   הערה: הלב יהיה המבנה המזוהה ביותר בחזה בשל תנועתו המהירה ומראהו ה"קאמרית". ברגע שהלב ממוקם, זה יכול לשמש כנקודת התייחסות כדי לרכוש תמונה של בלוטת התימוס.
3. כאשר הלב מרוכז בשדה הראייה, טאטאו את המתמר מעט לכיוון הצוואר. רק עדיף על הלב, התימוס הוא נתקל בדרך כלל.
4. דמיינו את בלוטת התימוס כמבנה בילובי, פירמידלי, היפואקואי ("כהה" או "שחור" המופיע על המסך) שמרכזו בקו האמצע, קדמי לאבי העורקים ואחורי לעצם החזה (איור 3A).
5. שימו לב לשני המבנים השחורים העגולים (כלומר, "היפואקואיים") משני צדי החזה העליון.
   הערה: אלה הם הווריד הקאווה הדו-צדדי. אבי העורקים הוא מבנה היפואקואי מעוגל דומה בקו האמצע בין שני הוורידים. ניתן לזהות אותם בקלות על ידי תנועתם הפועמת.

4. הזרקת התימוס

1. במידת הצורך, יש למרוח יותר (2-3 מ"ל) ג'ל אולטרסאונד סטרילי על המתמר.
   הערה: כמות גדולה יחסית של ג'ל סטרילי על המתמר (בהשוואה לגודל בית החזה של העכבר) תשמש כ"כרית ג'ל" סביב דופן החזה של העכבר. זה יקטין את מספר ממצאי האולטרסאונד שנעשו על ידי אוויר בתוך שדה הראייה.
2. באמצעות בדיקת אולטרסאונד, אתר את החלק הרחב ביותר של בלוטת התימוס, שהוא בדרך כלל אתר היעד האידיאלי להזרקה. צפה מסלול מחט אופקי במיקום הנבחר.
   1. שימו לב היכן נמצאים כלי הדם העיקריים (SVCs ואבי העורקים) באתר זה. הימנע אלה במהלך ההזרקה.
   2. כלי הדם יהיו מבנים היפוכואיים, פועמים, כמתואר בשלב 3.7. אם אינכם בטוחים, השתמשו במצב דופלר בצבע כדי לבדוק אם יש זרימה בתוך כלי הדם (איור 4A). הפעל את מצב דופלר הצבע על-ידי הקשה על לחצן צבע על המסך.
   3. אם אחד מכלי הדם העיקריים (או הלב) צפוי להיות לאורך מסלול המחט הצפוי, בחר אזור יעד חדש או מצא גישה/מסלול אחר.
3. החזיקו את המתמר ביד אחת ובמחט אינסולין של 30 גרם (ראו טבלת חומרים) עם 10 מיקרוגרם של הזרקה ביד השנייה.
   הערה: ההזרקה תשתנה בהתאם לתכנון הניסוי. במחקר הנוכחי נעשה שימוש בתמיסת מלח עם מאגרי פוספטים, טריפן כחול או D-לוציפרין (0.1 מיקרוגרם/10 מיקרול).
4. כדי להתחיל בתהליך ההזרקה, הזז את המתמר לרוחב כך שהתימוס יהיה מחוץ למרכז בשדה הראייה של האולטרסאונד. ודא כי הצד השני של שדה הראייה מורכב בעיקר ג'ל אולטרסאונד ולא שום דבר אחר.
5. הניחו את קצה המחט בג'ל שמתחת למתמר והזיזו את המחט באיטיות עד שהיא תזוהה בצמוד לפני העור (איור 4B).
6. תוך כדי הדמיה רציפה של המחט תחת אולטרסאונד, יש להחדיר את המחט לבלוטת התימוס במסלול מלעורי, הרחק מכלי הדם.
   1. השתמש במסלול אופקי "קרוס תימוס" כדי למקם את קצה המחט באונה התימית בניגוד לאתר הכניסה. זה מסביר דליפה פוטנציאלית לאורך מערכת המחט (איור 5A).
7. ברגע שקצה המחט נמצא בתוך החלק הרצוי של בלוטת התימוס, הזריקו במהירות את התוכן (כגון 10 μL של טריפן כחול או D-לוציפרין, 0.1 מיקרוגרם/10 μL) מהמזרק 30 G תוך שימוש בהדמיה סונוגרפית.
   1. כדי לייצב את המזרק במהלך החדרת המחט והזרקתה, החזיקו את המזרק בין האגודל לאצבע השלישית ושלטו בבוכנה של המזרק באמצעות האצבע המורה.
8. הסר את המחט לאחר שכל התוכן הופקד.

5. ניטור לאחר הזרקה של בעלי חיים

1. מעבירים את החיה לכלוב ריק ומתבוננים עד שהיא חוזרת להכרה מספקת כדי לשמור על משכון החזה.
   הערה: התאוששות מלאה מההרדמה צפויה להתרחש תוך 2 דקות.
2. עקוב אחר בעל החיים במשך 10 דקות נוספות לאיתור סימני מצוקה, נשימה מאומצת או דימום.
   הערה: כאבים לאחר ההזרקה אינם צפויים, ובדרך כלל אין צורך בשיכוך כאבים לאחר ההזרקה.
3. לאחר שהתאושש לחלוטין ולאחר תקופת תצפית ללא אירועים לאחר ההזרקה, החזירו את החיה שהוזרקה לחברתם של בעלי חיים אחרים.

תוצאות

היישום המוצלח של טכניקה זו מסתמך על כמה צעדים מרכזיים שיש לעקוב אחריהם. ראשית, יש להבטיח זיהוי אמין של בלוטת התימוס עצמה. בעכברים צעירים, זה פשוט בגלל גודלה הגדול של הבלוטה (איור 3A). בעכברים מבוגרים או בעכברים מדוכאי חיסון, זה יכול להיות מאתגר יותר; עם זאת, זה עדיין אפשרי מאוד ...

Discussion

הזרקה ידנית חופשית מונחית אולטרסאונד היא טכניקה מדויקת ביותר להעברת חומרי לימוד לבלוטת התימוס בצורה יעילה ואספטית. לאחר העיקור הראשוני של העור באתר ההזרקה, נשמרת סטריליות במהלך ההליך הודות לשימוש בכפפות סטריליות, כיסויי בדיקת אולטרסאונד סטריליים וג'ל אולטרסאונד סטרילי. בניגוד לגישה המל...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aquasonic 100 Ultrasound Gel	Parker Laboratories (Fairfield, NJ, USA)	01-01	Sterile Ultrasound Transmission Gel
B6;CAG-luc, -GFP mouse	The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA)	025854	Bioluminescence cell source
BD Insulin Syringes with needle	Becton Dickinson (Franklin Lakes, NJ, USA)	328431	Ultra-fine needle - 12.7 mm, 30 G
C57BL/6 mouse - aged	The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA)	000664	age 6 months old; aged model
C57BL/6 mouse - young	The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA)	000664	age 4-6 weeks; young model
Chloraprep One-step 0.67 mL	CareFusion (El Paso, TX, USA)	260449	chlorhexidine gluconate applicator
Curity Cotton Tipped Applicator	Cardinal Health (Dublin, OH, USA)	A5000-2	Sterile, 6"
D-Luciferin	Gold Biotechnology (St Louis, MO, USA)	LUCK-1G
Isoflurane	Henry Schein (Melville, NY, USA)	1182097
IVIS Lumina X5	PerkinElmer (Melville, NY, USA)	n/a	In vivo bioluminescence imaging system
J:NU mouse	The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA)	007850	Athymic nude model
Kendall Hypoallergenic Paper Tape	Cardinal Health (Dublin, OH, USA)	1914C
Kimtech Surgical Nitrile Gloves	Kimberly-Clark Professional (Irving, TX, USA)	56892	Sterile Gloves
Nair Hair Remover Lotion	Church and Dwight (Trenton, NJ, USA)	n/a	Depilatory agent
NOD scid gamma (NSG) mouse	The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA)	005557	Immunodeficient model
Phosphate-Buffered Saline (PBS), 1x	Corning (Corning, NY, USA)	21-040-CV
Puralube Vet Ointment	Med Vet International	PH-PURALUBE-VET	Eye ointment
Sheathes	Sheathing Technologies (Morgan Hill, CA, USA)	10040	Sterile Ultrasound Probe Covers
Sure-Seal Induction Chamber	Braintree Scientific (Braintree, MA, USA)	EZ-17 85	Anesthesia induction chamber
Transducer MX550D	FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada)	n/a	Vevo 3100 imaging probe (25-55 MHz, Centre Transmit: 40 MHz)
Trypan Blue, 0.4% solution in PBS	MP Biomedicals (Solon, OH, USA)	91691049
Vevo 3100 Imaging System	FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada)	n/a	Ultrasound imaging system
Vevo 3100 Lab Software	FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada)	n/a	Version 3.2.7 for imaging and analysis
Vevo Compact Dual Anesthesia System	FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada)	n/a	Tabletop isoflurane-based anesthesia unit
Vevo Imaging Station	FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada)	n/a	Procedural platform