JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן אנו מדווחים על פרוטוקול לכימות והתמיינות של לימפוציטים B שריר הלב בהתבסס על מיקומם בחלל התוך-וסקולרי או האנדותל באמצעות ציטומטריה של זרימה.

Abstract

גוף הולך וגדל של ראיות מראה כי לימפוציטים מסוג B ממלאים תפקיד חשוב בהקשר של פיזיולוגיה של שריר הלב והסתגלות שריר הלב לפציעה. עם זאת, הספרות מדווחת על נתונים מנוגדים על שכיחות תאי B שריר הלב. דווח כי תאי B הם גם בין תאי החיסון השכיחים ביותר בלב המכרסם או שהם נוכחים, אך בשכיחות נמוכה משמעותית מתאי מיאלואידים, או שהם נדירים למדי. באופן דומה, מספר קבוצות תיארו כי מספר תאי B שריר הלב עולה לאחר פגיעה איסכמית חריפה בשריר הלב, אך קבוצה אחת לא דיווחה על שינויים במספר תאי B של שריר הלב הפגוע. יישום שיטה משותפת הניתנת לשחזור כדי להעריך את השכיחות של תאי B שריר הלב הוא קריטי כדי ליצור הרמוניה בין תצפיות מקבוצות מחקר שונות ובכך לקדם את קידום המחקר של אינטראקציות שריר הלב של תאי B. בהתבסס על הניסיון שלנו, התצפיות המנוגדות לכאורה המדווחות בספרות נובעות ככל הנראה מהעובדה שתאי B של שריר הלב הם ברובם תוך-וסקולריים ומחוברים לאנדותל המיקרו-וסקולרי. לכן, מספר תאי B שהתאוששו מלב מורין רגיש להפליא לתנאי הזלוף המשמשים לניקוי האיבר ולשיטת העיכול המשמשת. כאן אנו מדווחים על פרוטוקול אופטימלי המביא בחשבון את שני המשתנים הקריטיים הללו באופן ספציפי. פרוטוקול זה מעצים ניתוח מבוסס ציטומטריה של זרימה הניתנת לשחזור של מספר תאי B שריר הלב ומאפשר לחוקרים להבחין בין תאי B מיו-וסקולריים חוץ-וסקולריים לעומת תאי B תוך-וסקולריים.

Introduction

לימפוציטים מסוג B הם תאים חיסוניים מיוחדים מאוד הממלאים תפקיד חשוב הן בתגובה החיסונית הנרכשת והן בתגובה החיסונית המולדת1. ישנן שתי אוכלוסיות עיקריות של תאי B: אוכלוסייה קטנה יותר של תאי B1 המיוצרים בעיקר במהלך החיים העובריים, ואוכלוסייה מוקדמת של תאי B2 המיוצרים בחיים הבוגרים במח העצם1. לאחר ההתבגרות במח העצם, תאי B נודדים לאיברי לימפה ראשוניים ומשניים. משם הם חוזרים ללא הרף בין איברי הלימפה העוברים דרך כלי הדם וכלי הלימפה2. תאי B מבטאים נוגדנים ספציפיים על פני השטח שלהם, המתפקדים כקולטנים. כאשר תאי B נתקלים באנטיגן שנקשר לקולטן שלהם, ניתן להפעיל אות מפעיל. תאי B פעילים נודדים לרקמה שבה נמצא האנטיגן או חוזרים למח העצם, שם הם יכולים להבשיל לתאי פלזמה המייצרים נוגדנים 3,4.

לאחרונה, זה כבר מוערך כי הלב מכיל אוכלוסייה גדולה של תאי B. מחקרים במכרסמים הראו כי תאי B מאכלסים את הלב בשלב מוקדם במהלך ההתפתחות העוברית5, וכי תאי B הקשורים לשריר הלב הם בעיקר תאי B2 תוך-וסקולריים, נאיביים, הנצמדים לאנדותל6,7, עם אחוז קטן של תאי B1 7. ישנם עדיין תחומים רבים של אי ודאות, אך הנתונים הזמינים מצביעים על כך שתאי B ממלאים תפקיד חשוב הן בלב התמים והן בהקשר של הסתגלות שריר הלב לפציעה.

מחקרים בלב המורין התמים הראו כי בנקודת ההתחלה תאי B של שריר הלב ממוקמים בעיקר בחלל התוך-וסקולרי, דבוקים לאנדותל (>95% מתאי ה-B הלבביים של מורין נמצאו ממוקמים בחלל התוך-וסקולרי). נמצא כי לתאי B אלה יש דפוסי ביטוי גנים שונים מאלה של תאי B במחזור הדם שבודדו מהדם ההיקפי. ניתוח של לבבות תמימים מבעלי חיים עם מחסור בתאי B ובקרות סינגניות מצאו שלבעלי חיים חסרי תאי B היו לבבות קטנים יותר ולחלקפליטה גבוה יותר 6. כל הראיות הללו מצביעות על כך שתאי B עשויים לווסת את גדילת שריר הלב ו/או את תפקוד שריר הלב, וכי לא רק תאי B אינטרסטיציאליים אלא גם תוך-וסקולריים יכולים להיות אחראים לתצפיות כאלה. כמו כן, נמצאו תאי B המווסתים את הפנוטיפ של מקרופאגים המתגוררים בשריר הלב8.

מספר מחקרים הראו כי תאי B ממלאים תפקיד חשוב בהקשר של הסתגלות שריר הלב לפציעה 8,9,10,11,12,13. תאי B מצטברים באופן חולף בלב הפגוע, ככל הנראה באמצעות מנגנון תלוי CXCL13-CXCR511,13. משם, תאי B מקדמים שיפוץ לב שלילי באמצעות מספר מנגנונים הכוללים גיוסמונוציטים בתיווך ציטוקינים 9,12. בנוסף, תאי B יכולים לייצר נוגדנים נגד חלבוני לב שיכולים לקדם את הרחבת הנזק הלבבי ושיפוץ לב שלילי באמצעות מספר מנגנונים 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25 . תאי B יכולים גם להפעיל השפעה מגנה על הלב הפגוע באמצעות הפרשת IL-1010.

ככל שמספר הקבוצות החוקרות את תפקידם של תאי B בלב התמים והפצוע גדל, חשוב יותר ויותר להגדיר פרוטוקולים משותפים כדי לכמת ולהעריך כראוי תאי B שריר הלב ובכך למנוע חוסר עקביות שכבר החלו להופיע בספרות. עד כה דווח כי תאי B הם כאחד מתאי החיסון השכיחים ביותר בלב המכרסם7 ונמצאים בשכיחות נמוכה משמעותית מאשר תאים מיאלואידים 26,27, או נדירים למדי28. באופן דומה, מספר קבוצות תיארו כי מספר תאי B שריר הלב עולה לאחר פגיעה איסכמית חריפה בשריר הלב 7,9,13, אך קבוצה אחת לא דיווחה על שינויים במספר תאי B של שריר הלבהפגוע 29. מחקרים על תאי חיסון לבביים כמעט ולא נותנים פרטים על תנאי פרפוזיה ואין הסכמה על תנאי העיכול. מכיוון שבלב מכרסם חלק גדול מתאי B הם תוך-וסקולריים ומיצוי תאי מערכת החיסון משריר הלב תלוי מאוד בשיטת העיכול שבה נעשה שימוש, ההבדלים המדווחים בספרות עשויים להיות תוצאה של הבדלים בזליגת איברים ובעיכול רקמות.

מוצגת כאן שיטה מפורטת לכימות מבוסס ציטומטריה של זרימה של תאי B שריר הלב של מורין, אשר ממקסמת את התשואה של התאוששות תאי B על ידי אופטימיזציה של תנאי הזלוף והעיכול ומאפשרת הבחנה של תאי B תוך-וסקולרייםלעומת תאי B חוץ-וסקולריים 6. פרוטוקול זה הוא התאמה ואופטימיזציה של פרוטוקולים דומים אחרים המבחינים בין תאי חיסון תוך-וסקולריים ואינטרסטיציאליים 28,30,31.

בפרוטוקול זה, אנו מבצעים סטנדרטיזציה של פרפוזיה שריר הלב כדי לחסל תאי B שצפים בחלל התוך-וסקולרי מבלי להסיר תאי B רלוונטיים ביולוגית שנדבקו לאנדותל המיקרו-וסקולרי. יתר על כן, בהתבסס על פרוטוקולים קודמים שתיארו את השימוש בהזרקה תוך ורידית של נוגדנים כדי להבחין בין תאי חיסון תוך-ורידיים לתאי חיסון אינטרסטיציאליים32, ותוך ניצול העובדה שתאי B מבטאים את סמן פני השטח B22033, אנו מדגימים כיצד להבחין בין תאי B תוך-וסקולריים לעומת תאי B חוץ-וסקולריים באמצעות הזרקה תוך-וסקולרית של נוגדן ספציפי ל-B220 מיד לפני הקרבת בעלי החיים וזליגת הלב. פרוטוקול זה רלוונטי למחקרו של כל מדען המעוניין לכלול ניתוח של תאי B שריר הלב בלב התמים והפצוע. יישום נרחב של פרוטוקול זה יפחית את חוסר העקביות בין קבוצות המחקר, יאפשר ניתוח של שינויים בבריכות תאי B תוך-וסקולריים וחוץ-וסקולריים, ובכך יחזק את קידום התגליות בתחום האימונולוגיה של הלב.

לסיכום, הפרוטוקול מייצג זרימת עבודה אופטימלית לכימות וניתוח תאי B שריר הלב באמצעות ציטומטריית זרימה, ובמקביל להבחין בין תאים הממוקמים בחלל החוץ-וסקולרי לבין החלל התוך-וסקולרי.

Protocol

כל הניסויים המתוארים בכתב יד זה בוצעו באישור IACUC בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת ג'ונס הופקינס.

1. הכנות

  1. הכן את מאגר FACS, כמתואר בטבלה 1.
  2. ודא שיש מספיק CO2 כדי להרדים את בעלי החיים.
  3. הכינו את חלל הנתיחה (הניחו את משטח הספסל והניחו את כלי הקלטת והדיסקציה בקרבת מקום).
  4. תייג את הצינורות של 15 מ"ל, שים 3 מ"ל של HBSS עם סידן ומגנזיום בכל צינור (ראה טבלת חומרים) והנח אותם על קרח (צינור אחד לכל לב וצינור נוסף לקבוצת הפניה/בקרת ציטומטריה של זרימה). כמו כן, מלאו את צלחות הפטרי הקטנות (35 מ"מ) ב-HBSS.
  5. הפעל את השייקר מבוקר הטמפרטורה, הגדר אותו ל -37 מעלות צלזיוס, וצנן מראש את הצנטריפוגה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
  6. הכינו את משאבת המזרק והגדירו את קצב הזרימה ל-3 מ"ל/דקה. מלאו מזרק של 20 מ"ל ב-HBSS, הגדילו את קו הצינור במאגר והסירו את כל הבועות.

2. מכתים תוך-וסקולריים של תאי B (in vivo)

  1. שקלו עכבר זכר בן 12 שבועות מזן C57BL/6J. העמיסו מזרק אינסולין בנפח 3/10 סמ"ק עם 100 מיקרון של דילול הנוגדן B220 (1:10, ב-PBS). מכסים את המזרק ברדיד אלומיניום להגנה מפני אור.
  2. הרדמה של עכבר אחד.
    1. החל הזרקה intraperitoneal של 2% 2,2,2-tribromoethanol עם מינון של 400 מ"ג / ק"ג ולחכות 10-20 דקות.
      הערה: עקוב אחר הנשימה והתנועה של העכבר. ברגע שהעכבר מפסיק לזוז, לעורר כאב על ידי צביטה של הבוהן; היעדר רפלקס נסיגה מצביע על הרדמה נאותה.
    2. אם לא הושגה הרדמה מספקת במהלך 20 דקות, ניתן לתת מנה נוספת של חומר הרדמה במינון של 100 מ"ג/ק"ג, ויש לבצע הערכה של קינטיקה של עכברים, רפלקס גמילה ונשימה כל 5 דקות.
  3. הניחו את העכבר על ספסל המעבדה על משטח ספסל המוטה לכיוון צד אחד, משכו בעדינות את עור הגב, ולחצו מעט את הגוף על הספסל כדי לגרום לעין לבלוט.
  4. הזריקו את הנוגדן המדולל B220 משלב 2.1 על ידי הזרקה רטרואורביטלית.
    1. הכניסו את המזרק לעין בזווית של 45° מהמישור הסגיטלי של ראש העכבר. לאט לאט להזריק את הפתרון. אם מורגשת התנגדות, הסר את המזרק והזן שוב. המתן 2 דקות.
      הערה: זמן הדגירה הממושך יסכן את היכולת להבחין בין תאי B תוך-וסקולריים לעומת חוץ-וסקולריים, שכן הוא ייתן זמן לנוגדן המוזרק להתפזר מחוץ לכלי הדם.
  5. להרדים את העכבר בהתאם לתקנות IACUC.
    1. פתח את זרימת CO2 לתא המתת החסד בקצב של 0.5 ליטר לדקה, או את קצב הזרימה המומלץ בהתבסס על גודל התא שלך.
    2. הניחו את העכבר בתא לזמן המומלץ, וודאו שהוא כבר לא נושם. הסר אותו ולבצע פריקת צוואר הרחם כשיטה משנית של המתת חסד.
    3. לאחר שהעכבר מורדם, המשך מיד לקצירת איברים וזליפה.

3. אוסף לב

  1. פתח חזה.
    1. החזק את העור של העכבר עם מלקחיים באזור epigastric. צרו פתח בקוטר 2 מ"מ בעור באמצעות מספריים והשתמשו במלקחיים כדי לקלף את העור ולחשוף את שכבת החיתולית, שכבה שקופה ומבריקה, של החזה והבטן. חותכים באפיגסטריום דרך החיתולית והצפק כדי לפתוח את דופן הבטן ולחשוף את התהליך הקסיפואידי. מהדק את תהליך xiphoid באמצעות מלקחיים hemostatic.
    2. בעזרת המספריים, בצעו חתך אנכי דרך דופן בית החזה בגובה קו אמצע העצם בכל צד והרימו את דופן בית החזה הקדמית כדי לחשוף את תכולת המדיאסטינום, תוך שימוש במלקחיים המוסטטיים כמשקולת לשמירה על הפתח.
  2. זילוף לב ומיצוי.
    1. באמצעות מלקחיים, להסיר כל רקמת שומן או thymic סביב הלב.
    2. החזיקו את אבי העורקים היטב מאחור באמצעות מלקחיים. מכניסים את מחט המזרק (25 גרם) לתוך קצה הלב. עם 3 מ"ל של HBSS בקצב של 3 מ"ל לדקה.
      הערה: עקוב אחר ההזלפה. הכבד צריך למלא, ודם בכלי הדם הכליליים צריך להיות מוסר לחלוטין. מומלץ להשתמש במשאבת מזרק מכוילת ל-1 מ"ל/דקה כדי לשמור על זרימה יציבה.
    3. חותכים את אבי העורקים באמצעות מספריים ומוציאים את הלב. לשטוף את הלב בצלחת פטרי עם HBSS כדי להסיר את כל הדם שנותר. באמצעות מספריים ומלקחיים, להסיר את השומן, רקמת החיבור ואת בלוטת התימוס, ולייבש את הלב. שקלו את הלב המבודד ושימו לב למשקל במיליגרמים. טחנו את הלב בטמפרטורת החדר לחתיכות קטנות (1-2 מ"מ) בעזרת להב.
      הערה: לבבות עכברים בוגרים עשויים לשקול בין 0.090-0.210 מ"ג.
    4. מדוד את המסה של רקמת הלב והניח 60 מ"ג של הלב הטחון כדי להתעכל בצינור 15 מ"ל עם 3 מ"ל של HBSS. שמור על רקמת הלב הנותרת והניח בצינור שכותרתו "רקמת בקרת ייחוס"; זה ישמש לבקרת פיצויים עבור אות מת-חי ו- autofluorescence.

4. עיכול לב וכתמי תאים

  1. הוסיפו אנזימים לכל צינור המכיל רקמה טחונה (ראו טבלה 1). הוסיפו 0.5 μL/מ"ג של DNase 1 (300 יחידות עבור 60 מ"ג של רקמת לב), 0.5 μL/מ"ג של קולגןאז II (625 יחידות עבור 60 מ"ג של רקמת לב), ו-0.2 μL/mg של היאלורונידאז (50 יחידות עבור 60 מ"ג של רקמת לב) לצינור.
  2. מניחים את תגובת העיכול בשייקר למשך 30 דקות ב-300 סל"ד. כוונן את מתלה השייקר לכ-25° של שיפוע.
  3. הוסף 7 מ"ל של HBSS לכל אחד מצינורות התגובה של 15 מ"ל וצנטריפוגה בגודל 250 x גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס עם תאוצה ושבירה מוגדרות למתון או איטי. יש לנטרל את ה-supernatant ולהשהות כל כדור ב-5 מ"ל של חיץ ליזיס ACK כדי להסיר תאי דם אדומים. דגירה בחיץ תזה ACK במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  4. הוסיפו 10 מ"ל של PBS לכל צינור, ערבבו ולאחר מכן סננו לצינור של 50 מ"ל עם מסננת של 40 מיקרומטר. ודא שכל הלכלוך נמצא בתוך תא המסנן. יש לרסק כל פסולת על המסנן באמצעות בוכנה של מזרק עד שהוא תלוי לחלוטין בתוך תא המסנן.
  5. הוסף PBS דרך המסנן עד נפח מגיע 25 מ"ל לכל לב; פעולה זו תאפשר לתאים המושעים לעבור דרך המסנן. הוסף 25 מ"ל נוספים של PBS לצינור רקמת בקרת הייחוס וחלק את הנפח לצינורות שונים (25 מ"ל כל אחד). תייג את אחד הצינורות "Unstained" ואת השני כמו "לחיות מת". צנטריפוגה ב 250 x גרם במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
    הערה: בשלב זה, הכינו את הדילול לכתם החי-מת (דילול: 1:500 ב-PBS אחד).
  6. דקאנט את הסופר-נטנט, השהה את הכדור בצינור Unstained ב-100 μL של PBS וכל אחד מהכדורים האחרים ב-100 μL של דילול הכתם החי-מת. דגירה על קרח במשך 30 דקות בחושך, מכסה את דלי הקרח עם רדיד אלומיניום.
  7. הוסף 500 μL של מאגר FACS לכל דגימה והעבר אותו לצינור FACS עם תווית דרך מסנן של 40 מיקרומטר. צנטריפוגה צינורות FACS ב 250 x g במשך 5 דקות ב 4 °C. השליכו את הסופר-נטנט. השהה את הכדור ב-500 μL של מאגר FACS.
  8. הוסף 50 μL של תמיסת חסימת Fc (ראה טבלה 1) לכל צינור, למעט צינורות לא מוכתמים ומתים חיים. מערבבים ודוגרים במשך 5 דקות.
  9. הוסיפו תמיסת תערובת נוגדנים של 50 μL (ראו טבלה 1) לכל צינור, למעט הצינורות Unstained ו-Live-dead, ודגרו במשך 30 דקות בחושך, תוך כיסוי דלי הקרח ברדיד אלומיניום.
  10. הוסף 2 מ"ל של חיץ FACS לכל צינור וצנטריפוגה ב 250 x גרם במשך 5 דקות ב 4 °C. הסר את ה-supernatant והשעה מחדש ב-300-500 μL של מאגר FACS.

5. ציטומטריה של זרימה

  1. הגדרות בקרת מכשירים.
    הערה: בפרוטוקול זה הדגימה מנותחת באמצעות ציטומטר זרימה של 4 לייזרים Cytek Aurora. עוד ציטומטר זרימה מתאים יכול לשמש כדי לזהות את סמני העניין.
    1. פתח את תוכנת בקרת המכשירים (ראה טבלת חומרים). בחלק העליון של החלון, בחר את הכרטיסייה רכישה ולחץ על חדש +. יוצג חלון בשם ' צור ניסוי חדש' .
    2. במקטע ספריה, בשדה סוג לסינון, הקלד PE, PerCP-Cy5.5, BV421, Alexa Fluor 700 ו- Zombie Aqua, לחיצה על הוסף לאחר הקלדת כל אחד מהם. יש לראות את שמות הפלואורופור מימין. לאחר מכן לחץ על הבא כדי להמשיך לכרטיסיה קבוצה .
    3. בכרטיסיה קבוצה , לחץ על הסמל עם צינור כדי להוסיף את הלב לניתוח.
    4. לחץ על הקבוצה + הפניה וחלון יוצג. בעמודת התג הפלואורסצנטי בחר Zombie Aqua, ובעמודת סוג הבקרה בחר תאים ולאחר מכן לחץ על שמור.
    5. לחץ על הכרטיסייה הבא > סמנים ; תוצג טבלה עם שמות הפלואורופורים. הקלד את סמן התא המתאים בשורה הראשונה של כל עמודת פלואורופור והקלד Enter: CD45 עבור PerCP-Cy5.5; CD19 עבור BV421; CD11b עבור אלקסה פלואור 700; B220 עבור PE; וחיים מתים עבור זומבי אקווה.
    6. לחץ על הבא פעמיים כדי לעבור לכרטיסיה רכישה . ב'אירועים לתיעוד' של קבוצת הניסוי, הקלד 10,000,000, ובאותו שדה עבור קבוצת הייחוס סוג שורה 200,000. לחץ על שמור ופתח. ההגדרות האחרות צריכות להישאר כברירת מחדל, זמן עצירה ל- 10,000 והפסקת עוצמת קול ל- 3,000.
    7. בפינה השמאלית התחתונה לחץ על בקרת מכשירים. הגדר מתח ל- FSC-50, SSC-175, SSC-B-175. לאחר מכן, בחר את פקד הרכישה. עבור האפשרות קצב זרימה , בחר גבוה מהתפריט הנפתח.
  2. רכוש דוגמאות ייחוס עם ציטומטר ובטל את המיקס בתוכנה.
    1. מערבבים את צינור הלב הלא מוכתם ומניחים אותו בבטחה על יציאת הזרקת הדגימה (SIP). ודא שחץ המחוון הירוק מצביע על הדוגמה הנכונה ולאחר מכן לחץ על התחל בחלונית בקרת רכישה של תוכנת הציטומטר והמתן עד שהאירועים יתועדו. עשו את אותו הדבר עבור רקמת הלב המוכתמת ב-Live-dead.
    2. בחר בתפריט Unmix והגדר את הפקדים הבאים:
      1. בחר את תיבות הסימון עבור PE, PerCP-Cy5.5, BV421 ו- Alexa Fluor 700 בעמודה מהספרייה. ודא ש-Zombie Aqua אינו מסומן באותה עמודה. בחלק התחתון, בדוק את האפשרות של Autofluorescence כתג פלואורסצנטי.
      2. לחץ על הבא כדי להמשיך לכרטיסייה זיהוי אוכלוסיות חיוביות/שליליות . בכרטיסייה זו תוצג עלילה של FSC-A לעומת SSC-B-A. לחץ וגרור את נקודות המצולע כדי לבחור אזור בין 1.0 M ל- 4.0 M בציר FSC-A, ובין 0.2 M ל- 3.0 M בציר SSC-B-A.
      3. בחלקה הבאה מימין, V5-A יוצג על ציר X. הזז את השערים כדי לבחור מחצית מהפסגה בקצה הימני כחיובי ואזור בצד שמאל של העלילה כשלילי. בעלילה שכותרתה קבוצת ייחוס - לא מוכתמת, בחר אוכלוסייה בטווח דומה. לשם כך אין צורך להגדיר את השלילי החיובי-שלילי.
  3. לרכוש דגימות ניסיוניות.
    1. עבור כל צינור המכיל דגימה לעכבר בודד, מערבלים את הצינור ומניחים אותו בבטחה על ה- SIP. ודא שחץ החיווי הירוק מצביע על הדגימה הנכונה, ולאחר מכן לחץ על התחל בחלונית בקרת רכישה של תוכנת הציטומטר והמתן עד שהאירועים יתועדו.
  4. אסטרטגיית גיטינג.
    1. בחר את הכרטיסיה ברירת מחדל לגליון עבודה לא מעורבב . צור מתווה FSC-A לעומת SSC-A באמצעות הכלי 'התוויית נקודה' למעלה. בחר אירועים גבוהים מ- 0.4 M בציר FSC-A וגבוהים מ- 0.8 M בציר SSC-A באמצעות כלי הבחירה מצולע. לחץ פעמיים בבחירה זו ותוצג עלילה חדשה.
    2. מתוך העלילה החדשה שנוצרה, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על תווית ציר X ובחר AF-A; לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על תווית ציר Y ובחר כתם חי מת. לחץ על כלי בחירת המלבן למעלה ובחר את כל האירועים מתחת ל-105 על ציר החי-מת המתאים לאות החי-מת התחתון. לחץ פעמיים בבחירה זו ותוצג עלילה חדשה.
    3. בחלקה החדשה, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני כדי לבחור PerCP-Cy5.5-A עבור ציר X ו- SSC-A עבור ציר Y. בעזרת הכלי בחירת מלבן, בחר באירועים הגבוהים מ- 104 בציר PerCP-Cy5.5-A המתאימים לתאים החיוביים של CD45. לחץ פעמיים על הבחירה ותוצג עלילה חדשה.
    4. בהתווייה החדשה, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני כדי לבחור FSC-A עבור ציר X ו- FSC-H עבור ציר Y. באמצעות כלי הבחירה מצולע בחר את האירועים הבאים אחרי מגמה שבה ערך FSC-A וערך SSC-A זהים; בכך יוסרו כפילי התאים והאוכלוסייה בבחירה תיקרא אוכלוסיית CD45+. לחץ פעמיים על הבחירה כדי להציג מגרש חדש עם אוכלוסיית CD45+.
    5. מתוך עלילת האוכלוסייה CD45+, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני כדי לבחור BV421 בציר X לעומת SSC-A בציר Y. בעזרת הכלי בחירת מצולע, בחר באוכלוסייה מימין לציר BV421 . זוהי אוכלוסיית תאי B. לחץ פעמיים באוכלוסייה זו כדי ליצור שתי חלקות חדשות עם אוכלוסיית תאי B.
      1. לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני כדי להגדיר את עלילת תאי B הראשונה עם PE-A בציר X ו- BV421-A בציר Y. האוכלוסייה מימין מתאימה לתאי B התוך-וסקולריים, והאוכלוסייה משמאל מייצגת את תאי ה- B הבין-ביתיים. השתמשו בכלי בחירת מצולע כדי לבחור בשניהם.
      2. לחץ לחיצה ימנית כדי להגדיר את עלילת תאי B השנייה עם Alexa Fluor 700-A על ציר X ו - SSC-A על ציר Y. האוכלוסייה משמאל מתאימה לתאי CD11b, והאירועים מימין (אם בכלל) תואמים לתאי CD11b+.
      3. לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על כל בחירה ולאחר מכן לחץ על מאפייני שער. לחץ על ספירה ועל % הורה כדי להציג את הגדלים והאחוזים. תעד את מספר האירועים והאחוזים לניתוח נתונים נוסף.

תוצאות

לאחר השלמת הרכישה ואיסוף כל האירועים, יש לנתח את הנתונים על פי תרגול ציטומטריה של זרימה סטנדרטית. מוקד הניתוח ישתנה בהתאם למטרה האישית של כל ניסוי. במקרה זה, כימות של תאי B תוך-וסקולריים וחוץ-וסקולריים נרדף, והוא בא לידי ביטוי כמספר התאים למ"ג רקמה.

בעת שימוש בציטומטר ספקטרלי, ...

Discussion

גוף הולך וגדל של ראיות מצביע על כך שתאי B ממלאים תפקיד חשוב בהקשר של פיזיולוגיה של שריר הלב ושיפוץ/הסתגלות שריר הלב לפציעה 7,8,9,10,11,12,13,36. ציטומטר...

Disclosures

לואיג'י אדמו הוא מייסד שותף של i-Cordis, LLC, חברה המתמקדת בפיתוח מולקולות אימונומודולטוריות לטיפול באי ספיקת לב, עם עניין ספציפי בנגזרות של התרופה המווסתת תאי B pirfenidone. לשאר המחברים אין קונפליקטים להצהיר.

Acknowledgements

מחקר זה מומן על ידי מענקי NHLBI 5K08HLO145108-03 ו- 1R01HL160716-01 שהוענקו ללואיג'י אדמו.

ציטומטר זרימת אורורה ששימש לפיתוח מחקר זה מומן על ידי NIH Grant S10OD026859. אנו מכירים בתמיכתה של ליבת הציטומטריה של זרימת JHU Ross.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Alexa Fluor 700 anti-mouse/human CD11b Antibody101222BioLegend100 µg 200 µL
(CellTreat 29481) Cell Strainer, 40 µm, BlueQBIAP303Southern Labware
0.5 mL Natural Microcentrifuge Tube1605-0000SealRite, USA Scientific
0.9% Sodium Chloride Injection, USP114-055-101Quality Biological0.90%
1.5 mL Natural Microcentrifuge Tube1615-5500SealRite, USA Scientific
10 µL Graduated TipOne Filter Tips11213810USA Scientific
1000 µL Graduated TipOne Filter Tips11267810USA Scientific
15 mL Centrifuge Tube, Plug Seal Cap, Polypropylene, RNase-/DNase-free430052Corning
1-Way Stop Valve, PolycarbonateSVPT951ECT Manufacturing
2,2,2-TribromoethanolT48402Sigma-Aldrich
200 µL Graduated TipOne Filter Tips11208810USA Scientific
3-Way Stop Valve, PolycarbonateSVPT953ECT Manufacturing
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube, 12 x 75 mm style352054Falcon, a Corning Brand
50 mL Centrifuge Tube, Plug Seal Cap, Polypropylene, RNase-/DNase-free430290Corning
ACK (Ammonium-Chloride-Potassium) Lysing Buffer118-156-101Quality BiologicalOsmolality: 290 + or -5% mOsm/Kg H20
Adapter 4x50ml, for 250 mL rectangular bucket in Rotor A-4-635810759005Eppendorf
Adapter for 15 mL Centrifuge Tubes, 9 Tubes per Adapter, Conical Bottom for use with Rotor Model A-4-6222638289Eppendorf
Adapter for 15 round-bottom tubes 2.6 – 7 mL, for 250 mL rectangular bucket in Rotor A-4-6222638246Eppendorf
Aluminum Foil 12 in x 75' Roll .0007UPC 109153Reynolds Wrap
Anesthesia Induction Chamber - MouseRWD-AICMV-100Conduct Science
BD Luer Slip Tip Syringe with attached needle 25 G x 5/8 in., sterile, single use, 1 mL309626BD Becton, Dickinson and Company
Brandzig Ultra-Fine Insulin Syringes 29G 1cc 1/2" 100-PackCMD 2613Brandzig
Brilliant Violet 421 anti-mouse CD19 Antibody115537BioLegend50 µg/mL
CAPS for Flow Tubes w/strainer mesh 35 µm, Dual position for 12 x 75 mm tubes, sterileT9009Southern Labware
Carbon Dioxide USP E CGA 940 CD USPEAirGas USA
Cole-Parmer Essentials Low-Form Beaker, Glass, 500 mLUX-34502-46Cole-Parmer
Collagenase 2LS004176Sigma-Aldrich
Connector brass chrome plated 1/4" female NPT x 1/4" barbY992611-AGAirGas USA
Cytek Aurora Flow CytometerCytek Biosciences
Diss 1080 Nipple 1/4 BARB CPM-08-12AirGas USA
DNase I - 40,000 UD4527Sigma-Aldrich
Easypet 3 - Electronic Pipette Controller4430000018Eppendorf
Electronic Balance, AX223/E30100606Ohaus Corp.
Eppendorf 5810R centrifuge5810REppendorf
Eppendorf Research plus 1-channel variable pipettesEppendorf
FlowJo 10.8.1BD Becton, Dickinson and Company
GLACIERbrand, triple density Ice Pan (IPAN-3100)Z740287Heathrow Scientific
HBSS (1x) - Ca2+ [+] Mg2+ [+]14025076gibco1x
HyaluronidaseH3506Sigma-Aldrich
Kelly Hemostats, Straight13018-14Fine Science Tools
Luer Slip Syringe sterile, single use, 20 mL302831BD Becton, Dickinson and Company
M1 Adj. Reg 0-100 PSI/CGA940M1-940-PGAirGas USA
McKesson Underpads, Moderate4033-CS150McKesson
Navigator Multi-Purpose Portable BalanceNV2201Ohaus Corp.
PBS pH 7.4 (1X) Ca2+ [-] Mg2+ [-]10010023gibco1x
PE anti-mouse/human CD45R/B220 Antibody103208BioLegend200 µg/mL
PerCP/Cyanine5.5 anti-mouse CD45 Antibody103132BioLegend100 µg 500 uL
Petri dish, Stackable 35 mm x 10 mm Sterile PolystyreneFB0875711YZFisher Scientific
Pkgd: Diss 1080 Nut/CO2/CO2-02M08-1AirGas USA
Powerful 6 Watt LED Dual Goose-Neck IlluminatorLED-6WAmScope
PrecisionGlide Needle 25 G x 5/8 (0.5 mm x 16 mm)305122BD Becton, Dickinson and Company
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) Clone 2.4G2 (RUO)553141BD Becton, Dickinson and Company Biosciences0.5 mg/mL
R 4.1.1The R Foundation
Razor Blades9501250000Accutec Blades Inc
Regulator analytical two stage 0-25 psi delivery CGA320 3500 psi inletY12244A320-AGAirGas USA
Rotor A-4-62, incl. 4 x 250 mL rectangular bucketsRotor A-4-62Eppendorf
Serological pipette, plugged, 10 mL, sterile, non-pyrogenic/endotoxin-free, non-cytotoxic, 1 piece(s)/blister86.1254.001Sarstedt AG & Co KG
Sigma label tapeL8394Sigma-Aldrich
SpectroFlo 3.0.0Cytek Biosciences
Spex VapLock Luer Fitting, PP, Straight, Male Luer Lock x 1/8" Hose Barb; 1/EAMTLL230-6005Spex
Std Wall Lab Tubing, Size S2, Excelon, 1/8" ID x 3/16" OD x 1/32" Wall x 50' LongCG-730-003Excelon Laboratory
Syringe PP/PE without needle, 3 mLZ683566Millipore Sigma
Syringe pump55-1199 (95-240)Harvard Apparatus
Thomas 3-Channel Alarm Timer TM105009371W13Thomas Scientific
Tube Rack, 12 positions, 6 for 5.0 mL and 15 mL tubes and 6 for 25 mL and 50 mL tubes, polypropylene, numbered positions, autoclavable30119835Eppendorf
Tube Rack, 12 positions, for 5.0 mL and 15 mL tubes, polypropylene, numbered positions, autoclavable30119827Eppendorf
TYGON R-3603 Laboratory Tubing, I.D. × O.D. 1/4 in. × 3/8 in.T8913 (Millipore Sigma)Tygon, Saint-Gobain
Vortex-Genie 2SI-0236Scientific Industries, Inc.
VWR Dissecting Forceps with Guide Pin with Curved Tips89259-946Avantor, by VWR
VWR Dissecting Scissors, Sharp Tip, 4½"82027-578Avantor, by VWR
VWR Incubating Orbital Shaker, Model 3500I12620-946Avantor, by VWR
Zombie Aqua Fixable Viability Kit423102BioLegend

References

  1. Adamo, L., Rocha-Resende, C., Mann, D. L. The emerging role of B lymphocytes in cardiovascular disease. Annual Review of Immunology. 38, 99-121 (2020).
  2. Gowans, J. L., Knight, E. J. The route of re-circulation of lymphocytes in the rat. Proceedings of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences. 159 (975), 257-282 (1964).
  3. Kunkel, E. J., Butcher, E. C. Chemokines and the tissue-specific migration of lymphocytes. Immunity. 16 (1), 1-4 (2002).
  4. Tanaka, T., et al. Molecular determinants controlling homeostatic recirculation and tissue-specific trafficking of lymphocytes. International Archives of Allergy and Immunology. 134 (2), 120-134 (2004).
  5. Rocha-Resende, C., et al. Developmental changes in myocardial B cells mirror changes in B cells associated with different organs. JCI Insight. 5 (16), (2020).
  6. Adamo, L., et al. Myocardial B cells are a subset of circulating lymphocytes with delayed transit through the heart. JCI Insight. 5 (3), 139377 (2020).
  7. Adamo, L., et al. Modulation of subsets of cardiac B lymphocytes improves cardiac function after acute injury. JCI Insight. 3 (11), (2018).
  8. Rocha-Resende, C., Pani, F., Adamo, L. B cells modulate the expression of MHC-II on cardiac CCR2(-) macrophages. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 157, 98-103 (2021).
  9. Zouggari, Y., et al. B lymphocytes trigger monocyte mobilization and impair heart function after acute myocardial infarction. Nature Medicine. 19 (10), 1273-1280 (2013).
  10. Wu, L., et al. IL-10-producing B cells are enriched in murine pericardial adipose tissues and ameliorate the outcome of acute myocardial infarction. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (43), 21673-21684 (2019).
  11. Heinrichs, M., et al. The healing myocardium mobilizes a distinct B-cell subset through a CXCL13-CXCR5-dependent mechanism. Cardiovascular Research. 117 (13), 2664-2676 (2021).
  12. Sun, Y., et al. Splenic marginal zone B lymphocytes regulate cardiac remodeling after acute myocardial infarction in mice. Journal of the American College of Cardiology. 79 (7), 632-647 (2022).
  13. Yan, X., et al. Temporal dynamics of cardiac immune cell accumulation following acute myocardial infarction. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 62, 24-35 (2013).
  14. Iwata, M., et al. Autoimmunity against the second extracellular loop of beta(1)-adrenergic receptors induces beta-adrenergic receptor desensitization and myocardial hypertrophy in vivo. Circulation Research. 88 (1), 578-586 (2001).
  15. Jahns, R., et al. Direct evidence for a beta 1-adrenergic receptor-directed autoimmune attack as a cause of idiopathic dilated cardiomyopathy. The Journal of Clinical Investigation. 113 (10), 1419-1429 (2004).
  16. Christ, T., et al. Autoantibodies against the beta1 adrenoceptor from patients with dilated cardiomyopathy prolong action potential duration and enhance contractility in isolated cardiomyocytes. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 33 (8), 1515-1525 (2001).
  17. Jane-wit, D., et al. Adrenergic receptor autoantibodies mediate dilated cardiomyopathy by agonistically inducing cardiomyocyte apoptosis. Circulation. 116 (4), 399-410 (2007).
  18. Ludwig, R. J., et al. Mechanisms of autoantibody-induced pathology. Frontiers in Immunology. 8, 603 (2017).
  19. Haudek, S. B., et al. Fc receptor engagement mediates differentiation of cardiac fibroblast precursor cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (29), 10179-10184 (2008).
  20. Staudt, A., Eichler, P., Trimpert, C., Felix, S. B., Greinacher, A. Fc(gamma) receptors IIa on cardiomyocytes and their potential functional relevance in dilated cardiomyopathy. Journal of the American College of Cardiology. 49 (16), 1684-1692 (2007).
  21. Zhang, M., et al. The role of natural IgM in myocardial ischemia-reperfusion injury. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 41 (1), 62-67 (2006).
  22. Zhang, M., et al. Identification of a specific self-reactive IgM antibody that initiates intestinal ischemia/reperfusion injury. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (11), 3886-3891 (2004).
  23. Schulze, K., Becker, B. F., Schauer, R., Schultheiss, H. P. Antibodies to ADP-ATP carrier--an autoantigen in myocarditis and dilated cardiomyopathy--impair cardiac function. Circulation. 81 (3), 959-969 (1990).
  24. Matsumoto, Y., Park, I. K., Kohyama, K. B-cell epitope spreading is a critical step for the switch from C-protein-induced myocarditis to dilated cardiomyopathy. The American Journal of Pathology. 170 (1), 43-51 (2007).
  25. Caforio, A. L. P., et al. Current state of knowledge on aetiology, diagnosis, management, and therapy of myocarditis: a position statement of the European Society of Cardiology Working Group on Myocardial and Pericardial Diseases. European Heart Journal. 34 (33), 2636-2648 (2013).
  26. Pinto, A. R., et al. Revisiting cardiac cellular composition. Circulation Research. 118 (3), 400-409 (2016).
  27. Yu, Y. R., et al. A protocol for the comprehensive flow cytometric analysis of immune cells in normal and inflamed murine non-lymphoid tissues. PLoS One. 11 (3), 0150606 (2016).
  28. Epelman, S., et al. Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation. Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).
  29. Horckmans, M., et al. Pericardial adipose tissue regulates granulopoiesis, fibrosis and cardiac function after myocardial infarction. Circulation. 137 (9), 948-960 (2017).
  30. Lavine, K. J., et al. Distinct macrophage lineages contribute to disparate patterns of cardiac recovery and remodeling in the neonatal and adult heart. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (45), 16029-16034 (2014).
  31. Bajpai, G., Lavine, K. J. Isolation of macrophage subsets and stromal cells from human and mouse myocardial specimens. Journal of Visualized Experiments. (154), e60015 (2019).
  32. Anderson, K. G., et al. Intravascular staining for discrimination of vascular and tissue leukocytes. Nature Protocols. 9 (1), 209-222 (2014).
  33. Coffman, R. L., Weissman, I. L. B220: a B cell-specific member of th T200 glycoprotein family. Nature. 289 (5799), 681-683 (1981).
  34. Montecino-Rodriguez, E., Dorshkind, K. B-1 B cell development in the fetus and adult. Immunity. 36 (1), 13-21 (2012).
  35. Bermea, K., Bhalodia, A., Huff, A., Rousseau, S., Adamo, L. The role of B cells in cardiomyopathy and heart failure. Current Cardiology Reports. , 01722-01724 (2022).
  36. Zhao, T. X., et al. Rituximab in patients with acute ST-elevation myocardial infarction: an experimental medicine safety study. Cardiovascular Research. 118 (3), 872-882 (2022).
  37. Kushnir, N., et al. B2 but not B1 cells can contribute to CD4+ T-cell-mediated clearance of rotavirus in SCID mice. Journal of Virology. 75 (12), 5482-5490 (2001).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

186

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved