JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה פשוטה ויעילה להובלה למרחקים ארוכים של חומצות פרפלואורואלקיל בחיטה.

Abstract

כמויות גדולות של חומצות פרפלואורואלקיל (PFAA) הוכנסו לקרקע והצטברו על ידי צמחים, מה שמהווה סיכון פוטנציאלי לבריאות האדם. חובה לחקור את ההצטברות והטרנסלוקציה של PFAAs בתוך צמחים. הובלה למרחקים ארוכים היא מסלול חשוב עבור PFAAs המועברים מעלי הצמח לרקמות המאכל דרך הפלום. עם זאת, בעבר היה קשה להעריך את פוטנציאל הטרנסלוקציה של זיהום אורגני בתקופת חשיפה קצרת טווח. ניסוי השורש המפוצל מספק פתרון לחשיפה יעילה של טרנסלוקציה למרחקים ארוכים של PFAAs באמצעות ניסוי הידרופוני, אשר, במחקר זה, בוצע בשני צינורות צנטריפוגה 50 מ"ל (A ו- B), מתוכם צינור צנטריפוגה A היה 50 מ"ל של רבע כוח Hoagland תמיסת הזנה סטרילית, בעוד צינור צנטריפוגה B היה באותה כמות של ריכוז חומרים מזינים, ו-PFAAs המטרה (חומצה סולפונית פרפלואורוקטנית, PFOS וחומצה פרפלואורוקטנית, PFOA) שנוספו בריכוז נתון. שורש מחיטה מלאה הופרד ידנית לשני חלקים והוכנס בזהירות לצינורות A ו-B. ריכוז ה-PFAAs בשורשים, יורה של חיטה ותמיסות בצינורות A ו-B הוערכו באמצעות LC-MS/MS, בהתאמה, לאחר שגודלו באינקובטור במשך 7 ימים ונקטפו. התוצאות הצביעו על כך ש-PFOA ו-PFOS חווים תהליך העברה דומה למרחקים ארוכים דרך הפלום מהיורה לשורש ויכולים להשתחרר לסביבה הסביבתית. לפיכך, ניתן להשתמש בטכניקת השורש המפוצל כדי להעריך את ההובלה למרחקים ארוכים של כימיקלים שונים.

Introduction

חומצות פרפלואורואלקיליות (PFAAs) נמצאות בשימוש נרחב במוצרים מסחריים ותעשייתיים שונים בשל תכונותיהן הפיסיקוכימיות המצוינות, כולל פעילות פני השטח ויציבות תרמית וכימית 1,2,3. חומצה סולפונית פרפלואורוקטנית (PFOS) וחומצה פרפלואורוקטנית (PFOA) הן שתי חומצות ה-PFAAs החשובות ביותר המשמשותברחבי העולם 4,5,6, אם כי תרכובות אלה נרשמו באמנת שטוקהולם הבינלאומית בשנים 2009 ו-20197,8, בהתאמה. בשל ההתמדה שלהם ושימוש נרחב, PFOS ו- PFOA זוהו באופן נרחב במטריצות סביבתיות שונות. הריכוזים של PFOA ו-PFOS במים עיליים מנהרות ואגמים שונים ברחבי העולם הם 0.15-52.8 ng/L ו-0.09-29.7 ng/L,בהתאמה 9. בשל השימוש במי תהום או מים מושבים להשקיה וגם שימוש בביוסולידים כדשן, PFOA ו- PFOS נמצאים באופן נרחב בקרקע, ונעים בין 0.01-123 מיקרוגרם לק"ג ו 0.003-162 מיקרוגרם / ק"ג, בהתאמה10, אשר יכול להכניס כמות גדולה של PFAAs לצמחים ולהוות סיכונים פוטנציאליים לבריאות האדם. ריכוזי ה-PFAA (C4-C8) בקרקע חקלאית ובדגנים (חיטה ותירס) מראים מתאם ליניארי חיובי11. לכן, חובה לחקור את ההצטברות והטרנסלוקציה של PFAAs בתוך צמחים.

הטרנסלוקציה של PFAAs בצמחים מתרחשת תחילה מהשורשים לרקמות שמעל פני הקרקע, והטרנסלוקציה של PFAAs מהשורשים לרקמות המאכל נחשבת להובלה למרחקים ארוכים12,13. מחקרים קודמים זיהו ביספנול A, נונילפנול ואסטרוגנים טבעיים בירקות ופירות14, מה שמרמז על כך שהכימיקלים האלה עשויים לנדוד דרך הפלום. לפיכך, חשוב לחשוף את הטרנסלוקציה של PFAAs בצמחים כדי להעריך את הסיכון הפוטנציאלי שלהם. עם זאת, הצטברות וטרנסלוקציה של PFAAs מושפעים מהזמינות הביולוגית שלהם בקרקע, ולכן לא קל להעריך את יכולת הטרנסלוקציה של PFAAs מטרה בצמחים. בנוסף, ניסויים הידרופוניים מוגבלים בדרך כלל על ידי מספר גורמים, מה שמקשה על רכישת רקמות מאכל של צמחים. בדרך כלל, הפלום נאסף ישירות מצמחים כדי לבחון טרנסלוקציה של תרכובות אורגניות דרך מרחקים ארוכים בצמחים, בעוד שקשה להשיג פלומים משתילי צמחים15. לפיכך, שיטה פשוטה ויעילה, טכניקת השורש המפוצל, הוצגה כדי לחקור את הטרנסלוקציה של PFAAs בצמחים במהלך חשיפה לטווח קצר יחסית. באשר לחקירת השורשים המפוצלים, השורשים בשתיל צמח אחד מופרדים לשני חלקים; חלק אחד מוכנס לתמיסת ההזנה המכילה PFAAs מטרה (צינור A), והשני ממוקם בתמיסת ההזנה בהיעדר PFAAs (צינור B). לאחר חשיפה של מספר ימים, ה-PFAAs בצינור B נמדדים על-ידי LC-MS/MS. ריכוז ה-PFAAs בצינור B חושף את פוטנציאל הטרנסלוקציה של PFAAs דרך הפלום בתוך צמחים16,17,18.

ניסוי השורש המפוצל דווח על חקר הטרנסלוקציה למרחקים ארוכים של תרכובות רבות בצמחים, כגון ננו-חלקיקי CuO17, אסטרוגנים סטרואידים 18 ואסטרים אורגנופוספטים16. מחקרים אלה סיפקו ראיות לכך שהתרכובות האלה יכולות לעבור דרך הפלום לחלקים האכילים של הצמחים. עם זאת, יש לבחון עוד יותר אם PFAAs יכולים לסייע בטרנסלוקציה בצמחים ואת ההשפעה של תכונות תרכובת. בהתבסס על דיווחים אלה, ניסוי השורש המפוצל נערך במחקר הנוכחי כדי לחשוף את ההובלה למרחקים ארוכים של PFAAs בחיטה.

Protocol

זרעי חיטה, Triticum aestivum L., נרכשו (ראו טבלת חומרים) ושימשו למחקר הנוכחי.

1. נביטת שתיל חיטה ותרבית הידרופונית

  1. בחר זרעי חיטה בגודל דומה וחטא אותם במשך 15 דקות עם 8% (w / w) תמיסת מי חמצן.
  2. שטפו היטב את הזרעים המחוטאים במים שעברו דה-יוניזציה, ולאחר מכן הניחו אותם על נייר סינון לח בחושך בטמפרטורת החדר כדי לנבוט במשך 5 ימים.
  3. בחר כתשעה שתילים מונבטים בגודל אחיד והעבר אותם לכוסות פלסטיק עם 250 מ"ל של תמיסה מזינה (1/4 חוזק של התמיסה של Hoagland; ההרכב הכימי שלה מוצג בטבלה 1).
    הערה: מתוך תשעת הזרעים, שלושה נבחרו עבור ריק, PFOA ו-PFOS, בהתאמה.
  4. לטפח את השתילים בתאי גידול במשך 7 ימים לפני החשיפה עם מחזור של 14 שעות ב 22 מעלות צלזיוס ו 10 שעות ב 27 מעלות צלזיוס.

2. ניסוי פיצול השורשים

  1. בצע את טיפוח השתיל בשני צינורות צנטריפוגה 50 מ"ל (A ו- B).
    הערה: בצינור צנטריפוגה A, 50 מ"ל של 1/4 כוח סטרילי התמיסה של Hoagland היה נוכח, ואת אותה כמות של תמיסה מזינה היה נוכח צינור צנטריפוגה B.
    1. ממיסים את ה-PFOA וה-PFOS המסחריים (ראו טבלת חומרים) במתנול ומדללים אותם עם התמיסה המזינה הסטרילית כתמיסת המלאי. לאחר מכן, הוסף את תמיסת המלאי לצינור B בריכוז PFOA/PFOS של 100 מיקרוגרם לליטר.
    2. בצע את הטיפולים במשולשים עם שליטה ריקה כדי לפקח על זיהום הרקע. דיאגרמה סכמטית של ניסויי החשיפה לשורשים מפוצלים מוצגת באיור 1.
  2. מפרידים את כל השורשים של שתיל החיטה באמצעות פינצטה לשני חלקים שווים, כך שהשורשים עדיין מחוברים לאותה יורה ומכניסים אותם בזהירות לצינורות A ו-B, בהתאמה.
  3. אוטמים את שתי הצינורות ברדיד אלומיניום ומתרבסים אותן באינקובטור למשך 7 ימים. לשמור על אותם תנאי דגירה כאמור בשלב 1.4.
  4. לאסוף את שתילי החיטה לאחר 7 ימים של תרבית ולהפריד את החיטה לשלושה חלקים: יורה ושורשים בתרבית בתמיסה של PFAAs ותמיסה unspiked, בהתאמה, באמצעות מספריים מעוקרים.
  5. יש להקפיא-לייבש את דגימות הצמחים בליאופיליזר בטמפרטורה של 55°C- למשך 48 שעות.
  6. הומוגניות ושוקלות את דגימות השורש והירי. אסוף את דגימות התמיסה המחורצות והלא מחודדות.

3. מיצוי PFOA ו-PFOS מרקמות הצמח

  1. הוסיפו 2 מ"ל של חיץ נתרן פחמתי (0.25 מול/ליטר), 1 מ"ל של טטרבוטילמוניום מימן גופרתי (0.5 מול/ליטר), ו-5 מ"ל של אתר מתיל טרט-בוטיל (ראו טבלת חומרים) לצינור פוליפרופילן של 15 מ"ל, כולל השורש ההומוגני או היריות.
  2. נערו את הצינור ב-250 סל"ד למשך 20 דקות ואת הצנטריפוגה ב-2,000 x גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר כדי לקבל את הפאזה האורגנית העל-טבעית. בצע את תהליך החילוץ פעמיים.
  3. מערבבים את התמציות שנאספו, מתאדים ליובש בזרם חנקן עדין (N2), ואז יוצרים מחדש עם 5 מ"ל של מתנול ומערבבים אותם, תוך שמירה על אותה מהירות במשך כ-30 שניות.
  4. מרכך את מחסנית הפסטיקרב (ראו טבלת חומרים) ב-5 מ"ל של 0.1% NH4OH במתנול, 5 מ"ל מים ו-5 מ"ל מתנול.
  5. מוסיפים את 5 מ"ל של תמיסת מיצוי מתנול דרך מחסנית הפסטיקרב (500 מ"ג/6 מ"ל) כדי להסיר את הפיגמנט, להחמם את המחסנית עם 5 מ"ל של מתנול, ולאסוף באותם צינורות.
  6. יש לאדות את תמיסת המתנול שאספה בנפח 10 מ"ל עד כמעט יובש ולהרכיב מחדש עם 200 μL של מתנול, ולאחר מכן מערבולות וצנטריפוגות ב-10,000 x גרם למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.

4. הכנת מדגם מתמיסת החומרים המזינים

  1. מצב עם 5 מ"ל מתנול ו-5 מ"ל מים להפעלת מחסנית מיצוי פולימר משופר קוטבי (PEP) (60 מ"ג/גרם, 3 מ"ל) (ראו טבלת חומרים).
  2. הוסף 1 מ"ל של התמיסה המסולסלת או 50 מ"ל של דגימות התמיסה הלא מחודדת (שלב 2.6) דרך המחסנית, בהתאמה.
  3. אלוט את PFAAs היעד עם 10 מ"ל של מתנול, לאדות את התמצית עם N2 עדין, ולאחר מכן ליצור מחדש עם 200 μL של מתנול לניתוח.

5. ניתוח אינסטרומנטלי

  1. השתמש בכרומטוגרפיה נוזלית UPLC בעלת ביצועים גבוהים במיוחד בשילוב עם ספקטרומטריית מסת טנדם (LC-MS/MS) לכימות של PFAAs המטרה במצב ריבוי תגובות (MRM) ויינון אלקטרוספריי שלילי (ESI-) (ראה טבלת חומרים).
  2. להזריק 10 μL של דגימות ולהפריד את PFAAs היעד באמצעות עמודה כרומטוגרפית נוזלית C18 (1.7 μm, 2.1 מ"מ x 50 מ"מ, ראה טבלת חומרים), ולהשתמש 2 mM אמוניום אצטט במים (שלב A) ומתנול (שלב B) כשלב הנייד עבור UPLC, עם קצב זרימה של 0.3 מ"ל לדקה. שמור על טמפרטורת העמודה ב 50 °C (75 °F).
    הערה: מעברי היונים של PFOA ו-PFOS הם 413 עד 369 ו-499 עד 80, בהתאמה. תוכנית ההעתקה ההדרגתית והפרמטרים האינסטרומנטליים LC-MS/MS לכימות ה-PFAAs של היעד מפורטים בטבלה 2.
  3. לעבד את הנתונים באמצעות תוכנת ניתוח הנתונים (ראה טבלת חומרים).

תוצאות

ניסוי השורש המפוצל חקר את ההובלה למרחקים ארוכים של PFAAs בחיטה. כפי שניתן לראות באיור 2A,C, גם PFOA וגם PFOS יכולים להילקח על-ידי שורש החיטה ולהעביר אותם לירות. PFOS ו- PFOA לא זוהו בשורש החיטה ובתמיסה בצינור A של הבקרה הריקה. נמצא כי PFOS ו-PFOA זוהו בשורשי החיטה שגודלו בתרבית בתמיסה...

Discussion

כדי להבטיח את הדיוק של שיטה זו, יש לנקוט פעולה זהירה כדי להבטיח כי תמיסה spiked בצינור B לא לזהם את תמיסה unspiked בצינור A. הריכוז הנתון של PFAAs מטרה במחקר הנוכחי היה גבוה יחסית לריכוזם בסביבה האמיתית, מה שהבטיח לנטר PFAAs מטרה בחיטה ובתמיסה לא מרוסקת באמצעות LC-MS/MS.

ישנן מגבלות לשיטה זו. ?...

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

אנו מודים על תמיכה כספית מקרן מדעי הטבע של סין (NSFC 21737003), הקרן המדעית של האוניברסיטאות הסיניות (מס '2452021103) והקרן הסינית למדע פוסט-דוקטורט (מס' 2021M692651, 2021M702680).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
ACQUITY UPLC BEH C18 columnWaters, Milford, MALiquid chromatographic column
Cleanert PEP cartridgeBonna- Angel Technologies, ChinaSolid phase extraction column
Clearnert Pesticarb cartridgeBonna- Angel Technologies, ChinaSolid phase extraction column
LC-MS/MS(Waters Acquity UPLC i-Class Coupled to Xevo TQ-S)Waters, Milford, MALiquid chromatography and mass spectrometry
Lyophilizer Boyikang Instrument Ltd., Beijing, ChinaFD-1A50Freeze-dried sample
MasslynxWaters, Milford, MAdata analysis software
Methyl tert-butyl etherSigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, US)use for extracting target compounds from plant tissues
MPFAC-MXAWellington Laboratories (Ontario, Canada)PFACMXA0518the internal standards
PFAC-MXBWellington Laboratories (Ontario, Canada)PFACMXB0219mixture of PFAA calibration standards
PFOASigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, US)335-67-1a represent PFAAs
PFOSSigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, US)2795-39-3a represent PFAAs
Sodium carbonate bufferSigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, US)use for extracting target compounds from plant tissues
Tetrabutylammonium hydrogen sulfateSigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, US)use for extracting target compounds from plant tissues
Wheat seedsChinese Academy of Agricultural Sciences (Beijing,China) Triticum aestivum L.

References

  1. Lindstrom, A. B., Strynar, M. J., Libelo, E. L. Polyfluorinated compounds: Past, present, and future. Environmental Science & Technology. 45 (19), 7954-7961 (2011).
  2. Kannan, K. Perfluoroalkyl and polyfluoroalkyl substances: Current and future perspectives. Environmental Chemistry. 8 (4), 333-338 (2011).
  3. Cui, Q., et al. Occurrence and tissue distribution of novel perfluoroether carboxylic and sulfonic acids and legacy per/polyfluoroalkyl substances in black-spotted frog (Pelophylax nigromaculatus). Environmental Science & Technology. 52 (3), 982-990 (2018).
  4. Negri, E., et al. Exposure to PFOA and PFOS and fetal growth: a critical merging of toxicological and epidemiological data. Critical Reviews in Toxicology. 47 (6), 489-515 (2017).
  5. Chi, Q., Li, Z., Huang, J., Ma, J., Wang, X. Interactions of perfluorooctanoic acid and perfluorooctanesulfonic acid with serum albumins by native mass spectrometry, fluorescence and molecular docking. Chemosphere. 198, 442-449 (2018).
  6. Zhang, X., Chen, L., Fei, X. C., Ma, Y. S., Gao, H. W. Binding of PFOS to serum albumin and DNA: insight into the molecular toxicity of perfluorochemicals. Bmc Molecular Biology. 10, 16 (2009).
  7. Pan, Y. T., et al. Worldwide distribution of novel perfluoroether carboxylic and sulfonic acids in surface water. Environmental Science & Technology. 52 (14), 7621-7629 (2018).
  8. Knight, E. R., et al. An investigation into the long-term binding and uptake of PFOS, PFOA and PFHxS in soil - plant systems. Journal of Hazardous Materials. 404, 124065 (2021).
  9. Liu, Z. Y., et al. Crop bioaccumulation and human exposure of perfluoroalkyl acids through multi-media transport from a mega fluorochemical industrial park, China. Environment International. 106, 37-47 (2017).
  10. Mei, W. P., et al. Per- and polyfluoroalkyl substances (PFASs) in the soil-plant system: Sorption, root uptake, and translocation. Environment International. 156, 106642 (2021).
  11. Wang, W., Rhodes, G., Ge, J., Yu, X., Li, H. Uptake and accumulation of per- and polyfluoroalkyl substances in plants. Chemosphere. 261, 127584 (2020).
  12. Lu, J., Wu, J., Stoffella, P. J., Wilson, P. C. Analysis of bisphenol A, nonylphenol, and natural estrogens in vegetables and fruits using gas chromatography-tandem mass spectrometry. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 61 (1), 84-89 (2013).
  13. Herschbach, C., Gessler, A., Rennenberg, H., Luttge, U., Beyschlag, W., Budel, B., Francis, D. Long Distance Transport and Plant Internal Cycling of N- and S-Compounds. Progress in Botany 73. , 161-188 (2012).
  14. Liu, Q., et al. Uptake kinetics, accumulation, and long-distance transport of organophosphate esters in plants: Impacts of chemical and plant properties. Environmental Science & Technology. 53 (9), 4940-4947 (2019).
  15. Wang, Z. Y., et al. Xylem- and phloem-based transport of CuO nanoparticles in maize (Zea mays L.). Environmental Science & Technology. 46 (8), 4434-4441 (2012).
  16. Chen, X., et al. Uptake, accumulation, and translocation mechanisms of steroid estrogens in plants. Science of the Total Environment. 753, 141979 (2021).
  17. Felizeter, S., McLachlan, M. S., de Voogt, P. Uptake of perfluorinated alkyl acids by hydroponically grown lettuce (Lactuca sativa). Environmental Science & Technology. 46 (21), 11735-11743 (2012).
  18. Zhou, J., et al. Insights into uptake, translocation, and transformation mechanisms of perfluorophosphinates and perfluorophosphonates in wheat (Triticum aestivum L.). Environmental Science & Technology. 54 (1), 276-285 (2020).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

187

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved