JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כדי לתכנן באופן רציונלי אדג'ובנטים יעילים, פיתחנו תחליב פיקרינג (PNPE) של חומצה פולי-לקטית-קו-גליקולית עם ננו-חלקיקים מיוצבים. ה-PNPE היה בעל רכות ייחודית וממשק הידרופובי למגע תאי רב עוצמה והציע העמסת אנטיגן בעלת תכולה גבוהה, שיפור הזיקה התאית של מערכת ההעברה לתאים המציגים אנטיגן וגרימת הפנמה יעילה של אנטיגנים.

Abstract

הזיקה התאית של מיקרו/ננו-חלקיקים היא התנאי המקדים לזיהוי תאי, ספיגה תאית והפעלה, החיוניים להעברת תרופות ולתגובה חיסונית. המחקר הנוכחי נבע מהתצפית כי ההשפעות של מטען, גודל וצורה של חלקיקים מוצקים על זיקת התא נחשבות בדרך כלל, אך לעתים רחוקות אנו מבינים את התפקיד החיוני של רכות, תופעת ארגון מחדש דינמי ואינטראקציה מורכבת של ממשקים באהדה תאית. כאן, פיתחנו תחליב פיקרינג (PNPE) עם חומצה פולי-לקטית-קו-גליקולית (PLGA) מיוצב על-ידי ננו-חלקיקים שהתגבר על החסרונות של צורות קשיחות ודימה את הגמישות והנזילות של פתוגנים. הוקמה שיטה לבדיקת הזיקה של PNPE לפני השטח של התאים ולהרחבה על ההפנמה שלאחר מכן על ידי תאי מערכת החיסון. הזיקה של PNPE לשלפוחיות חוץ-תאיות ביו-מימטיות (bEVs) - התחליף לתאים דנדריטיים של מח עצם (BMDCs) - נקבעה באמצעות מיקרו-איזון גבישי קוורץ עם ניטור פיזור (QCM-D), שאיפשר ניטור בזמן אמת של הידבקות תחליב-תאים. לאחר מכן, PNPE שימש כדי לספק את האנטיגן (ovalbumin, OVA) ואת ספיגת האנטיגנים על ידי BMDCs נצפתה באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר confocal (CLSM). תוצאות מייצגות הראו כי ה-PNPE ירד באופן מיידי בתדירות (ΔF) כאשר הוא נתקל ב-bEVs, מה שמעיד על הידבקות מהירה וזיקה גבוהה של ה-PNPE ל-BMDCs. PNPE הראה קשירה חזקה יותר באופן משמעותי לקרום התא מאשר מיקרו-חלקיקים PLGA (PMPs) ואדג'ובנט AddaVax (מסומן כננו-אמולסיה מיוצב פעילי שטח [SSE]). יתר על כן, בשל הזיקה התאית המוגברת לאימונוציטים באמצעות שינויי עקמומיות דינמיים ודיפוזיות לרוחב, ספיגת האנטיגן הוגברה לאחר מכן בהשוואה ל-PMPs ו-SSE. פרוטוקול זה מספק תובנות לתכנון פורמולציות חדשניות עם זיקה גבוהה לתאים והפנמת אנטיגן יעילה, ומספק פלטפורמה לפיתוח חיסונים יעילים.

Introduction

כדי להילחם במחלות מגיפות, כרוניות ומדבקות, חובה לפתח אדג'ובנטים יעילים לחיסונים מניעתיים וטיפוליים 1,2. באופן אידיאלי, האדג'ובנטים צריכים להיות בעלי בטיחות מעולה והפעלה חיסונית 3,4,5. ספיגה יעילה ותהליך של אנטיגנים על ידי תאים המציגים אנטיגן (APCs) נחשבים לשלב חיוני במפל האיתות במורד הזרם ותחילת התגובה החיסונית 6,7,8. לפיכך, השגת הבנה ברורה של מנגנון האינטראקציה של תאי מערכת החיסון עם אנטיגנים ותכנון אדג'ובנטים להגברת ההפנמה הן אסטרטגיות יעילות להגברת היעילות של חיסונים.

מיקרו/ננו-חלקיקים בעלי תכונות ייחודיות נחקרו בעבר כמערכות העברת אנטיגן כדי לתווך את הקליטה התאית של אנטיגנים ואת האינטראקציה התאית עם תבניות מולקולריות הקשורות לפתוגנים 9,10. עם מגע עם תאים, מערכות הלידה מתחילות לקיים אינטראקציה עם המטריצה החוץ-תאית ועם קרום התא, מה שהוביל להפנמה ולתגובות תאיות לאחרמכן 11,12. מחקרים קודמים הראו כי הפנמה של חלקיקים מתרחשת באמצעות הידבקות ממברנה-חלקיקים של התא13, ולאחר מכן דפורמציה גמישה של קרום התא ודיפוזיה של הקולטן לממברנה פני השטח14,15. בנסיבות אלה, המאפיינים של מערכת האספקה תלויים בזיקה לנגמ"שים, אשר משפיעים לאחר מכן על כמות הקליטה16,17.

כדי לקבל תובנות על תכנון מערכת ההעברה לשיפור התגובה החיסונית, התמקדו מאמצים נרחבים בחקר הקשר בין תכונות החלקיקים לבין ספיגת התאים. המחקר הנוכחי נבע מהתצפית כי מיקרו/ננו-חלקיקים מוצקים בעלי מטענים, גדלים וצורות שונים נחקרים לעתים קרובות באור זה, בעוד שתפקיד הנזילות בהפנמת אנטיגן נחקר רק לעתים רחוקות18,19. למעשה, במהלך ההדבקה, החלקיקים הרכים הדגימו שינויי עקמומיות דינמיים ודיפוזיות לרוחב כדי להגדיל את שטח המגע עבור אינטראקציות רב-ערכיות, שבקושי ניתן לשכפל על ידי החלקיקים המוצקים20,21. בנוסף, קרומי התאים הם דו-שכבתיים פוספוליפידים (sphingolipids או כולסטרול) באתר הספיגה, וחומרים הידרופוביים יכולים לשנות את האנטרופיה הקונפורמציונית של שומנים, ולהפחית את כמות האנרגיה הנדרשת לקליטת תאים22,23. לכן, הגברת הניידות וקידום הידרופוביות של מערכת האספקה עשויים להיות אסטרטגיה יעילה לחיזוק הפנמת האנטיגן כדי לשפר את התגובה החיסונית.

תחליבי פיקרינג, המיוצבים על ידי חלקיקים מוצקים המורכבים בממשק שבין שני נוזלים בלתי ניתנים לערעור, היו בשימוש נרחב בתחום הביולוגי24,25. למעשה, החלקיקים הצוברים בממשק שמן/מים קובעים את הניסוח של מבנים רב-שכבתיים, המקדמים אינטראקציות רב-שכבתיות בין מערכת ההעברה לתאים, וגורמים עוד יותר לתכונות פיזיוכימיות רב-תפקודיות בהעברת תרופות. בגלל העיוות והניידות הרוחבית שלהם, תחליבי פיקרינג היו צפויים להיכנס לאינטראקציה תאית רב-ערכית עם האימונוציטים ולהיות מזוהים על ידי חלבוני הממברנה26. בנוסף, מכיוון שליבות מיצלה שמנוניות בתחליבי פיקרינג אינן מכוסות לחלוטין בחלקיקים מוצקים, תחליבי פיקרינג מכילים מרווחים בגדלים שונים בין חלקיקים בממשק השמן/מים, הגורמים להידרופוביות גבוהה יותר. לפיכך, חיוני לחקור את הזיקה של תחליבי פיקרינג לנגמ"שים ולפרט על ההפנמה שלאחר מכן כדי לפתח אדג'ובנטים יעילים.

בהתבסס על שיקולים אלה, תכננו תחליב פיקרינג (PNPE) מיוצב ננו-חלקיקים של PLGA כמערכת אספקת חיסונים לנזילות, שגם סייעה להשיג תובנות חשובות בזיקה של PNPE ל-BMDCs והפנמת תאים. ההדבקה בזמן אמת של שלפוחיות חוץ-תאיות ביו-מימטיות (bEVs; החלפה של BMDCs) ל-PNPE נותרה בשיטה נטולת תוויות באמצעות מיקרו-איזון גבישי קוורץ עם ניטור פיזור (QCM-D). בעקבות אפיון הזיקה של PNPE ל-BMDCs, נעשה שימוש במיקרוסקופיה של סריקת לייזר קונפוקלית (CLSM) כדי לקבוע את ספיגת האנטיגן. התוצאה הצביעה על זיקה גבוהה יותר של PNPE ל- BMDCs, והפנמה יעילה של האנטיגן. ציפינו שה-PNPE יפגין זיקה גבוהה יותר ל-APCs, מה שעשוי לעורר טוב יותר את הפנמת האנטיגנים כדי לשפר את התגובה החיסונית.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

כל השיטות המתוארות בפרוטוקול זה אושרו על ידי המכון להנדסת תהליכים, האקדמיה הסינית למדעים. כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם לתקנות לטיפול ושימוש בחיות מעבדה והנחיות לבדיקה אתית של בעלי חיים (China, GB/T35892-2018).

1. הכנה ואפיון של ננו-חלקיקי PLGA

  1. הכנת ננו-חלקיקי PLGA (PNPs)
    1. הוסיפו 0.5 גרם של אלכוהול פוליוויניל (PVA) ל-120 מ"ל של מים שעברו דה-יוניזציה בטמפרטורה של 90°C וערבבו עד להמסה מלאה כדי להכין את תמיסת ה-PVA. אחסנו את התמיסה במקרר (4°C) לאחר הקירור לטמפרטורת החדר.
    2. יש להוסיף 100 מ"ג של PLGA ל-10 מ"ל של תערובת אצטון ואתנול (יחס של 4:1) כדי לשמש כשלב השמן.
    3. יש להניח 20 מ"ל של תמיסה מימית PVA מתחת למכסה האדים ולערבב באופן מגנטי במהירות של 400 סל"ד לדקה. הוסף 5 מ"ל של שלב השמן לתמיסת PVA טיפה אחר טיפה באמצעות משאבת מזרק. לאחר מכן, ערבבו את התערובת במכסה האדים עד שהממיסים האורגניים יתאדו לחלוטין.
      הערה: עם העלייה בריכוז החלקיקים בשלב השמן, תמיסת שלב המים הופכת בהדרגה לאור צלול ושקוף לבן-כחלחל או לבן חלבי.
    4. לאחר נדידה של ממיסים אורגניים (2-3 שעות), צנטריפוגה התערובת ב 15,000 x גרם. יש לשטוף שלוש פעמים או יותר עד שמי הכביסה הסופיים יהיו צלולים ושקופים.
      הערה: מטרת שלב זה היא בעיקר לשטוף את שאריות ה-PVA על פני השטח של החלקיקים כדי למנוע ממנו להשפיע על תכשיר האמולסיה של פיקרינג.
    5. השהה מחדש את ה- PNPs השטופים ב -2 מ"ל של מים שעברו דה-יוניזציה והקפיא את התערובת בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. לאחר מכן להקפיא-לייבש את החלקיקים ב lyophilizer במשך 48-72 שעות. ה- PNPs המוכנים הם לבנים עדרים.
  2. אפיון PNPs
    1. כדי לאפיין את הגודל ואת פוטנציאל הזטה של PNPs, הוסף 10 μL של PNPs לתוך 1 מ"ל של מים שעברו דה-יוניזציה כדי לקבל תמיסה מדוללת ולהעביר את התמיסה המדוללת לתא DTS1070. הפעל את המחשב ואת מנתח פיזור האור הדינמי (DLS), ולאחר מכן מקם את תא DTS1070 במערכת DLS.
    2. לחץ על תוכנת Zeta Size וצור קובץ מדידה חדש כדי להגדיר את הליך הקביעה. לאחר מכן, התחל את הליך הקביעה כדי להשיג את גודל החלקיקים ואת ההתפלגות הפוטנציאלית של zeta.
    3. כדי לבחון את המורפולוגיה של PNPs, פזרו באופן שווה את תמיסת ה-PNPs בגודל 0.1 מ"ל (מדוללת 40 פעמים) על יריעת רדיד פח בגודל 5 ס"מ על 5 ס"מ ותנו למים להתאדות באופן טבעי במכסה אדים מאוורר היטב למשך הלילה.
    4. חותכים חלק קטן מרדיד הפח ומהדקים אותו על שולחן המדגם באמצעות סרט מוליך. מרססים אותו בזהב בזרם של 10 mA במשך 120 שניות. לאחר מכן התבונן במורפולוגיה של פני השטח של הדגימה באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים סורקת (SEM).

2. הכנה ואפיון של PNPE

  1. כדי להכין PNPE, הוסיפו PNPs מיובשים בהקפאה למים שעברו דה-יוניזציה בריכוז של 4 מ"ג/מ"ל (השלב המיימי) ולאחר מכן הוסיפו סקוואלן כשלב השמן. הכן PNPE באמצעות סוניקציה חד-שלבית למשך 5 דקות בהספק של 100 וואט בסוניק אמבט מים. יחס פאזה שמן-מים הוא 1:9.
  2. אפיון ה- PNPE המוכן
    1. פתח את תוכנת Mastersizer 2000 ואת הלייזר ברצף. לחץ על מדידה כדי לפתוח את התוכנית שהוגדרה מראש ולהגדיר את שם הדוגמה. לחץ על התחל כדי להתחיל למדוד את הרקע של הדגימה, ולאחר מכן, באמצעות טפטפת, הוסף 1 מ"ל של PNPE למיכל הדגימה של מנתח גודל חלקיקי הלייזר כדי למדוד את גודל החלקיקים של האמולסיה שלוש פעמים במקביל.
    2. יש לדלל 20 μL של PNPE ב-1 מ"ל של מים שעברו דה-יוניזציה. שחרר 20 μL של האמולסיה על השקופית. שימו לב למורפולוגיה ולהומוגניות של האמולסיה באמצעות מיקרוסקופיה אופטית בהגדלה של פי 40 וקבלו תצלומים.
  3. יעילות העמסת אנטיגן
    1. להמיס 200 מיקרוגרם של ovalbumin (OVA) ב 500 מ"ל של מים deionized. לאחר מכן ערבבו אותו עם 500 מ"ל של PNPE מוכן ונערו במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. הסר את האנטיגן הנוזלי על ידי צנטריפוגה ב 5000 x גרם במשך 20 דקות.
    2. קבע את ריכוזי האנטיגן הנוזלי באמצעות מבחני חומצה ביסינצ'ונית (BCA)27. הנוסחה לחישוב יעילות העמסת האנטיגן היא כדלקמן:
      יעילות העמסת אנטיגן = figure-protocol-3886
      השתמש באותה שיטה כדי לקבוע את יעילות טעינת האנטיגן של ה- SSE המשמש כקבוצת ביקורת.
  4. יציבות של PNPE
    1. חלק 6 מ"ל של PNPE מוכן לשש מנות שוות, ולאחסן שלושה חלקים כל אחד ב 4 ° C ו 25 ° C, בהתאמה. יש לדלל 20 μL של PNPE מאוחסן לתוך 1 מ"ל של מים שעברו דה-יוניזציה (1:50) ביום 0, 3 ו-6. לאחר מכן, מדוד את הגודל ואת פוטנציאל הזטה של פתרונות מלאי PNPE שנשמרו בטמפרטורות שונות.
      הערה: טמפרטורות האחסון השונות מוגדרות כדי להשוות את ההשפעה של טמפרטורות שונות על היציבות של PNPE, מה שיכול למטב את מצב האחסון ליציבות גבוהה וחיי מדף ארוכים.
  5. הכנת מיקרו-חלקיקי PLGA (PMPs)
    1. יש להמיס 500 מ"ג של PLGA ב-5 מ"ל של דיכלורומתאן כשלב השמן, ולאחר מכן לשפוך ל-50 מ"ל של פאזה מימית חיצונית המכילה 1.5% PVA כדי לקבל את תערובת השמן/מים. הומוגניות התערובת ב-3000 סל"ד למשך דקה אחת באמצעות הומוגנייזר כדי להשיג אמולסיות גסות.
    2. לשמור על אחידות גודל חלקיקי PLGA של מיקרוספרות (שנקבע על ידי תחליבים גסים) על ידי תחליב ממברנה. התקן קרום 5.2 מיקרומטר בצינור הממברנה. התאם את הלחץ ל- 800 kPa ושמור על יציבות.
    3. פתח את שסתום הפליטה ושסתום ההזנה, ולאחר הוספת התחליבים הגסים למיכל הדגימה, סגור את שסתום הפליטה ושסתום ההזנה, פתח את שסתום הפריקה ואת שסתום הכניסה, וקח את האמולסיה שלאחר הסרט בכוס של 200 מ"ל. חזור על התהליך שלוש פעמים כדי לקבל אמולסיות כפולות מראש.
    4. ערבבו את התחליבים הקדם-כפולים כדי לאדות את הדיכלורומתאן בטמפרטורת החדר כדי לרפא את המיקרוספרות. שטפו את המיקרוספרות במים שעברו דה-יוניזציה ב-7741 x גרם למשך 3 דקות חמש פעמים. יש להקפיא מראש במקפיא בטמפרטורה של -80°C ולבסוף להקפיא-לייבש כדי לקבל מיקרוספרות מיובשות.
  6. אפיון PMPs
    1. פתח את תוכנת Mastersizer 2000 ואת הלייזר ברצף. לחץ על מדידה כדי לפתוח את התוכנית שהוגדרה מראש ולהגדיר את שם הדוגמה. לחץ על התחל כדי להתחיל למדוד את הרקע של המדגם. לאחר מכן, הוסף 1 מ"ל של PMPs לדגימה והוסיף מיכל של מנתח גודל חלקיקי הלייזר עם טפטפת ומדוד את גודל החלקיקים של המיקרו-חלקיקים שלוש פעמים במקביל.
  7. ניתוח רכות
    הערה: PNPE מצופה על חיישן SiO2 כדי למדוד את הרכות.
    1. נקו את שבב חיישן הקוורץ SiO 2 על ידי טיפול ב-UV-אוזון למשך 10 דקות, שטפו פעמיים עם 5 מ"ל אתנול (75% v/v) ויבשו עם N2. התקן את שבב חיישן הקוורץ SiO2 הריק לתוך תא הזרימה.
    2. הפעל את המחשב והפעל את בקרת הטמפרטורה בפינה השמאלית התחתונה של התוכנה כדי להבטיח שהטמפרטורה שנקבעה היא כ-1 °C מתחת לטמפרטורת החדר.
    3. לחץ על הלחצן רכישה בסרגל הכלים ובחר הגדרת מדידה כדי לחפש את 1, 3, 5, 7, 9 ו -11 אוקטבות של השבב בערוץ שבו נעשה שימוש. לחץ על כפתור הרכישה בסרגל הכלים ובחר התחל מדידה.
    4. תקן את קו הבסיס עם אוויר, וכאשר התוכנית הבסיסית מאוזנת, בחר עצור ושמור את הקובץ כריק.
    5. נקו את השבב וסובבו ציפוי של 10 מיקרוגרם/מ"ל של PNPE על השבב. בקצרה, הפעל את מעיל הספין והגדר את פרמטר ההפעלה. חבר את צינור N2 למעיל הספין, התאם את הפיצול של בלון הגז ל -0.4 kPa, והנח את השבב הנקי על היניקה של מעיל הספין. הוסף 100 μL של PNPE dropwise למרכז חיישן SiO2 וסגור את המכסה העליון של מעיל הספין כדי להשלים את הציפוי.
    6. התקן את השבב המצופה PNPE בתא הזרימה. חזור על שלבים 2.7.3-2.7.4 ושמור את הקובץ כ- PNPE. פתח הן את הקובץ הריק והן את קובץ ה- PNPE ולחץ על הלחצן Stitch כדי לקבל את הנתונים הקשורים של פיזור (ΔD).

3. בידוד ותרבות BMDCs 28

הערה: ודא שכל הריאגנטים והדגימות ממוקמים על קרח, מכיוון שיש לכך השפעה חיובית על פעילות התאים. כדי לשמור על סטריליות, בצע את כל השלבים על ספסל נקי במיוחד באמצעות כלים סטריליים.

  1. יש להרדים את העכברים C57BL/6 (נקבה, בני 6-8 שבועות) באמצעות שאיפת CO2 ולהשרות אותם באתנול 70% (v/v) לעיקור קצר.
  2. לאחר השרייה במשך 3-5 דקות, העבירו את העכברים לספסל סופר נקי. הסר את שרירי הרגליים באמצעות מספריים מפלדת אל-חלד כדי לחשוף את עצם הירך ואת השוקה, ולאחר מכן הפרד את עצם הירך ואת השוקה.
  3. ממלאים צלחת פטרי ב-70% אתנול (v/v) ומשרים בה את העצמות הנקיות למשך 5-10 שניות כדי להשלים את העיקור החיצוני. נקו את כל העצמות והניחו אותן בצינור סטרילי עם קרח סביבן.
  4. חותכים את עצם הירך ואת השוקה קרוב למפרק באמצעות מספריים. הכנס את מחט המזרק לתוך העצם כדי לשטוף את מח העצם לתוך צינור צנטריפוגה באמצעות מדיום RPMI מקורר מראש (1640).
  5. יש לשטוף פעמיים או שלוש עד שהעצם לבנה לחלוטין. פיפטה את מח העצם מספר פעמים כדי להפריד את כל הגושים. סנן את התאים לצינור צנטריפוגה בגודל 15 מ"ל באמצעות מסננת בקוטר 40 מיקרומטר.
  6. צנטריפוגה ב-4 מעלות צלזיוס ו-500 x גרם למשך 5 דקות. השליכו את הסופרנטנט והוסיפו 2 מ"ל של ליזאט אריתרוציטים למשקעים למשך 4 דקות.
  7. לאחר שטיפה פעמיים או שלוש, יש להשעות מחדש את התאים ב-2 מ"ל של מדיום שלם (1% פניצילין-סטרפטומיצין, 10% סרום בקר עוברי, 20 ננוגרם/מ"ל של IL-4 ו-10 ננוגרם/מ"ל של GM-CSF). לאחר מכן, דלל 10 μL של תאים לתוך 1 מ"ל של PBS והכנס את השבב של מונה התאים האוטומטי כף היד לתוך דילול התא לספירת תאים. לבסוף, תאי זרעים בצפיפות של 1 x 106 תאים למ"ל לתוך צלחת תרבית 10 מ"מ עם מדיום שלם.
  8. תרבית את התאים באינקובטור תאים עם 5% CO2 ב 37 מעלות צלזיוס. שנה את המדיום כל יומיים. ביום 7, העבירו את התאים לצינור של 50 מ"ל וצנטריפוגה בגודל 450 x גרם למשך 5 דקות כדי לאסוף את התאים.

4. הכנת שלפוחיות חוץ-תאיות ביו-מימטיות (bEVs)

  1. הרכיבו את המיני-אקסטרודר ברצף בהתאם להוראות היצרן. ודא כי בית המזרק אינו סדוק לפני השימוש בו. ודא שכל טבעות ה-O במצב טוב לפני כל ניסוי והחלף אותן שנלבשו או ניזוקו בהקדם. טבעות O שחוקות או פגומות עלולות לגרום לשחרור לחץ פתאומי בעת הפעלת המכבש.
  2. שאפו את ה- BMDCs שוב ושוב והעבירו אותם לצינור צנטריפוגה. קציר התאים על ידי צנטריפוגה ב 450 x גרם במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. לחץ על מתלי התאים באמצעות 10 מיקרומטר, 5 מיקרומטר ו-1 מיקרומטר פוליקרבונט עבור 30 מעברים באמצעות מיני אקסטרודר29.
    הערה: כדי לאפשר אחידות בגודל bEV, מתלי BMDC נדחפו דרך ממברנות פוליקרבונט של 10 מיקרומטר, 5 מיקרומטר ו-1 מיקרומטר במשך 30 מעברים. בנוסף, במהלך המבצע, הקפידו להפעיל כוח באופן שווה ולשמור על כיוון הכוח לאורך ציר המזרק.
  3. צנטריפוגה של סופרנאטנטים במאגר במשך 5 דקות ב 1000 x גרם ו 4 מעלות צלזיוס כדי להסיר את התאים. לאסוף את supernatant וצנטריפוגה אותו ב 3000 x גרם במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס כדי להסיר את התאים הנותרים ואת פסולת התא.
  4. לאסוף את supernatant וצנטריפוגה אותו ב 100,000 x גרם במשך 90 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. השליכו את ה-supernatant והשעו מחדש את ה-bEVs ב-2 מ"ל של תמיסת מלח עם מאגרי HEPES (HBS). טהרו את כלי הרכב החשמליים באמצעות סינון דרך ממברנה של 0.45 מיקרומטר ואחסנו את כלי הרכב החשמליים המטוהרים בטמפרטורה של 80°C-.

5. כלי רכב חשמליים נצמדים ל-PNPE

הערה: חיישן SiO2 שונה באמצעות שיטת ציפוי ספין.

  1. חיישן SiO2 שונה עם פולי-ל-ליזין (PLL).
    1. נקו את שבב חיישן הקוורץ SiO 2 באמצעות טיפול UV-אוזון למשך 10 דקות, שטפו פעמיים באתנול ויבשו עם N2.
    2. הפעל את מעיל הסחיטה על-ידי לחיצה על לחצן ההפעלה , לחץ על לחצן הבקרה והגדר את הזמן והמהירות של הציפוי. מהירות הסיבוב הראשונית היא 400 סל"ד, אשר גדל בהתמדה ל 5000 סל"ד.
    3. חבר את צינור N2 למעיל הספין והתאם את הפיצול של בלון הגז ל -0.4 kPa. מניחים את השבב הנקי על היניקה של מעיל הספין. הוסף 100 μL של PLL dropwise למרכז חיישן SiO2 וסגור את המכסה העליון של מעיל הסיבוב.
    4. לחץ על לחצן התחל כדי להתחיל לצפות את הדגימה ולעצור את ההתקן בסיום. כבה את משאבת הוואקום, כבה את לחצני ההפעלה והבקרה והסר את חיישן SiO2 שעבר שינוי PLL.
      הערה: לפני לחיצה על התחל, ודא שזמן ומהירות הציפוי נקבעו. בנוסף, ודא שחיישן SiO2 ממוקם במרכז היניקה. ודא שהמכסה סגור לפני הפעלת התהליך כדי למנוע תאונות.
  2. קביעת הידבקות של כלי רכב חשמליים ל- PNPE
    1. הפעל את המחשב, את היחידה האלקטרונית, את המשאבה הפריסטלטית והפעל את בקרת הטמפרטורה בפינה השמאלית התחתונה בתוכנה כדי להבטיח שהטמפרטורה שנקבעה היא כ -1 °C מתחת לטמפרטורת החדר.
    2. מקם את חיישני SiO2 שעברו שינוי PLL בתא הזרימה בהתאם להוראות ההפעלה וחבר את קו המדידה בין תא הזרימה למשאבת הזרימה. מקם את תא הזרימה בתוך מערכת מודולי הזרימה ושטוף אותם במים אולטרה-טהורים לפני תחילת הניסויים.
    3. לחץ על סרגל הכלים רכישה ובחר הגדרת מדידה כדי לחפש 1, 3, 5, 7, 9 ו -11 אוקטבות של השבב בערוץ שבו נעשה שימוש. כדי לתקן את קו הבסיס, לחץ על התחל מדידה כדי לאפשר לאוויר להיכנס למודול הזרימה עד שקו הבסיס של האוויר יהיה חלק. לאחר מכן, הזרימו מים שעברו דה-יוניזציה למשך 10-15 דקות כדי לאפשר שוב את שיווי המשקל הבסיסי של הפתרון.
    4. לשאוב את תמיסת ה-PNPE שהוכנה לתוך מודול הזרימה בקצב זרימה של 50 μL/min כדי להשיג ספיחת שיווי משקל בחיישן SiO2 .
      הערה: ה-ΔF אינו משתנה עוד כאשר ה-PNPE נשאב שוב לתוך מודול הזרימה, מה שמעיד על כך שפני השטח של חיישני SiO2 כוסו לחלוטין ב-PNPE.
    5. לשאוב את פתרון ה-bEVs המוכן לתוך מודול הזרימה בקצב זרימה של 50 μL/min כדי לעקוב אחר תהליך הידבקות ה-bEV למשטח ה-PNPE.

6. ניתוח CLSM של קליטת אנטיגן

  1. תרבות משותפת PNPE-OVA עם BMDCs
    1. דגרו את ה-BMDCs עם 1640 מדיות מלאות (1% פניצילין-סטרפטומיצין, 10% סרום בקר עוברי, 20 ננוגרם/מ"ל של IL-4 ו-10 ננוגרם/מ"ל של GM-CSF) במשך 7 ימים, ולאחר מכן זרעו אותם לכלי לייזר קונפוקליים קטנים ב-1 x 106 לכל באר לילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור 5% CO2 .
    2. יש לערבב 0.5 מ"ל של OVA (400 מיקרוגרם/מ"ל) עם 0.5 מ"ל של PNPE למשך שעה אחת ולהסיר את האנטיגן הנוזלי על ידי צנטריפוגה ב-5000 x גרם למשך 20 דקות כדי לפתח נוסחת חיסון. לאחר השעיה מחדש עם 200 μL של מים שעברו דה-יוניזציה, הוסיפו 10 μL של הפורמולה (10 מיקרוגרם/מ"ל OVA) לתוך כלי הלייזר הקונפוקליים הקטנים מתחת לספסל נקי במיוחד ותרבית משותפת עם BMDCs למשך 6 שעות.
  2. כתם שלד אקטין
    1. מוציאים את נוזל התרבית מהתאים ושוטפים אותם פעמיים עם מלח חצוב פוספט שחומם מראש (PBS; pH 7.4).
    2. תקן את התאים עם תמיסת פורמלדהיד 4% ב- PBS למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. במהלך הקיבוע, הימנעו מקיבעים המכילים מתנול, שעלולים להרוס אקטין.
    3. שטפו את התאים עם PBS פעמיים או שלוש בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות כל אחד. חלחלו לתאים עם 100 μL של תמיסת טריטון X-100 0.5% למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. לשטוף את התאים עם PBS פעמיים או שלוש בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות כל אחד שוב.
    4. מכסים את התאים על צלחת תחתית הזכוכית של צלחות הלייזר הקונפוקליות הקטנות עם 200 μL של פלואורסצין איזותיוציאנט (FITC) - תמיסת עבודה מצומדת של פלואורסצין איזותיוציאנט (FITC) ודגרה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. כדי להפחית את אות הרקע, יש להוסיף אלבומין מסרום בקר של 1% לתמיסת העבודה של הפלואידין המצומד ל-FITC. בנוסף, לכסות את המכסה של מנות לייזר קונפוקליות קטנות במהלך הדגירה כדי למנוע אידוי של הפתרון.
    5. לשטוף את התאים עם PBS thre פעמים במשך 5 דקות כל אחד. הכתימו מחדש את הגרעינים ב-200 מיקרון ליטר של תמיסת DAPI (ריכוז: 100 ננומטר) למשך כ-30 שניות.
  3. ניתוח תמונות
    1. הפעל את חומרת המיקרוסקופ הקונפוקלי ברצף, כולל הלייזר, הקונפוקל, המיקרוסקופ והמחשב. לחץ על תוכנת NIS-Elements AR 5.20.00 ובחר Nikon Confocal כדי להיכנס למערכת הבדיקה.
    2. במערכת המיקרוסקופ הקונפוקלי, הפעל את היחידות השונות בסדר שצוין. ראשית, הגדר את ערוצי FITC, DAPI ו- Cy5 והתאם את ה- HV וההיסט המתאימים. לאחר מכן, בחר את עדשת השמן 100x והניח טיפה של שמן ארז על החלק העליון. הניחו את צלחות הלייזר הקונפוקליות הקטנות המכילות BMDCs מוכתמים על במת המיקרוסקופ.
    3. לחץ על לחצן סרוק . תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי, אתר תאים מעניינים על ידי הזזת ציר X, ציר Y וציר Z. כוונן את עוצמת הלייזר, גודל התמונה ופרמטרים אחרים כדי לאפשר סריקת תמונות קונפוקליות באיכות גבוהה. לבסוף, לחץ ללכוד כפתור ושמור את התמונות.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

סוניפיקציה פשוטה של צעד אחד שימשה להשגת PNPE. ראשית, הכנו PNPs אחידים לשימוש כמייצב המוצק (איור 1A). המורפולוגיה של PNPs נצפתה באמצעות SEM, והראתה שהם ברובם אחידים וכדוריים (איור 1B). הגודל ההידרודינמי ופוטנציאל הזטה של הפורמולציות זוהו באמצעות DLS. הקוטר של ה-PNPs הי...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

פיתחנו תחליב שמן/מים מיוצב ננו-חלקיקים PLGA כמערכת אספקה להפנמת אנטיגן משופרת. ל-PNPE המוכן היה משטח צפוף לתמיכה בנקודת הנחיתה ורכות ונזילות ייחודיות למגע תאי חזק עם קרום תא החיסון. יתר על כן, ממשק השמן/מים הציע העמסת אנטיגן בתכולה גבוהה, ו-PLGA אמפיפילי העניק ל-PNPE יציבות גבוהה להובלת אנטיגנים לת?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

המחברים מצהירים על היעדר ניגוד עניינים.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי פרויקט שנתמך על ידי תוכנית המחקר והפיתוח הלאומית של סין (2021YFE020527, 2021YFC2302605, 2021YFC2300142), מ 0 עד 1 פרויקט חדשנות מקורי של תוכנית מחקר מדעית בסיסית של האקדמיה הסינית למדעים (ZDBS-LY-SLH040), הקרן לקבוצות מחקר חדשניות של הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מענק מס '21821005).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
AddVaxInvivoGenVac-adx-10
Cell StrainerBiosharpBS-70-CS70 μm
Confocal Laser Scanning Microscope (CLSM)NikonA1
Cy3 NHS EsterYEASEN40777ES03
DAPI Staining SolutionBeyotimeC1005
Fetal Bovine Serum (FBS)Gibco16000-044
FITC PhalloidinSolarbioCA1620
Mastersizer 2000 Particle Size AnalyzerMalvern
Micro BCA protein Assay KitThermo Science23235
Membrane emulsification equipmentZhongke Senhui Microsphere TechnologyFM0201/500M
Mini-ExtruderAvanti Polar Lipids, Inc
NANO ZSMalvernJSM-6700F
Polycarbonate membranesAvanti Polar Lipids, Inc
Poly (lactic-co-glycolic acid) (PLGA)Sigma-Aldrich26780-50-7Mw 7,000-17,000
Poly-L-lysine SolutionSolarbioP2100
Poly (vinyl alcohol) (PVA)Sigma-Aldrich9002-89-5
QSense Silicon dioxide sensorBiolin ScientificQSX 303Surface roughness < 1 nm RMS
Quartz Crystal MicrobalanceBiosharpQ-SENSE E4
RPMI Medium 1640 basicGibcoC22400500BTL-Glutamine, 25 mM HEPES
Scanning Electron Microscopy (SEM)JEOLJSM-6700F
SqualeneSigma-Aldrich111-02-4

References

  1. Ma, G., Gu, Z., Wei, W. Advanced vaccine delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 183, 114170(2022).
  2. Sharma, J., Carson, C. S., Douglas, T., Wilson, J. T., Joyce, S. Nano-particulate platforms for vaccine delivery to enhance antigen-specific cd8(+) t-cell response. Methods in Molecular Biology. 2412, 367-398 (2022).
  3. Nguyen, T. P., et al. Safety and immunogenicity of nanocovax, a sars-cov-2 recombinant spike protein vaccine: interim results of a double-blind, randomised controlled phase 1 and 2 trial. The Lancet Regional Health. Western Pacific. 24, 100474(2022).
  4. Coates, E. E., et al. Safety and immunogenicity of a trivalent virus-like particle vaccine against western, eastern, and venezuelan equine encephalitis viruses: a phase 1, open-label, dose-escalation, randomised clinical trial. The Lancet Infectious Diseases. 22 (8), 1210-1220 (2022).
  5. Wei, L., et al. Efficacy and safety of a nanoparticle therapeutic vaccine in patients with chronic hepatitis b: a randomized clinical trial. Hepatology. 75 (1), 182-195 (2022).
  6. Krishnan, R., Kim, J. O., Qadiri, S. S. N., Kim, J. O., Oh, M. J. Early viral uptake and host-associated immune response in the tissues of seven-band grouper following a bath challenge with nervous necrosis virus. Fish & Shellfish Immunology. 103, 454-463 (2020).
  7. Mishra, D., Mishra, P. K., Dubey, V., Dabadghao, S., Jain, N. K. Evaluation of uptake and generation of immune response by murine dendritic cells pulsed with hepatitis b surface antigen-loaded elastic liposomes. Vaccine. 25 (39-40), 6939-6944 (2007).
  8. Harwood, L. J., Gerber, H., Sobrino, F., Summerfield, A., Mccullough, K. C. Dendritic cell internalization of foot-and-mouth disease virus: influence of heparan sulfate binding on virus uptake and induction of the immune response. Journal of Virology. 82 (13), 6379-6394 (2008).
  9. Jing, H., et al. Fluorescent artificial antigens revealed extended membrane networks utilized by live dendritic cells for antigen uptake. Nano Letters. 22 (10), 4020-4027 (2022).
  10. Meena, J., Goswami, D. G., Anish, C., Panda, A. K. Cellular uptake of polylactide particles induces size dependent cytoskeletal remodeling in antigen presenting cells. Biomaterials Science. 9 (23), 7962-7976 (2021).
  11. Yang, J., et al. Drug delivery via cell membrane fusion using lipopeptide modified liposomes. ACS Central Science. 2 (9), 621-630 (2016).
  12. Rawle, R., Kasson, P., Boxer, S. Disentangling viral membrane fusion from receptor binding by using synthetic dna-lipid conjugates totether influenza virus to model lipid membranes. Biophysical Journal. 111 (1), 123-131 (2016).
  13. Ha, H. K., Kim, J. W., Lee, M. R., Jun, W., Lee, W. J. Cellular uptake and cytotoxicity of β-lactoglobulin nanoparticles: the effects of particle size and surface charge. Asian-Australasian Journal of Animal Sciences. 28 (3), 420-427 (2015).
  14. Malara, A., et al. Extracellular matrix structure and nano-mechanics determine megakaryocyte function. Blood. 118 (16), 4449-4453 (2011).
  15. Dankovich, T. M., et al. Extracellular matrix remodeling through endocytosis and resurfacing of tenascin-r. Nature Communications. 12 (1), 7129(2021).
  16. Evans, E., Buxbaum, K. Affinity of red-blood-cell membrane for particle surfaces measured by the extent of particle encapsulation. Biophysical Journal. 34 (1), 1-12 (1981).
  17. Rohner, N. A., Purdue, L. N., Von Recum, H. A. Affinity-based polymers provide long-term immunotherapeutic drug delivery across particle size ranges optimal for macrophage targeting. Journal of Pharmaceutical Sciences. 110 (4), 1693-1700 (2021).
  18. Zhou, X., Liu, Y., Wang, X. F., Li, X. M., Xiao, B. Effect of particle size on the cellular uptake and anti-inflammatory activity of oral nanotherapeutics. Colloids and Surfaces B-Biointerfaces. 187, 110880(2020).
  19. Zhang, D., et al. The morphology and surface charge-dependent cellular uptake efficiency of upconversion nanostructures revealed by single-particle optical microscopy. Chemical Science. 13 (12), 3610(2022).
  20. Xi, Y. K., et al. Co2-responsive pickering emulsions stabilized by soft protein particles for interfacial biocatalysis. Chemical Science. 13 (10), 2884-2890 (2022).
  21. Trivedi, R. P., Klevets, I. I., Senyuk, B., Lee, T., Smalyukh, I. I. Reconfigurable interactions and three-dimensional patterning of colloidal particles and defects in lamellar soft media. Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 109 (13), 4744-4749 (2012).
  22. De Araujo, A. D., Hoang, H. N., Lim, J., Mak, J. Y. W., Fairlie, D. P. Tuning electrostatic and hydrophobic surfaces of aromatic rings to enhance membrane association and cell uptake of peptides. Angewandte Chemie. 61 (29), 03995(2022).
  23. Waku, T., et al. Effect of the hydrophilic-hydrophobic balance of antigen-loaded peptide nanofibers on their cellular uptake, cellular toxicity, and immune stimulatory properties. International Journal of Molecular Sciences. 20 (15), 3781(2019).
  24. Meng, X., et al. A soft pickering emulsifier made from chitosan and peptides endows stimuli-responsiveness, bioactivity and biocompatibility to emulsion. Carbohydrate Polymers. 277, 118768(2022).
  25. Wang, Z., et al. Fabrication and in vitro/vivo evaluation of drug nanocrystals self-stabilized pickering emulsion for oral delivery of quercetin. Pharmaceutics. 14 (5), 897(2022).
  26. Ji, J., et al. Core-shell-structured silica/polyacrylate particles prepared by pickering emulsion: influence of the nucleation model on particle interfacial organization and emulsion stability. Nanoscale Research Letters. 9 (1), 534(2014).
  27. Chen, l, et al. Quantitative evaluation of proteins with bicinchoninic acid (bca): resonance raman and surface-enhanced resonance raman scattering-based methods. Analyst. 137 (24), 5834-5838 (2012).
  28. Colino, J., Shen, Y., Snapper, C. M. Dendritic cells pulsed with intact streptococcus pneumoniae elicit both protein- and polysaccharide-specific immunoglobulin isotype responses in vivo through distinct mechanisms. The Journal of Experimental Medicine. 195 (1), 1-13 (2002).
  29. Zhang, Y., Wu, J., Zhang, H., Wei, J., Wu, J. Extracellular vesicles-mimetic encapsulation improves oncolytic viro-immunotherapy in tumors with low coxsackie and adenovirus receptor. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 574007(2020).
  30. Cappellano, G., Abreu, H., Casale, C., Dianzani, U., Chiocchetti, A. Nano-microparticle platforms in developing next-generation vaccines. Vaccines. 9 (6), 606(2021).
  31. McClelland, R. D., Culp, T. N., Marchant, D. J. Imaging flow cytometry and confocal immunofluorescence microscopy of virus-host cell interactions. Frontiers in Cellular Infection Microbiology. 11, 749039(2021).
  32. Konry, T., Sarkar, S., Sabhachandani, P., Cohen, N. Innovative tools and technology for analysis of single cells and cell-cell interaction. Annual Reviews of Biomedical Engineering. 18 (1), 259-284 (2016).
  33. D'Aurelio, R., et al. A comparison of EIS and QCM nanoMIP-based sensors for morphine. Nanomaterials. 11 (12), 3360(2021).
  34. Li, Y. J., et al. Artificial exosomes for translational nanomedicine. Journal of Nanobiotechnology. 19 (1), 242(2021).
  35. Rydell, G. E., Dahlin, A. B., Hook, F., Larson, G. QCM-D studies of human norovirus VLPs binding to glycosphingolipids in supported lipid bilayers reveal strain-specific characteristics. Glycobiology. 19 (11), 1176-1184 (2009).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

187

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved