כימות רנ"א מעגלי באמצעות טיפות דיגיטליות PCR

Summary

פרוטוקול זה מתאר את השיטה המפורטת של טיפות דיגיטליות PCR (dd-PCR) לכימות מדויק של רמות RNA מעגלי (circRNA) בתאים באמצעות פריימרים מסתעפים.

Abstract

תגובת שרשרת פולימראז טיפות דיגיטלית (dd-PCR) היא אחת משיטות הכימות הרגישות ביותר; הוא מחלק את התגובה לכמעט 20,000 טיפות מים בשמן, וה-PCR מתרחש בטיפות הבודדות. ל-dd-PCR יש מספר יתרונות על פני qPCR קונבנציונלי בזמן אמת, כולל דיוק מוגבר באיתור מטרות בשפע נמוך, השמטת גני ייחוס לכימות, ביטול שכפולים טכניים לדגימות והפגנת עמידות גבוהה בפני מעכבים בדגימות. לאחרונה, dd-PCR הפך לאחת השיטות הפופולריות ביותר לכימות מדויק של דנ"א מטרה או RNA לצורך ניתוח ביטוי גנים ואבחון. רנ"א מעגלי (circRNAs) הם משפחה גדולה של מולקולות RNA סגורות קוולנטיות שהתגלו לאחרונה, חסרות קצוות של 5' ו-3'. הודגם כי הם מווסתים את ביטוי הגנים על ידי כך שהם מתפקדים כספוגים עבור חלבונים קושרי RNA ומיקרו-רנ"א. יתר על כן, circRNAs מופרשים לנוזלי גוף, ועמידותם בפני אקסונוקלאזות גורמת להם לשמש כסמנים ביולוגיים לאבחון מחלות. מאמר זה נועד להראות כיצד לבצע תכנון פריימר מסתעף, מיצוי RNA, סינתזת cDNA וניתוח dd-PCR כדי לכמת במדויק רמות RNA מעגליות ספציפיות (circRNA) בתאים. לסיכום, אנו מדגימים את הכימות המדויק של circRNAs באמצעות dd-PCR.

Introduction

ההתקדמות האחרונה בטכנולוגיות ריצוף RNA ואלגוריתמים חישוביים חדשניים גילו חבר חדש במשפחה ההולכת וגדלה של רנ"א שאינם מקודדים, הנקראים RNA מעגלי (circRNA)¹. כפי שהשם מרמז, circRNAs הם משפחה של מולקולות RNA חד-גדיליות ללא קצוות חופשיים. הם נוצרים על ידי שחבור לא-קנוני של ראש-לזנב הנקרא שחבור אחורי, שבו אתר מקבל השחבור במעלה הזרם מתחבר באופן קוולנטי עם אתר תורם השחבור במורד הזרם ויוצר מעגל RNA יציב ^1,2. תהליך זה יכול להיות מתווך על ידי מספר גורמים, כולל אלמנטים חוזרים של Alu הפוכים הנמצאים במעלה הזרם ובמורד הזרם של אקסונים מעגליים, או יכול להיות מתווך על ידי כמה גורמי שחבור או חלבונים קושרי RNA (RBPs)^2,3. רנ"א מעגלי שנוצר באופן בלעדי מהרצף האקסוני או האינטרוני מסווג כ-circRNA אקסוני ו-RNA אינטרוני מעגלי או ci-RNAs, בעוד שחלק מה-circRNAs האקסוניים שומרים על האינטרון ונקראים אקסון-אינטרון circRNAs (EIcircRNAs)^3,4. הפונקציות של circRNA הן רבות פנים, כולל ספוג miRNA ו / או RBP, ויסות שעתוק, וויסות תפקוד התא על ידי תרגום לפפטידים 3,5,6,7. מספר דיווחים הדגישו את החשיבות של circRNAs במחלות שונות ובתהליכים פיזיולוגיים⁸. יתר על כן, דפוסי ביטוי ספציפיים לרקמות ועמידות לעיכול אקסונוקלאז הופכים אותו לסמן ביולוגי פונקציונלי לאבחון מחלות והוא יכול לשמש גם כיעד טיפולי מתאים⁸. בהתחשב בחשיבותו בוויסות הבריאות והמחלות, הכימות המדויק של ביטוי circRNA הוא צורך השעה.

מספר שיטות ביוכימיות פותחו לכימות circRNAs בדגימות ביולוגיות⁹. אחת השיטות הנוחות והמקובלות ביותר לכימות circRNA היא שעתוק הפוך ואחריו תגובת שרשרת פולימראז כמותית (RT-qPCR) באמצעות זוגות פריימרים מסתעפים¹⁰. עם זאת, רוב ה-circRNAs נמצאים בשפע נמוך בהשוואה ל-mRNAs ליניאריים, מה שמקשה לכמת אותם¹¹. כדי להתגבר על בעיה זו, ביקשנו להשתמש בטיפות דיגיטליות PCR (dd-PCR) כדי לכמת את מספר ה-circRNAs בדגימה נתונה באופן מדויק. ה- dd-PCR היא טכנולוגיית PCR מתקדמת הפועלת על פי עקרון המיקרופלואידיקה; הוא מייצר טיפות מימיות מרובות בשמן, וה-PCR מופיע בכל טיפה כתגובה בודדת¹². התגובה מתרחשת בטיפות בודדות ומנותחת באמצעות קורא טיפות, אשר נותן את מספר הטיפות חיוביות או שליליות עבור הגן המעניין¹². זוהי הטכניקה הרגישה ביותר לכימות מדויק של גן בעל עניין, גם אם יש רק עותק אחד בדגימה נתונה. ירידה ברגישות כלפי מעכבים, דיוק טוב יותר והשמטת גן הייחוס לכימות הופכים אותו ליתרון יותר מאשר qPCR^13,14,15 קונבנציונלי. הוא נמצא בשימוש נרחב ככלי מחקר ואבחון לכימות מוחלט של גן בעל עניין^16,17. כאן נתאר את פרוטוקול dd-PCR המפורט לכימות circRNA בהבחנה בין מיוטובים C2C12 של עכברים לבין מיובלסטים של עכברים מתרבים C2C12 באמצעות פריימרים מסתעפים.

Protocol

רנ"א רגיש ל-RNases; לכן, כל הריאגנטים, המכשירים וסביבות העבודה צריכים להיות נטולי RNase ומטופלים בזהירות.

1. תכנון פריימר מסתעף עבור circRNA (ראו איור 1)

1. אחזר את הרצף הבוגר מנתוני ביאור circRNA באמצעות BEDTools או מדפדפן הגנום של UCSC על ידי צירוף רצף האקסון/אינטרון הקיים בין קואורדינטות צומת backsplice^18,19.
2. הכן רצף תבנית PCR באורך של 200 נוקלאוטידים על ידי צירוף 100 הנוקלאוטידים האחרונים של אורך רצף circRNA הכולל ל-100 הנוקלאוטידים הראשונים של רצף circRNA¹⁰.
   הערה: אם אורך ה-circRNA קטן מ-200 נוקלאוטידים, חלקו אותו לשני חצאים שווים והצטרפו לנוקלאוטידים מהמחצית האחרונה ועד תחילת המחצית הראשונה.
3. השתמש ברצף התבניות לעיל לעיצוב פריימר על ידי שימוש בכלי האינטרנט Primer3 והגדרת אורך מוצר PCR הנע בין 120-180 נוקלאוטידים באורך²⁰.
4. השתמש בהגדרות ברירת המחדל של Primer3 עבור פרמטרים אחרים כגון Tm ואורך פריימר. רצפי הפריימרים עבור circBnc2 מפורטים בטבלה 1.
5. הזמינו את רצפי הפריימר המסתעפים לסינתזה מכל חברת סינתזה של אוליגו.

2. בידוד RNA

הערה: בודד RNA כולל מתאי C2C12 של העכבר באמצעות כל ערכות הזמינות מסחרית או שיטת בידוד RNA פנימית. שיטת בידוד הרנ"א הפנימית המשמשת כאן תוארה בעבר²¹. חרוזי הסיליקה המגנטיים מוכנים במעבדה באמצעות פרוטוקול²² שפורסם בעבר. חרוזים מגנטיים אלה ניתן גם לרכוש מספקים שונים.

1. קח מנה אחת בגודל 10 ס"מ המכילה כ-5 x 10⁶ תאי מיובלסט C2C12 מתרבים ומיוטיוב C2C12 מובחן אחד למשך 4 ימים לבידוד RNA.
2. לשטוף את התאים עם 10 מ"ל של 1x PBS שלוש פעמים ולהשליך את PBS באמצעות פיפטה.
3. לגרד את התאים ב 1 מ"ל של 1x PBS באמצעות מגרד תאים, צנטריפוגה אותם ב 4 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות ב 750 x גרם, ולהשליך את PBS באמצעות פיפטה.
4. הוסיפו 1 מ"ל של מגיב בידוד RNA (RIR) והניחו את התאים על ידי פיפטינג^{נמרץ 21}.
5. הוסף 200 μL (1/5 מנפח RIR) של כלורופורם ומערבולת במשך 15 שניות. צנטריפוגה הצינור ב 4 °C במשך 10 דקות ב 12,000 x גרם.
6. קח 400 μL של השכבה המימית העליונה, טען אותו על עמוד סיליקה, צנטריפוגה במשך דקה אחת ב 12,000 x גרם בטמפרטורת החדר. קח את הזרימה לצינור חדש והוסף 600 μL של 100% אתנול.
7. הוסף 20 μL של חרוזי סיליקה מגנטיים והנח את הצינור על תרמומיקסר שנקבע על 25 °C ו 1,200 סל"ד במשך 5 דקות.
   הערה: ניתן להגדיל או להקטין את נפח החרוזים בהתאם למספרי התאים ההתחלתיים שנלקחו לתזה. חרוזי סיליקה מגנטיים ניתן לרכוש מספקים מסחריים.
8. מניחים את הצינור על מעמד מגנטי למשך 30 שניות או עד שהתמיסה מתבהרת. השליכו את הסופר-נטנט בזהירות באמצעות פיפטה.
9. החזירו את חרוזי הסיליקה המגנטיים ב-500 מיקרו-ליטר של מאגר כביסה המכיל 90% אתנול. מניחים את הצינור על המעמד המגנטי למשך 30 שניות. סובב את הצינור פעמיים על המעמד המגנטי כדי לשטוף את החרוזים. תנו לחרוזים להתיישב לכיוון המגנט והשליכו את החיץ באמצעות פיפטה.
10. חזור על שלב 2.9 פעמיים. לאחר הכביסה, סובבו לזמן קצר את הצינור והחזירו אותו למעמד המגנטי למשך 30 שניות. יש להשליך את מאגר הכביסה שנותר. ייבשו את הצינור באוויר בטמפרטורה של 50°C למשך 3 דקות על תרמומיקסר, תוך שמירה על המכסה פתוח.
11. הוסיפו 20 מיקרוליטר מים נטולי נוקלאז והחזירו את החרוזים.
    הערה: ניתן להקטין את נפח ה-RNA עד ל-10 μL כדי להגדיל את ריכוז ה-RNA.
12. מניחים את הצינורות למשך 2-3 דקות בטמפרטורת החדר. החזירו את הצינור למעמד המגנטי ותנו לו לשבת במשך 30 שניות. אסוף את הרנ"א המומס בצינור חדש להערכת כמות ואיכות באמצעות ספקטרופוטומטר.
    הערה: ניתן לאחסן RNA בטמפרטורה של −20 °C או −80 °C לאחסון לטווח ארוך. כדי לקבל תוצאה אופטימלית, מומלץ להמשיך עם שלב סינתזת cDNA למחרת.

3. סינתזת cDNA

1. מדוד את ריכוז הרנ"א באמצעות ספקטרופוטומטר וקח 1 מיקרוגרם של RNA לסינתזת cDNA.
2. ערבבו 1 מיקרוגרם של RNA כולל עם 1 μL של תערובת dNTP (10 mM כל אחד של dATP, dTTP, dGTP ו- dCTP), 4 μL של 5x מאגר טרנסקריפטאז הפוך (RT), 2 μL של 10x RT פריימר אקראי, 0.25 μL של אנזים טרנסקריפטאז הפוך (200 U/μL), ו-0.5 μL של מעכב RNase (40 U/μL), והרכיבו את הנפח עד 20 μL באמצעות מים נטולי נוקלאז.
   הערה: ניתן לשנות את נפח האנזים טרנסקריפטאז הפוך בהתאם לריכוז הרנ"א הראשוני שנלקח לסינתזת cDNA.
3. הקש על הצינור כדי לערבב את התגובה ולסובב לזמן קצר. מניחים את הצינור ב-25°C למשך 10 דקות ולאחר מכן ב-50°C למשך שעה.
4. כדי להשבית את האנזים, מקם את הצינור ב 85 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
5. קרח מקררים את הצינור למשך 2 דקות ומוסיפים 480 μL של מים ללא נוקלאז לצינור כדי להפוך את ריכוז ה-cDNA ל-2 ng/μL.
   הערה: ניתן לאחסן cDNA בטמפרטורה של -20°C או להשתמש בו באופן מיידי לניתוח dd-PCR.

4. זרימת עבודה דיגיטלית של טיפות PCR (dd-PCR)

הערה: זרימת העבודה של dd-PCR כוללת שלבים מרובים, החל מהכנת הדגימה, ולאחר מכן יצירת טיפות, הגברה של PCR, ספירת טיפות וניתוח נתונים. כל שלב הוא קריטי ליצירת נתונים מדויקים מכיוון ש- dd-PCR כרוך בכימות מוחלט של מוצרים ואינו זקוק לשום עקומה סטנדרטית. לפיכך, כל אחד מהשלבים השונים של dd-PCR תואר להלן.

1. הכנת תגובת dd-PCR.
   1. הגדר את תגובת ה- PCR של 22 μL בצינורות או רצועות PCR של 0.2 מ"ל יחד עם צינור בקרה שלילי וצינורות NTC (ללא בקרת תבנית).
      הערה: כל זוג פריימרים שונים לזיהוי של circRNAs שונים חייב להיות בעל תגובת NTC יחד עם דגימות בדיקה.
   2. הוסיפו 11 μL של תערובת מאסטר dd-PCR (למשל, EvaGreen Supermix) ו-11 μL של מים נטולי נוקלאז כדי להגדיר את צינור תגובת הבקרה השלילית.
      הערה: הפשירו את תערובת המאסטר dd-PCR בטמפרטורת החדר ולאחר מכן מערבולת קצרה ליצירת תערובת הומוגנית. השתמש באותם מים נטולי נוקלאז כדי להגדיר את צינור תגובת הבקרה השלילית ואת צינורות ה- NTC ששימשו לדילול ה- cDNA.
   3. הוסיפו 11 μL של תערובת מאסטר dd-PCR, 5.5 μL של תערובת פריימר ספציפית ל-circRNA קדימה ואחורה בריכוז של 1 μM, ו-5.5 μL של מים נטולי נוקלאז כדי להגדיר את צינורות התגובה של NTC.
      הערה: לדלל את הפריימרים המסתעפים הספציפיים ל-RNA המעגלי קדימה ואחורה של מלאי של 100 μM ולערבב כדי להכין ריכוז עבודה של 1 μM של תערובת פריימר circRNA קדימה ואחורה; לפיכך, ריכוז הפריימר הסופי הוא 250 ננומטר בתגובת 22 μL.
   4. הוסף 11 μL של תערובת מאסטר dd-PCR, 5.5 μL של תערובת פריימר ספציפית ל-circRNA קדימה ואחורה של ריכוז 1 μM, ו-5.5 μL של cDNA (2 ng/μL) כדי להגדיר את מבחנות התגובה.
   5. מערבולת ואחריה בקצרה צנטריפוגה של כל צינורות התגובה כדי לקבל תערובת תגובה הומוגנית בתחתית הצינורות.
2. דור טיפות.
   1. העבר את תערובת 20 μL של PCR מצינורות PCR של 0.2 מ"ל לבארות הדגימה של מחסנית מחולל הטיפות.
   2. הוסף 70 μL של שמן לייצור טיפות לבארות הנפט של מחסנית מחולל הטיפות בזהירות באמצעות פיפטה רב ערוצית.
      הערה: יש לדגום את שמן ייצור הטיפות בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות לפני השימוש.
   3. כסו את מחסנית מחולל הטיפות באטם הגומי והניחו אותה במכונת מחולל הטיפות כדי לקבל את תערובת טיפות שמן הדגימה, שנוצרה בבארות הטיפות של המחסנית.
3. הגברת PCR.
   1. העבר 40 μL של תערובת טיפות שמן דגימה מבארות הטיפות של מחסנית מחולל הטיפות לצלחת PCR של 96 בארות באמצעות פיפטה רב ערוצית.
      הערה: העבר בזהירות את תערובת טיפות שמן הדגימה תוך יצירת זווית לבארות דרך קצות הפיפטה הרב-ערוצית כדי למנוע שבירת הטיפות בעת העברתן לצלחת dd-PCR 96-well.
   2. אטמו את צלחת ה-PCR בעלת 96 הבארות עם איטום רדיד האלומיניום, הניחו אותה בבלוק מכונת איטום הצלחות שחומם מראש בטמפרטורה של 80°C, ולחצו על איטום לאיטום צלחת ה-PCR.
   3. כעת, הנח את הצלחת במחזור התרמי dd-PCR והגדר את התוכנית כאמור בטבלה 2 כאשר טמפרטורת המכסה נקבעה על 105 °C וקצב רמפה של 2 °C / s.
4. ספירת טיפות.
   1. לאחר סיום ה-PCR, הניחו את הצלחת על מכונת מונה הטיפות dd-PCR כאשר מחזיק הצלחת נמצא במיקום הנכון לספירת הטיפות.
   2. פתח את תוכנת ניתוח הטיפות והגדר את ההפעלה על-ידי מתן קלט למידע לדוגמה.
   3. לחץ על אפשרות ההגדרה. לאחר מכן, לחץ על אפשרות התבנית כדי לפתוח תבנית חדשה.
   4. הגדר כל באר על ידי הצבת פרטי הניסוי, כגון שם הדגימה (cDNA בשימוש או בקרה שלילית או NTC), שם היעד (שם פריימר circRNA) וסוג (לא ידוע), וסוג הניסוי כ- ABS (כימות מוחלט) ו- Supermix (dd-PCR EvaGreen Supermix) בשימוש וכו '.
   5. לבסוף, שמור את התבנית והתחל את הריצה על ידי לחיצה על אפשרות ההפעלה ובחר ספירה לפי שורה או עמודה. אפשרו למכונה להשלים את ספירת הטיפות, שאורכת כדקה/טוב.
   6. לחץ על לחצן נתח כדי לנתח את הנתונים לאחר השלמת קריאת הטיפות.
   7. לחץ על הלחצן משרעת 1D כדי לראות את הטיפות החיוביות והשליליות
   8. כדי להפריד בין הטיפות החיוביות לבין הטיפות השליליות, שים קו סף משותף לכל הדגימות עם אותה מטרה.
      הערה: סך הטיפות בכל דגימה צריך להיות מעל 10,000 כדי להיחשב לכימות מוחלט. ה- NTC לא אמור להראות ספירות טיפות חיוביות. נוכחות של טיפות חיוביות ב NTC מציין זיהום של ריאגנטים או הגברה של dimers פריימר. קשה לברר אם לטיפות החיוביות יש דימרים ראשוניים או מוצרים לא ספציפיים ב- NTC. מומלץ לבדוק את הפריימרים ולהימנע מכל זיהום של הריאגנטים כפרקטיקה כללית לכל PCR כולל dd-PCR.
   9. לחץ על יצוא לחצן כדי לייצא את הנתונים של ספירת circRNA כקובץ .csv. הנתונים המיוצאים מראים את מספר ה-circRNAs שנמצאים בכל דגימה.
   10. חשב באופן ידני את מספר ה-circRNA בכל דגימה לכל ננוגרם של RNA על-ידי התחשבות בכמות הכוללת של cDNA המשמשת בכל תגובה.

תוצאות

ניתן לגזור את המספר המוחלט של circRNAs בכל דגימה מנתוני dd-PCR המיוצאים. ניתוח PCR כמותי בזמן אמת הציע ביטוי דיפרנציאלי של circBnc2 במיוטיובים המובחנים C2C12 (הנתונים לא מוצגים). כאן, רצינו לבדוק את מספר העותקים המוחלט של circBnc2 בהתפשטות מיובלסטים ומיוטובים C2C12. מכיוון שהביטוי של circBnc2 מושווה ...

Discussion

מחקר CircRNA גדל בעשור האחרון עם גילוי טכנולוגיות ריצוף בתפוקה גבוהה. כתוצאה מכך, היא נחשבה למולקולה פוטנציאלית לטיפולי RNA עתידיים. בנוסף, ידוע כי הוא משמש כסמן ביולוגי במספר מחלות, כולל סרטן ומחלות לב וכלי דם ^4,8. עם זאת, הזיהוי של circRNA הוא מסובך בגלל השפע הנמוך של...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 ml microcentifuge tube	Tarson	500010
0.2 ml tube strips with cap	Tarson	610020, 510073
Filter Tips	Tarson	528104
DNase/RNase-Free Distilled Water	Thermo Fisher Scientific	10977023
Phosphate-buffered saline (PBS)	Sigma	P4417
Cell scrapper	HiMedia	TCP223
Chloroform	SRL	96764
DNA diluent	HiMedia	MB228
Random primers	Thermo Fisher Scientific	48190011
dNTP set	Thermo Fisher Scientific	R0181
Murine RNase inhibitor	NEB	M0314S
Maxima reverse transcriptase	Thermo Fisher Scientific	EP0743
QX200 dd-PCR Evagreen Supermix	Bio-Rad	1864033
Droplet generation oil for Evagreen	Bio-Rad	1864006
PCR Plate Heat Seal, foil, pierceable	Bio-Rad	1814040
DG8 Cartridges and Gaskets	Bio-Rad	1864007
DG8 Cartridge holder	Bio-Rad	1863051
QX200 Droplet Generator	Bio-Rad	1864002
ddPCR 96-Well Plates	Bio-Rad	12001925
PX1 PCR Plate Sealer	Bio-Rad	1814000
C1000 Touch Thermal Cycler with 96–Deep Well Reaction Module	Bio-Rad	1851197
QX200 Droplet Reader	Bio-Rad	1864003
Quantasoft Software	Bio-Rad	1864011
Silica column	Umbrella Life Science	38220090
UCSC Genome Browser		https://genome.ucsc.edu/
Primer 3		https://primer3.ut.ee/