שיטת העשרה לבועיות חוץ-תאיות קטנות שמקורן ברקמת סרטן הכבד

Summary

כאן אנו מתארים את העשרת שלפוחיות חוץ-תאיות קטנות שמקורן ברקמת סרטן הכבד באמצעות שיטת אולטרה-צנטריפוגה דיפרנציאלית אופטימלית.

Abstract

שלפוחיות חוץ-תאיות קטנות (sEVs) שמקורן ברקמה יכולות לשקף את המצב התפקודי של תאי המקור ואת מאפייני החלל הבין-תאי של הרקמה. העשרה יעילה של כלי רכב חשמליים אלה היא תנאי מוקדם חשוב לחקר תפקודם הביולוגי ומפתח לפיתוח טכניקות זיהוי קליניות וטכנולוגיית נשאות טיפולית. קשה לבודד sEV מרקמה מכיוון שהם בדרך כלל מזוהמים מאוד. מחקר זה מספק שיטה להעשרה מהירה של sEV באיכות גבוהה מרקמת סרטן הכבד. השיטה כוללת תהליך בן ארבעה שלבים: דגירה של אנזימי עיכול (collagenase D ו-DNase Ι) עם רקמות, סינון דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר, אולטרה-צנטריפוגה דיפרנציאלית וסינון דרך מסנן קרום של 0.22 מיקרומטר. בשל אופטימיזציה של שלב אולטרה-צנטריפוגה דיפרנציאלית והוספת שלב סינון, טוהר ה- sEV המתקבל בשיטה זו גבוה מזה שהושג על ידי אולטרה-צנטריפוגה דיפרנציאלית קלאסית. הוא מספק מתודולוגיה חשובה ונתונים תומכים לחקר sEV נגזר רקמות.

Introduction

שלפוחיות חוץ-תאיות קטנות (sEVs) הן בקוטר של כ-30 ננומטר עד 150 ננומטר והן מופרשות על ידי תאים שונים¹. הם יכולים לתקשר עם תאי רקמה ולווסת את המיקרו-סביבה המקומית או הרחוקה על ידי העברת מולקולות ביולוגיות חשובות כגון שומנים, חלבונים, דנ"א ורנ"א לאיברים, רקמות, תאים וחלקים תוך-תאיים שונים. לכן, הם יכולים גם לשנות את ההתנהגות של תאים נמענים ^2,3. בידוד וטיהור של כלי רכב חשמליים ספציפיים הוא תנאי מוקדם חיוני לחקר ההתנהגות הביולוגית שלהם במהלך התפתחות המחלה ובמהלכה. אולטרה-צנטריפוגה דיפרנציאלית - הנחשבת לתקן הזהב - משמשת בדרך כלל להפרדת כלי רכב חשמליים מהרקמות שבהן הם שוכנים בדרך כלל⁴. פסולת רקמות, פסולת תאים, שלפוחיות גדולות וגופים אפופטוטיים ניתנים להסרה באמצעות טכניקה זו, ומשאירים רק את ה- sEVs.

הודגם כי Collagenase D ו-DNase I אינם משפיעים על המאפיינים המולקולריים של תאים או שלפוחיות, כאשר התכונות של שני האנזימים תורמות לשחרור שלפוחיות במטריצה החוץ תאית ⁵. אנזימים אלה שימשו למיצוי sEV מרקמת מלנומה גרורתית אנושית, רקמת סרטן המעי הגס ורקמת רירית המעי הגס ^5,6,7. עם זאת, הריכוז וזמן העיכול של collagenase D ו- DNase I בשיטות אלה שונים, מה שמוביל למסקנות לא עקביות. כדי למנוע משקעים משותפים של תת-סוגים אחרים של sEVs, חוקרים הסירו בועיות חוץ-תאיות גדולות יותר (0.1 מיקרומטר או 0.2 מיקרומטר קוטר) על ידי סינון ו / או צנטריפוגה דיפרנציאלית⁸. בהתאם לרקמת המקור, שיטות שונות של בידוד וטיהור עשויות להידרש ^9,10.

שימוש בשיטת האולטרה-צנטריפוגה הדיפרנציאלית המסורתית כדי לחלץ sEV מרקמת הכבד יוצר שכבה של חומר לבן על פני השטח של הסופרנטנט, ללא כל דרך לקבוע את תכונותיו. במחקר קודם¹¹, שכבה זו של חומר לבן נמצאה כמשפיעה על טוהר ה-sEVs. למרות שמספר החלקיקים וריכוז החלבונים של הדגימות שבודדו בשיטה המסורתית היו גבוהים מאלה של השיטה הנוכחית, מקדם השונות היה גדול, אולי משום שמזהמים רבים יכולים להוביל לחזרתיות לקויה של התוצאות. כלומר, באמצעות חומר ניקוי (כלומר, זיהוי מסיסות של חלקיקים ב-1% טריטון X-100), מצאנו כי טוהר ה-sEV המתקבל בשיטה זו היה גדול יותר. לפיכך, אנו משתמשים בשיטה זו כדי לבודד ולטהר sEV שמקורם ברקמת סרטן המעי הגס לצורך מחקר פרוטאומי.

כיום, המחקר על sEVs בסרטן הכבד מתמקד בעיקר בסרום, פלזמה, ואת supernatant של תרבית התא^12,13,14. עם זאת, sEVs שמקורם ברקמת סרטן הכבד יכולים לשקף בצורה מדויקת יותר את הפתולוגיה הפיזיולוגית ואת המיקרו-סביבה הסובבת את סרטן הכבד ולמנוע ביעילות את הפירוק והזיהום של כלי רכב חשמליים אחרים^15,16. עם השימוש אולטרה-צנטריפוגה דיפרנציאלית, שיטה זו יכולה להעשיר את התשואה ולקבל sEV באיכות גבוהה, מתן בסיס חשוב למחקר נוסף של סרטן הכבד. שיטה זו מאפשרת לרקמת סרטן הכבד להיות מופרדת על ידי הפרדה חדה ולהיות מנותקת על ידי collagenase D ו- DNase I. לאחר מכן, פסולת התא, שלפוחיות גדולות, גופים אפופטוטיים מוסרים עוד יותר על ידי סינון אולטרה צנטריפוגה דיפרנציאלית. לבסוף, הרכבים החשמליים מבודדים ומטוהרים למחקרים מאוחרים יותר.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

רקמת סרטן הכבד האנושית נאספה מחולים שאובחנו עם ממאירות בכבד בבית החולים המסונף הראשון של האוניברסיטה הרפואית גנאן. כל החולים חתמו על טופס הסכמה מדעת, ואיסוף דגימות רקמה אנושית אושר על ידי ועדת האתיקה של בית החולים המסונף הראשון של האוניברסיטה הרפואית גנאן. עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים הקשורים לכל החומרים, הציוד והתוכנות המשמשים בפרוטוקול זה.

1. הכנה

1. מניחים את שייקר הסרת הצבע העברה באינקובטור ולהגדיר את הטמפרטורה על 37 °C (77 °F). ראו איור 1 עבור כל שאר הציוד הדרוש.
2. נקו את האזמל והמלקחיים על ידי ריסוס שלהם ב-75% אלכוהול.
3. הכינו את תמיסת העיכול על ידי מדידת 6 מ"ג של collagenase D (4 מ"ג/מ"ל) ו-24 μL של DNase Ι (80 U/mL) והוספתם ל-1.5 מ"ל של RPMI-1640 Basic Medium. מערבבים בהיפוך עדין עד שהתוספים מומסים לחלוטין.
4. מראש, יש להרטיב מסננות תאים של 70 מיקרומטר ו-0.22 מיקרומטר עם 1x מלח חוצץ פוספט (PBS).
5. הניחו צלחת תרבית תאים סטרילית בקוטר 100 מ"מ על ארגז הקרח כדי להחזיק את רקמות הכבד לאחר ההפשרה.
6. בתוך 15 דקות לאחר בידוד רקמת קרצינומה hepatocellular, לשטוף את הדם על פני השטח של בלוק הרקמה עם PBS, להעביר את הרקמה לתוך צינור קפוא סטרילי, ולאחסן אותו ב -80 ° C עד הניסוי לא יותר מ 2 שבועות.

2. דיסוציאציה של רקמות

1. הוציאו את דגימת הרקמה מהמקפיא בטמפרטורה של 80°C והכניסו כ-400 מ"ג של הרקמה - חתוכה לרסיסים של 2 מ"מ x 2 מ"מ x 2 מ"מ - לתוך צלחת תרבית התאים בקוטר 10 ס"מ שעל ארגז הקרח.
2. להעביר את הרקמה לתוך צלחת 6 באר עם 1.5 מ"ל של פתרון העיכול; לאחר מכן, הניחו את הצלחת על שייקר הסרת הצבע של טרנספר (20 סל"ד לדקה) כדי לדגור במשך 20 דקות בטמפרטורה של 37°C לדיסוציאציה מוחלטת של רקמת סרטן הכבד ושחרור של sEVs.
3. מוציאים את צלחת 6 הקידוחים מהאינקובטור ומניחים אותה על ארגז הקרח. הוסף 80 μL של מעכב phosphatase ו 200 μL של פתרון מעכב פרוטאז מלא כדי לעצור את העיכול.
4. העבירו את תמיסת העיכול למסננת התאים בגודל 70 מיקרומטר וסננו אותה לאט כדי להסיר פסולת רקמות גדולה. אספו את התסנין והניחו אותו בצינור צנטריפוגה של 2 מ"ל.

3. אולטרה-צנטריפוגה דיפרנציאלית

הערה: בצע את כל שלבי הצנטריפוגה ב- 4 °C.

1. צנטריפוגה את התסנין ב 500 × גרם במשך 10 דקות ולאסוף את supernatant בצינור צנטריפוגה חדש 2 מ"ל. לאחר מכן ניתן להסיר את רוב פסולת הרקמה הקטנה.
2. צנטריפוגה את הסופרנאטנט במהירות של 3,000 × גרם למשך 20 דקות כדי להסיר פסולת תאים. מעבירים בזהירות את הסופרנאטנט לצינור צנטריפוגה חדש עד שקצה הפיפטה עומד לגעת בחומר הלבן שעל פני השטח.
3. צנטריפוגה את הנוזל הנותר ב 3,000 × גרם במשך 3 דקות; לאחר מכן, שאפו את supernatant כדי להקל על איסוף שלפוחיות. כדי להבטיח את טוהר הרכבים החשמליים, יש לוודא כי החומר הלבן אינו שואף.
4. צנטריפוגה את הסופרנאטנט שנאסף ב 12,000 × גרם למשך 20 דקות ולהעביר 900 μL של supernatant לצינור אולטרה צנטריפוגה 4.7 מ"ל. צנטריפוגה את הנוזל הנותר ב 12,000 × גרם במשך 3 דקות ולאחר מכן לאסוף ולערבב את שני supernatants לתוך אותו צינור ultracentrifuge. מלא את הצינור לחלוטין עם PBS.
5. צנטריפוגה את הסופרנאטנטים ב-100,000 × גרם למשך 60 דקות. השליכו את הסופרנאטנט והשעו מחדש את הגלולה על ידי מילוי צינור האולטרה-צנטריפוגה ב-PBS וצנטריפוגה נוספת ב-100,000 × גרם למשך 60 דקות. להשעות את הגלולה עם 50 μL של PBS.
6. שאפו את מתלה ה-sEV באמצעות מזרק סטרילי בנפח 1 מ"ל וסננו אותו דרך מסנן קרום של 0.22 מיקרומטר. אספו את התסנין בצינור צנטריפוגה של 600 μL ואחסנו אותו בטמפרטורה של -80°C לניתוח נוסף.

4. הערכת איכות ההעשרה

1. התבוננו במורפולוגיה של כלי הרכב החשמליים תחת מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת.
   1. לאחר מכן, יש לזרוק 10 μL של דגימת sEV על רשת נחושת, לדגור בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות, ולנקות אותו עם מים מזוקקים סטריליים, באמצעות נייר סופג כדי להסיר נוזלים עודפים.
   2. יש לטפטף 10 μL של 2% אורניל אצטט על רשת הנחושת לקבלת צביעה שלילית למשך דקה אחת. השתמש בנייר מסנן כדי לספוג את הנוזל על פני רשת הנחושת ולייבש אותו במשך 2 דקות תחת מנורת ליבון.
   3. התבונן ברשת הנחושת תחת מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת ותמונה ב 80 kV.
2. השתמש בציטומטר זרימת ננו-חלקיקים כדי לקבוע את התפלגות הגודל והטוהר של כלי הרכב החשמליים.
   1. לפני הפעלת המכונה, הכינו צינורות המכילים 200 μL של בקרת איכות, 200 μL של ננוספירות סיליקה, 2 x 200 μL של מים טהורים במיוחד, 2 x 200 μL של תמיסת ניקוי, ו 200 μL של PBS.
      הערה: לפני בדיקת דגימות sEV, יש צורך לבצע בקרת איכות במכשיר ולבדוק את תקן גודל החלקיקים (יש לחשב את התפלגות הגודל באמצעות עקומות סטנדרטיות הנוצרות עם מספר ננומיקרוספרות בקטרים שונים [68-155 ננומטר] באותו תנאי זיהוי). חרוזי QC וננו-ספירות סיליקה דוללו פי 100 במים אולטרה-טהורים בנפח כולל של 200 מיקרוליטר.
   2. בדקו את נפח תמיסת הניקוי (>10 מ"ל) ושימו לב להפרש בין רמות נוזל הנדן לנוזל הפסולת (20-30 ס"מ).
   3. כבה את אספקת החשמל העיקרית של המכשיר; לאחר 20 שניות, הפעל את המחשב והמתן לצפצופים המציינים שהמכשיר מחובר כראוי להפעלת התוכנה.
   4. לחץ על Start Up כדי להפעיל את המצלמה, הלייזר ומשאבת האוויר.
   5. לחץ על Sheath Flow-Start Up, והנח מים טהורים במיוחד על פלטפורמת הטעינה. לאחר 4 דקות (הספירה לאחור של המכשיר), לחץ על Sample-Boosting | פריקת דגימה.
   6. לאחר 30 שניות, הניחו את הצינור הריק על פלטפורמת הטעינה ולחצו על Sample-Boosting | פריקת דגימה. לאחר מכן, הניחו את הצינור המחזיק את המים האולטרה-טהורים על פלטפורמת הטעינה, ובו-זמנית, לחצו על Sample-Boosting | נדן זרימה-טיהור.
   7. לחץ על הפעלה ידנית והנח את צינור ריכוז החלקיקים על פלטפורמת הטעינה. לאחר מכן, לחץ על Sample-Boosting למשך דקה אחת ובחר בו זמנית בקרת איכות 250 ננומטר Std FL SiNPs ב- "SAMP. אינף."
   8. לחץ על דגימת דגימה והפעל את הגלאי על ידי לחיצה על SPCM.
      הערה: בשלב זה, ניתן לראות את צורת הגל של האות בזמן אמת.
   9. לחץ על Auto Sampling והזן 1.0 לתוך Sampling SET כדי לתקן את הלחץ ב- 1 KPa. לחץ על סרגל הכלים ובחר אות גדול.
   10. התאם את המיקום האופקי של הלייזר והגדר את הלייזר ל -2 מיקרומטר; לאחר מכן, לחץ על L או R כדי לוודא שהאות חזק ואחיד.
   11. לחץ על Time to Record כדי לאסוף את הנתונים, אשר יקפוץ אוטומטית למאגר בסיום. לאחר מכן, שמור את הנתונים בקובץ Naf ולחץ על פריקת דגימה.
   12. הניחו את צינור פתרון הניקוי על פלטפורמת הטעינה, לחצו על Sample-Boosting, ולאחר דקה לחצו על Sample-Unloading. השתמש במים טהורים במיוחד כדי להסיר את תמיסת הניקוי השיורית מקצה הנימים.
   13. הניחו את הצינור הסטנדרטי בגודל חלקיק על פלטפורמת הטעינה ולחצו על Sample-Boosting למשך דקה אחת.
   14. בחר 68-155 ננומטר Std FL SiNPs בקרת איכות ב "SAMP. Inf" ולחץ על Sample-Sampling. לאחר מכן, לחץ על סרגל הכלים ובחר אות קטן.
   15. לחץ על Time to Record כדי לאסוף את הנתונים, אשר יקפוץ אוטומטית למאגר בסיום. לאחר מכן, שמור את הנתונים בקובץ Naf ולחץ על פריקת דגימה.
   16. הניחו את צינור פתרון הניקוי על פלטפורמת הטעינה, לחצו על Sample-Boosting ולחצו על Sample-Unload לאחר דקה. השתמש במים טהורים במיוחד כדי להסיר את תמיסת הניקוי השיורית מקצה הנימים.
   17. מקם את צינור PBS על פלטפורמת הטעינה; לחץ על Sample-Boosting למשך דקה אחת.
   18. בחר 68-155 ננומטר Std FL SiNPs בקרת איכות ב "SAMP. Inf" ולחץ על Sample-Sampling. לאחר מכן, לחץ על סרגל הכלים ובחר אות קטן.
   19. לחץ על Time to Record כדי לאסוף נתונים, אשר יקפוץ אוטומטית למאגר בסיום. שמור את הנתונים בקובץ Naf ולחץ על Sample-Unload.
   20. הניחו את צינור פתרון הניקוי על פלטפורמת הטעינה, לחצו על Sample-Boosting ו-Sample-Unload לאחר דקה. השתמשו במים אולטרה-טהורים כדי להסיר שאריות תמיסת ניקוי מקצה הנימים.
   21. בדוק את המידע לדוגמה כמתואר קודם לכן בשלבים 4.2.17-4.2.20; שנה את PBS (שלב 4.2.17) למדגם sEV ונתח את הנתונים.
3. זיהוי נוסף של כלי הרכב החשמליים על ידי כתם מערבי.
   1. קבע את ריכוזי החלבונים של כלי הרכב החשמליים והרקמות באמצעות ערכת כימות חלבון BCA בהתאם להוראות היצרן.
   2. חשב את נפח ההעמסה של sEV (למשל, עבור 5 מיקרוגרם חלבון לכל באר) בהתבסס על תוצאות כמותיות אלה. מוסיפים חיץ העמסה ביחס של 1:4 ומערבלים את התערובת.
   3. לאחר דנטורציה באמבט מתכת של 100 מעלות צלזיוס (תרמוסטט יבש) למשך 10 דקות, יש להפריד את החלבון על ג'ל פוליאקרילאמיד 12% במתח של 60 וולט למשך 80 דקות.
   4. מעבירים את הג'ל לקרום פוליווינילידן דיפלואוריד 0.22 מיקרומטר ב-220 mA למשך שעתיים באמצעות מאגר העברה (25 mM Tris, 192 mM גליצין, 20% מתנול).
   5. יש לחסום את הממברנה עם חלב יבש 5% ללא שומן בטווין מלח חוצץ טריס (TBST) למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר ולדגור עם נוגדן ראשוני (נוגדן CD9 חד שבטי אנטי אנושי ארנב, נוגדן CD63 חד שבטי ארנב, נוגדן TSG101 חד שבטי ארנב, נוגדן GM130 חד שבטי עכבר) למשך הלילה ב -4 מעלות צלזיוס. יש לדלל את הנוגדנים הראשוניים בחלב 5% ללא שומן בקנ"מ 1:1,000.
   6. לאחר שלוש שטיפות עם TBST, יש לדגור על הממברנה עם נוגדן משני מצומד (HRP) בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת.
   7. זהה את הנוגדן המקושר ל- HRP באמצעות מצע ניקוי ECL, ולאחר מכן אסוף ונתח את התמונות.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

sEVs מרקמות סרטן כבד אנושיות מילאו תפקיד מכריע באבחון, בטיפול ובפרוגנוזה של חולים עם סרטן הכבד. שיטה זו השתמשה במכשירי מעבדה נפוצים כדי לבודד ולטהר sEV שמקורם ברקמות סרטן הכבד; זה עשוי לספק תמיכה מתודולוגית לחקר sEVs. איור 2 מדגים את התהליך הכללי של העשרת sEV מרקמות סרטן הכבד. sEVs בח...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

פרוטוקול זה מתאר שיטה חוזרת לחילוץ sEV מרקמת סרטן הכבד. sEV באיכות גבוהה מתקבלים על ידי בידוד רקמות חד, טיפול באנזימי עיכול, אולטרה-צנטריפוגה דיפרנציאלית, וסינון וטיהור קרום מסנן 0.22 מיקרומטר. עבור ניתוח במורד הזרם, חשוב מאוד להבטיח את הטוהר הגבוה של sEVs. בתהליך של צנטריפוגה דיפרנציאלית, שכבה של...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 µm Membrane Filter Unit	Millex	SLGPR33RB
1 mL Sterile syringe	Hubei Xianming Medical Instrument Company	YL01329
2% Uranyl Acetate	Electron Microscopy Sciences	22400-2
4.7 mL Centrifuge Tube	Beckman Coulter	361621
6-well Cell cuture plate	LABSELECT	11110
50 mL Beaker	Tianjin Kangyiheng Experimental Instrument Sales Company	CF2100800
70 µm Cell strainer	Biosharp	BS-70-XBS
100 mm Cell culture dish	CELL TER	CS016-0128
600 µL Centrifuge tube	Axygen	MCT060C
BCA protein quantification kit	Thermo Fisher	RJ240544
Beckman Coulter Optima-Max-TL	Beckman	A95761
BioRad Mini trans-blot	Bio-Rad	1703930
BioRad Mini-Protean	Bio-Rad	1645050
CD63 Antibody	Abcam	ab134045
CD9 Antibody	Abcam	ab263019
Centrifuge 5430R	Eppendorf	5428HQ527333
Cleaning Solution	NanoFCM	C1801
Collagenase D	Roche	11088866001
Copper net	Henan Zhongjingkeyi Technology Company	DJZCM-15-N1
Dry Thermostat	Hangzhou allsheng instruments company	AS-01030-00
FITC Anti Human CD9 Antibody	Elabscience	E-AB-F1086C
Glycine	Solarbio	G8200
Goat horseradish peroxidase (HRP)-coupled secondary anti-mouse antibody	Proteintech	SA00001-1
Goat horseradish peroxidase (HRP)-coupled secondary anti-rabbit antibody	Proteintech	SA00001-2
Methanol	Shanghai Zhenxing Chemical Company
Nanoparticle flow cytometer	NanoFCM INC	FNAN30E20112368
Phosphatase inhibitors(PhosSTOP)	Roche	4906845001
Phosphate Buffered Saline(PBS)	Servicebio	G4202
Polyvinylidene Difluoride Membrane	Solarbio	ISEQ00010
QC Beads	NanoFCM	QS2502
RPMI-1640 basic medium	Biological Industries	C11875500BT
Scalpel	Guangzhou Kehua Trading Company	NN-0623-1
Silica Nanospheres	NanoFCM	S16M-Exo
Transference Decoloring Shaker TS-8	Kylin-Bell	E0018
Transmission Electron Microscope	Thermo Scientific	Talos L120C
Tris	Solarbio	T8060
TSG101 Antibody	Proteintech	28283-1-AP
Tweezer	Guangzhou Lige Technology Company	LG01-105-4X