אולטרסאונד ממוקד מונחה תהודה מגנטית בעוצמה גבוהה שנוצר היפרתרמיה: שיטת טיפול אפשרית במודל מורין רבדומיוסרקומה

Summary

מוצג כאן פרוטוקול לשימוש בהיפרתרמיה מבוקרת, הנוצרת על ידי אולטרסאונד ממוקד מונחה תהודה מגנטית בעוצמה גבוהה, כדי להפעיל שחרור תרופות מליפוזומים רגישים לטמפרטורה במודל עכבר rhabdomyoscoma.

Abstract

אולטרסאונד ממוקד מונחה תהודה מגנטית בעוצמה גבוהה (MRgHIFU) הוא שיטה מבוססת לייצור היפרתרמיה מקומית. בהינתן הדמיה בזמן אמת ואפנון אנרגיה אקוסטית, מודל זה מאפשר בקרת טמפרטורה מדויקת בתוך אזור מוגדר. יישומים תרמיים רבים נחקרים באמצעות טכנולוגיה לא פולשנית ובלתי מייננת זו, כגון יצירת היפרתרמיה, לשחרור תרופות מנשאים ליפוזומליים רגישים לחום. תרופות אלה יכולות לכלול כימותרפיות כגון דוקסורוביצין, שעבורן רצוי שחרור ממוקד בשל תופעות הלוואי המערכתיות המגבילות את המינון, כלומר רעילות לב. דוקסורוביצין הוא עמוד התווך לטיפול במגוון גידולים ממאירים והוא נפוץ ברבדומיוסרקומה חוזרת או חוזרת (RMS). RMS הוא הגידול החוץ-גולגולתי הנפוץ ביותר ברקמות רכות מוצקות בקרב ילדים ומבוגרים צעירים. למרות טיפול אגרסיבי ורב-מודאלי, שיעורי ההישרדות של RMS נותרו זהים במשך 30 השנים האחרונות. כדי לחקור פתרון לטיפול בצורך בלתי מסופק זה, פותח פרוטוקול ניסיוני להערכת שחרור דוקסורוביצין ליפוזומלי רגיש לחום (TLD) במודל עכבר RMS סינגני וחיסוני המשתמש ב- MRgHIFU כמקור להיפרתרמיה לשחרור תרופות.

Introduction

Rhabdomyosarcoma (RMS) הוא גידול שריר השלד הנפוץ ביותר אצל ילדים ומבוגרים צעירים¹. מחלה מקומית מטופלת לעתים קרובות באמצעות טיפול רב-מודאלי, כולל כימותרפיה, קרינה מייננת וניתוח. השימוש במשטרי כימותרפיה רב-תרופתיים שכיח יותר בחולים ילדים, עם תוצאות משופרות בהשוואה לעמיתיהם הבוגרים²; עם זאת, למרות מאמצי מחקר מתמשכים, שיעור ההישרדות של 5 שנים נשאר סביב 30% בצורה האגרסיבית ביותר של המחלה ^3,4. סטנדרט הטיפול הכימותרפי הוא משטר תרופות רב הכולל וינקריסטין, ציקלופוספמיד ואקטינומיצין D. במקרים של מחלה חוזרת או חוזרת, כימותרפיה חלופית משמשים, כולל סטנדרטי (חינם) doxorubicin (FD) ו ifosfamide¹. בעוד שלכל הכימותרפיות הללו יש רעילות מערכתית, רעילות הלב של דוקסורוביצין מטילה מגבלת מינון^{לכל החיים 5-7}. כדי להגדיל את כמות התרופה המועברת לגידול ולמזער רעילות מערכתית, פותחו פורמולציות חלופיות, כולל אנקפסולציה ליפוזומלית. אלה יכולים להיות דוקסורוביצין שאינו רגיש לחום, שאושר לטיפול בסרטן השד וקרצינומה הפטוצלולרית, או דוקסורוביצין רגיש לחום, שעבורו נמשכים^{ניסויים קליניים} 8,9,10,11,12,13. שיטות חלופיות למתן תרופות ליפוזומליות מוקפות כגון ליפוזומים רב-שלפוחיתיים וליפוזומים ממוקדי-ליגנד הוערכו ומראות הבטחה לטיפול בגידולים⁹. במחקר זה, לתוספת של חום יש השפעות רב-גורמיות, כולל שחרור תרופות¹⁴. השילוב של היפרתרמיה (HT) שנוצר עם אולטרסאונד ממוקד מונחה תהודה מגנטית בעוצמה גבוהה (MRgHIFU) ודוקסורוביצין ליפוזומלי רגיש לחום (TLD) הוא גישה טיפולית רב-מודאלית חדשנית לשימוש בתרופה רעילה אך יעילה זו לטיפול ב- RMS, תוך מזעור רעילות מגבילה מינון ופוטנציאל להגביר את התגובה החיסונית לגידול.

דוקסורוביצין משתחרר במהירות מ-TLD בטמפרטורות >39 מעלות צלזיוס, הרבה מעל טמפרטורת גוף האדם הממוצעת של 37 מעלות צלזיוס אך לא גבוהה מספיק כדי לגרום נזק לרקמות או אבלציה; זה מתחיל להתרחש ב 43 °C (75 °F), אבל מתרחשת מהר יותר כמו הטמפרטורות מתקרב 60 °C (60 °F)¹⁵. שיטות שונות שימשו ליצירת HT in vivo, כולל לייזרים, מיקרוגל, אבלציה בתדרי רדיו ואולטרסאונד ממוקד, שרבים מהם הם שיטות חימום פולשניות¹⁶. MRgHIFU היא שיטת חימום לא פולשנית ולא מייננת המאפשרת הגדרות טמפרטורה מדויקות ברקמת המטרה באתרה. דימות תהודה מגנטית (MR) מספק הדמיה בזמן אמת, שבה ניתן להשתמש בתוכנת מחשב, כדי לחשב מדידת תרמומטריה של הרקמה לאורך הטיפול; לאחר מכן, ניתן להשתמש בנתונים אלה כדי לשלוט בטיפול האולטרסאונד בזמן אמת כדי להגיע ולשמור על נקודת טמפרטורה רצויה¹⁷. MRgHIFU נבדק בסוגי רקמות שונים וניתן להשתמש בו למגוון רחב של טיפולי טמפרטורה, החל מ- HT קל ועד אבלציה, כמו גם קלינית לטיפול מוצלח בגרורות כואבות^{בעצמות 18}. בנוסף, הוכח כי HT גורם לציטוטוקסיות של הגידול, מווסת את ביטוי החלבונים ומשנה את התגובה החיסונית במיקרו-סביבה של הגידול 19,20,21,22. מחקר אחד שילב HT קל עם TLD, ואחריו אבלציה עם MRgHIFU, בחולדה סינרגטית R1 מודל²³, וכתוצאה מכך נמק בליבת הגידול והעברת תרופות לפריפריה. באופן מסורתי, הקרנות שימשו כטיפול משלים כדי לפגוע בתאי הגידול ולהפחית את הישנות המחלה המקומית. עם זאת, השימוש בו מוגבל על ידי מינון לכל החיים ונזק מחוץ למטרה¹. לכן, HT הוא ייחודי בכך שהוא יכול לגרום לחלק מאותן השפעות ללא אותן רעילות או מגבלות.

מודלים פרה-קליניים של בעלי חיים עבור RMS כוללים מודלים סינגניים של יכולת חיסונית וקסנוגרפטים שמקורם במטופלים (PDX) בפונדקאים מדוכאי חיסון. בעוד שהמודלים מדוכאי החיסון מאפשרים צמיחה של גידולים אנושיים, הם חסרים את המיקרו-סביבה המתאימה לגידול והם מוגבלים ביכולתם לחקור תגובה חיסונית²⁴. מוטציה מפעילת FGFR4 היא סמן מבטיח לפרוגנוזה גרועה ויעד טיפולי פוטנציאלי במבוגרים ובילדים RMS ^1,25. במודלים הסינגניים של RMS שפותחו במעבדת גלאדי, הגידולים מסוגלים לגדול בפונדקאי חיסוני, המפתח תגובות חיסוניות מולדות ונרכשות לגידול²⁶. מכיוון ש-HT משפיע על התגובה החיסונית, התבוננות בשינוי בתגובה החיסונית של מורין היא יתרון חשוב של מודל הגידול הזה. כדי לבחון הן את תגובת הגידול ל-TLD בהשוואה ל-FD, והן את השינוי בתגובה החיסונית של הגידול הן לכימותרפיה והן ל-HT, פותח פרוטוקול לטיפול בגידולי RMS סינגניים של מורין in vivo באמצעות MRgHIFU ו-TLD, שהוא מוקד מחקר זה.

Protocol

המחקר בוצע בהתאם לוועדות הטיפול בבעלי חיים עם פרוטוקולים מאושרים לשימוש בבעלי חיים תחת וטרינר מפקח במרכז לפנוגנומיקה (TCP) ורשת הבריאות האוניברסיטאית (UHN) מרכז משאבי בעלי חיים (ARC) מתקני מחקר בבעלי חיים. כל הנהלים, למעט MRgHIFU, המערבים את בעלי החיים נעשו בארון בטיחות ביולוגי (BSC) כדי למזער את חשיפת בעלי החיים לאוויר חיצוני או לזיהום רגיש.

1. גידול עכברים

הערה: בסך הכל 65 עכברים (זן B6.129S2-Trp53tm1Tyj/J) נכללו במחקר הפיילוט (זכר: n = 23; נקבה: n = 42). עכברים זכרים ונקבות כאחד שימשו בגיל 7-9 שבועות. הגורים שלהם נגמלו ועברו גנוטיפ, והעכברים ההטרוזיגוטיים p53 שימשו לניסויים.

1. אכלסו שתי נקבות עכברים עם כל עכבר זכר כדי ליצור כלובי רבייה. ספרו את גילאי הגורים שלהם מהלידה (לידה = יום 0).
2. ביום ה-10, זהו את הגורים עם חריץ באוזן. אספו חתכי זנב לגנוטיפ לפני הזרקת קו התא.

2. גנוטיפ עכבר

1. יש לחלץ דנ"א מגזירי זנב בקוטר 2 מ"מ שנאספו באמצעות ערכת מיצוי DNA מסחרית (ראה טבלת חומרים), בהתאם להוראות היצרן.
2. לקבוע את ריכוז הדנ"א ואת טוהר הדנ"א על ידי מדידת הספיגה ב 260-280 ננומטר על ספקטרופוטומטר (ראה טבלת חומרים).
3. בצע תגובת שרשרת פולימראז (PCR).
   1. צור תערובת אב המכילה תערובת PCR מסחרית (המכילה Taq פולימראז, dNTPS ו- MgCl 2; ראה טבלת חומרים), פריימר ו- dH₂O ביחס של 12.5:0.25:10.75 (μL) עבור מספר הדגימות הנדרש. הוסף 1 μL של דגימת DNA לכל צינור PCR וכלול dH₂O, דגימת null (הומוזיגוטית עבור מוטציה p53), דגימה הטרוזיגוטית (הטרוזיגוטית עבור מוטציית p53), ודגימת סוג פראי (הומוזיגוטית עבור p53 נורמלי) כבקרת PCR.
   2. הוסף 24 μL של תערובת האב לכל צינור PCR המכיל DNA. פיפטה התמיסה בכל צינור PCR למעלה ולמטה כדי להפיץ את ה- DNA ברחבי תערובת האב.
   3. מניחים את צינורות התגובה במחזור תרמי ומחזורים לפי המפרטים הבאים: 95°C למשך 2 דקות, 40 מחזורים של 95°C למשך 15 שניות, 60°C למשך 15 שניות ו-72°C למשך דקה אחת, ולאחר מכן שומרים על טמפרטורה של 4°C עד שהם מוכנים לניתוח על הג'ל.
4. לנתח את מוצרי PCR באמצעות אלקטרופורזה ג'ל agarose.
   1. מכינים ג'ל 2% (50 מ"ל של 1x TAE ו-1 גרם אגרוז) על ידי חימום האגרוז ב-TAE וערבוב עד להמסה. כאשר מקורר ועדיין נוזלי, להוסיף 2.5 μL של כתם ג'ל DNA לאגרוז ולערבב. יוצקים את הג'ל בקופסת ג'ל עם מסרק. מניחים את הג'ל במכשיר האלקטרופורטי (ראו טבלת חומרים) ומכסים ב-1x TAE.
   2. טען 10 μL של 1 kB DNA סולם על הג'ל. טען 12.5 μL של כל דגימה. הפעל את הג'ל במשך 25 דקות ב 135 V.
   3. דמיינו את הג'ל באמצעות ההגדרות המתאימות לכתם ג'ל הדנ"א המשומש על גבי מכונת הדמיית ג'ל (ראו טבלת חומרים), בהתאם להוראות היצרן.

3. הכנת מודל הגידול (איור 1)

1. יש לגדל את קו התאים M25FV24C (מעבר 12-15) שבוע לפני מועד ההזרקה במצע גדילה מלא (מדיום הנשר המעובד [DMEM] של Dulbecco עם תוספים: 10% FBS, 1% פניצילין/סטרפטומיצין ו-2 mM L-alanyl-L-גלוטמין דיפפטיד) בבקבוק של 75 מ"ל, בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO₂. ברגע שהתאים הם ~80% נפגשים, שאפו את המדיה ושטפו את התאים 1x עם 5 מ"ל של מלח חוצץ פוספט של דולבקו (DPBS).
   הערה: M25FV24C הוא קו תאי מורין שהונדס לבטא יתר על המידה מוטציה FGFR4^V550E, אשר נצפתה בילדים ובמבוגרים RMS ^1,26.
2. הרימו את התאים על ידי הוספת 0.5 מ"ל של תמיסת טריפסין 0.25% לצד הצלחת ודגירת הכלי למשך 2-3 דקות בטמפרטורת החדר. ברגע שהתאים נראים מנותקים, הוסיפו 2.5 מ"ל של מצע גידול מלא בטמפרטורת החדר כדי להשבית את הטריפסין. השתמש aliquot דגימה 10 μL כדי לקבוע את ריכוז התא של תאים קיימא באמצעות hemocytometer ו tripan blue exclusion.
3. הכינו את הנפח הנכון של תאים מרחפים DPBS להזרקה והכניסו לצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל: נפח לצנטריפוגה = (מספר עכברים × מספר תאים לעכבר)/ (ריכוז תאים), כאשר מספר העכברים = העכברים שיש להזריק + 10 עכברים נוספים לטעות, ומספר התאים לעכבר = 10⁴.
4. צנטריפוגה למשך 5 דקות ב 153 x גרם. השהה מחדש את גלולת התא בנפח המתאים (10 מיקרוליטר לעכבר × מספר עכברים) של חיץ הזרקת מיו (מדיה F10 + 0.5% FBS) והזריק את העכברים תוך שעה אחת מהכנת ההשעיה הזו.

4. הזרקת תאים תוך שריריים

הערה: תאי M25FV24C מוזרקים לגפה האחורית הימנית של עכברים בגילאי 4 עד 6 שבועות. הזרקה בגיל 4 שבועות מייצרת עכבר קטן עם גידול שיכול להיות קשה יותר לטיפול מכיוון שיש פחות רקמה מסביב לפיזור HT; המתנה עד 6 שבועות מניבה עכבר גדול יותר, מה שמקל על הטיפול בגידול.

1. הפוך את תרחיף התא מספר פעמים לפני השאיפה כדי לעזור בפיזור שווה של התאים בתוך התמיסה. שאפו 10 מיקרוליטר (10,⁴ תאים) באמצעות מזרק מיקרוליטר (ראו טבלת חומרים). לקשקש את העכבר; לאחר ריסון, גישה לשרירי הירך הקאודלית ניתן להשיג על ידי הארכת הרגל האחורית. יש לגלח את הרגל באמצעות קוצץ ולנגב באתנול 70%.
2. הזריקו את מתלה התאים M25FV24C (10 μL, 10 4 תאים) לשרירי הירך של הגפה האחורית הימנית של עכבר בן^4-6 שבועות באמצעות מזרק מיקרוליטר אטום לגז עם מחט 26s G.
   הערה: יש להחדיר את המחט במקביל לעצם הירך לכיוון הברך, תוך הקפדה שלא לפגוע בעצב הסיאטי. הכנס רק את נקודת המחט (כ -2 מ"מ) בגלל מסת השריר הקטנה של הגפה האחורית.
3. נהל את הפתרון בתנועה מתמדת. הסר את המחט וודא שלא מתרחש דימום. החזירו את העכבר לכלוב שני.
4. להעריך את בעלי החיים מדי יום ולפקח על הגפיים האחוריות שלהם עבור צמיחת הגידול באמצעות מישוש. הרדימו את העכברים באמצעות פחמן דו-חמצני אם נתקלו באחת מנקודות הקצה המוקדמות הבאות: גודל הגידול העולה על 1.5 ס"מ קוטר, כיב גידולי או סימנים סיסטמיים של מחלה (זקפה, יציבה כפופה, חוסר פעילות או ירידה בצריכת מזון או מים).

5. בדיקת MRI

1. מרדימים את העכבר, לרמה שבה אין תנועה עם לחיצת כפות, עם איזופלורן תחת הפרמטרים הבאים: השראה בתא עם 4% ב 1.5 LPM, לאחר מכן להעביר לקונוס האף על מזחלת סורק MRI ולהמשיך תחזוקת isoflurane על חרוט האף עם 1.5%-2% ב 0.75 LPM. חבר את צג הנשימה. יש להשתמש במשחה וטרינרית על העיניים כדי למנוע יובש בזמן הרדמה.
2. דמיינו את העכבר המורדם באמצעות סורק MRI (ראו טבלת חומרים). בתמונה המשוקללת T2 (Ax_Screen רכישה, טבלה 1), שימו לב לממדים בתוך המישור ולמספר הפרוסות הציריות שהגידול מופיע בתוכן. שימו לב למיקום הגידול בהתייחס לעצם הירך ולמשטח הצידי של הירך, לשם ייכנס גל האולטרסאונד.
   הערה: הגידול מופיע כמסה היפר-אינטנסיבית בתוך השריר שאינה סימטרית מהצד הנגדי. גודל גידול התחלתי טוב עבור טיפולים מרובים הוא 2 מ"מ x 2 מ"מ x 2 מ"מ עבור מחקרים חריפים או הישרדות. אם הוא גדול בהרבה, זה יהיה טוב רק למחקרים חריפים מכיוון שהגידול יגיע לנקודת קצה בגודל לפני השלמת שלושה טיפולים שבועיים. קריטריוני ההדרה לטיפול HIFU כוללים: כרוך סביב עצם הירך, קרוב מדי לעצם הירך, אחורי מדי על העכבר, מדיאלי לעצם הירך, קרוב מדי לפי הטבעת.
3. הסר את העכבר מהסורק וקבל משקל בסיסי. לגלח את העכבר ממרכז גופו ועד רגליו תחת הרדמה עם מכונת גילוח חשמלית.
   הערה: באופן אידיאלי, גילוח נעשה יום אחד לפני הטיפול, כפי שהוא מאפשר לעכבר לבצע טיפוח המאפשר קרם depilatory לעבוד בצורה יעילה יותר.
4. לשחזר את העכבר BSC, באמצעות כרית חימום מתחת לקצה אחד של הכלוב. החזירו את העכבר לכלוב כאשר הוא חוזר לשכיבה עצם החזה.

6. ניסוי: טיפול HIFU יום הכנת בעלי חיים

1. כדי להכין את מערכת HIFU (ראו טבלת חומרים) הקטנה, הפעילו את הגנרטור ומלאו את המתמר במספיק מים שעברו דה-יוניזציה עד שהקרום מורחב מתחת למתמר, אך לא יציב עד כדי דחיסת העכבר. משחררים את המים במעגל המתמרים למשך 30 דקות כדי להסיר חמצן מומס מהתווך.
2. הכן את מערכת המחשב המשויכת.
   1. הפעל את המחשב השולט וודא שהוא מחובר באמצעות Ethernet לגנרטור HIFU ובאמצעות USB לתצוגת הבדיקה התרמית. הפעל את התוכנה ולחץ על בית כדי להפעיל את המתמר לפני הכנסת העכבר.
   2. כיול בדיקות תרמיות סיב אופטי: קבל את טמפרטורות החדר הבסיסיות ושים לב לשינוי הטמפרטורה בחדר MRI. שימו לב לגודל סחף הטמפרטורה עבור כל גשושית עקב עוצמת השדה המגנטי. הכנס את בדיקת הטמפרטורה של צינור הסחף לתוך צינור זכוכית מלא גדוליניום לצורך כיול טמפרטורה במהלך הסריקה וחבר את צינור הסחף באמצעות סרט הדבקה.
      הערה: טמפרטורת החדר הבסיסית (צינור סחף) מתווספת ידנית כפרמטר תרמומטריה בממשק המשתמש הגרפי בתוכנה. אזור עניין (ROI) מוגדר בתוך צינור הסחף בתמונת MR כדי לזהות סחף טמפרטורה כלשהו ויתקן אוטומטית את תמונות התרמומטריה.
   3. צייר את התרופה להזרקה לתוך מזרק 1 מ"ל והכנס אותה למשאבת המסירה האוטומטית (ראה טבלת חומרים). יש לכוון את הקו שיתחבר לצנתר וריד זנב העכבר עד שהתרופה תמלא את הקו לחלוטין על ידי לחיצה על כפתור המסירה הידנית במשאבת המסירה האוטומטית.
   4. השתמש במנורת חום כדי לחמם את העכברים בכלובים במשך ~ 20 דקות לפני העברתם לחדר ההרדמה.
      הערה: חימום מקדים מקדם הרחבת כלי דם, אשר תיתקל ברגע העכבר מורדם ומסייע במיקום קטטר.
3. מרדימים את העכבר באיזופלורן (אינדוקציה: 4% ב-1.5 LPM, תחזוקה: 1.5%-2% ב-0.75 LPM) ומעבירים לחרוט באף. החל חומר סיכה הקרנית על העיניים כדי למנוע נזק עקב חוסר רפלקס מצמוץ תחת הרדמה.
4. יש למרוח קרם מסיר שיער על האזור המגולח, כולל כל הגפה האחורית הימנית, ולפעול לפי הוראות היצרן להסרת שיער.
   הערה: מקם את העכבר מתחת למנורת חום בזמן שהוא ב-BSC כדי לסייע בוויסות חום במהלך הסרת שיער בהרדמה.
5. לאחר שטיפת קרם depilatory עם מים חמים, לשקול את העכבר על סולם דיגיטלי להקליט מינון סמים.
6. העבר את העכבר לקונוס אף תואם MRI במזחלת MRI. מקם מנורת חום על העכבר כדי לשמור על חום גופו בזמן ההכנה ל- MRI. הניחו את העכבר בתנוחת הדקוביטוס הצידית כאשר הצד שאינו נושא את הגידול כלפי מטה והגידול מעולה בתוך מחזיק עכבר מודפס בתלת-ממד על המזחלת (איור משלים 1 ואיור 2). ודא מיקום נכון של הגידול (כלומר, במרכז הסליל אופקית ואנכית, כאשר הגובה בדיוק מעל הקצוות של מחזיק העכבר כדי להסביר דחיסה על ידי מתמר אולטרסאונד).
   הערה: במידת הצורך, חתכו מקטע כרית ג'ל אולטרסאונד דחוס כדי לשים מתחת לעכבר, ריפוד החלק התחתון של המחזיק, עם עובי כדי ליישר את הגידול לחלק העליון של המחזיק.
7. יש להרחיק את הרגל הלא מעורבת מרגל הגידול, מתחת לעכבר או מורחבת כאשר רגל הגידול מכופפת. ודא שכפות הרגליים אינן בשדה הקרוב או הרחוק של נתיב הגידול וקרן האולטרסאונד. מקמו את מנורת החום במרחק של 15 ס"מ מהזנב לחימום לצורך החדרת קטטר לווריד הזנב.
8. הכנס את בדיקת טמפרטורת הוושט.
   1. השחילו את בדיקת הוושט דרך חרוט האף ושפשפו את צוואר העכבר. הטה את אף העכבר כלפי מעלה כדי ליצור קו מפיו היישר אל בטנו על ידי הארכת הראש. החלק את הבדיקה התרמית מעל הלשון כ -0.5 ס"מ לתוך הוושט של העכבר והחלף את חרוט האף סביב אפו של העכבר. אבטחו את בדיקת הוושט ואת חרוט האף בחלק העליון של המזחלת.
      הערה: יש לעקוב אחר סימנים של מצוקה נשימתית מיד לאחר ההחדרה מכיוון שהיא עלולה להיות מוחדרת בצורה לא נכונה לקנה הנשימה.
9. הכנס את בדיקת הטמפרטורה הרקטלית.
   הערה: בדיקות הטמפרטורה פי הטבעת והוושט צריכות להיות בטווח של 3 °C (75 °F) זו מזו.
10. מקם את צג הנשימה עם כבל החיבור לכיוון ראש העכבר כדי שלא יפריע למיקום מתמר האולטרסאונד. אבטח באמצעות סרט הדבקה.
11. הכנס צנתר וריד זנב מחט פרפר 27 G לתוך וריד זנב לטרלי המחובר microtubing עם 20 μL של שטח מת וסרט היטב. לאחר ההדבקה, ודא שהקטטר עדיין סומק היטב.
12. השתמש בשני אנשים כדי לשאת את העכבר המוכן, מזחלת העכבר, קו ההרדמה, קו הנשימה, קטטר ורידים זנב וכבלי בדיקה תרמית לתוך סורק MRI, והכנס למחזיק מזחלת MRI.
13. בקש ממפעיל תוכנת HIFU (ראה טבלת חומרים) להזיז את המניסקוס של המתמר ישירות מעל הגידול על ידי בדיקה חזותית ליישור ראשוני²⁷. יש למרוח חומר סיכה לעיניים או ג'ל אולטרסאונד נטול גז על העור חסר השיער שמעל הגידול ולהצמיד את מתמר HIFU לאזור הגידול.
14. חבר את קו אספקת התרופות מהמשאבה האוטומטית לצנתר ורידי הזנב. חשב את כמות השטח המת בקו וריד הזנב והקו המקשר. החלק את מזחלת HIFU של העכבר על מסילות MRI למרכז ה- MRI.
15. הגדר את כמות עירוי התרופה על המשאבה, בהתאם לסוג התרופה וריכוזה ולמשקל החיה, והוסף את כמות השטח המת. כוונו את המשאבה לקצב עירוי של 200 מיקרוליטר/דקה.
    הערה: במחקר זה נעשה שימוש ב-FD וב-TLD בריכוז של 2 מ"ג/מ"ל ובמינון של 5 מ"ג/ק"ג משקל גוף.
16. רשום את טמפרטורות הבדיקה התרמית הבסיסית.
17. מקם את התקן הסעת האוויר (ראה טבלת חומרים) במצב החם ביותר. כוונו את הצינור הנושף אוויר לכיוון העכבר במרכז ה-MRI ומאובטחים באמצעות נייר דבק. מכשיר ההתחממות יופנה מאוחר יותר להגדרה הנמוכה ביותר שלו (32 מעלות צלזיוס) כדי למנוע התחממות יתר של העכבר במהלך סוניקציה.
18. רכוש את הסקר תמונות MR (Ax_Loc, Sag_Loc; טבלה 1) כדי לקבוע את מיקום הגידול עבור מיקוד סוניקציה כולל עומק. כוונן את מיקום המתמר בהתאם באמצעות תוכנת HIFU על-ידי הכנסת מרחק התנועה הרצוי כפי שנמדד בתמונה ולאחר מכן לחיצה על כיוון החץ כדי לזוז (איור 3A). שימו לב גם למיקום צינור הסחף. יש לחזור על הפעולה לפי הצורך.
19. קבע את מיקום נקודת המוקד של המתמר במישור העטרה על-ידי ביצוע סוניקציה רציפה של 'יריית מבחן' רציפה של 5 שניות x 50 mV במהלך רכישת התרמומטריה Test_Shot (טבלה 1).
20. התאם את תמונות סקר MR לתצוגה העטרה של נקודת המוקד בתוכנת HIFU. סקור את התמונות עבור מיקום הגידול, ביחס למבנה הגרמי ופי הטבעת, ושנה את מיקום המתמר לפי הצורך.
21. חזור על סוניקציית צילום הבדיקה במהלך הדמיית תרמית בת תשע חזרות (טבלה 1) כדי לוודא אם יש חימום אחיד ומדויק בנפח הגידול עם חימום מינימלי מחוץ למטרה. כוונן את מיקום הפרוסה, מיקום המתמר ועומק ההיגוי, ואשר את ביצועי החימום באמצעות "צילומי בדיקה" חוזרים לפי הצורך.
22. באמצעות תוכנת ניטור הטיפול HIFU, הגדר את החזר ההשקעה לניטור תרמומטריה בתוך פרופיל החימום הסופי על ידי מדידת המרחק לתנועה ולאחר מכן שינוי קואורדינטות הרשת בתוכנית. הגדר החזר השקעה סביב צינור הסחף לתיקון סחף. הזן את הטמפרטורה הבסיסית בהתבסס על טמפרטורת הבדיקה הרקטלית למדידות תרמומטריה. מערכת HIFU משמשת ליזום סוניקציה לטיפול HIFU ולניטור תרמומטריה.
23. פתח את מפרט הטיפול בהיפרתרמיה של 20 דקות בתוכנה והתחל סוניקציה לאחר איסוף תמונות MR הייחוס והפעלת התרמומטריה.
24. בצעו טיפול של 20 דקות (איור 3B) במהלך הדמיית תרמית (טבלה 1) באמצעות תוכנת בקר פרופורציונלית-אינטגרטיבית-נגזרת (PID) מובנית. הזריקו את התרופה שנבחרה בדקה וחצי, לאחר שהטמפרטורה בהחזר ההשקעה מתחממת לטמפרטורה הרצויה (40 מעלות צלזיוס).
25. עקוב אחר טמפרטורת הליבה לאורך הטיפול. אם טמפרטורת פי הטבעת עולה במהירות במהלך הטיפול, ייתכן שיהיה צורך במיקום מחדש של העכבר כדי למנוע התחממות רקטלית במשך 10 או 20 דקות הטיפול. הפסק את הטיפול אם טמפרטורת פי הטבעת עולה ל >40 מעלות צלזיוס.

7. ניסוי: הדמיית מודל עכבר והליך סוניקציה למחקרים אקוטיים

1. לאחר סיום הטיפול, הסר את העכבר משעמם MRI, הבטחת hemostasis באתר החדרת קטטר וריד הזנב. מעבירים את העכבר ל-BSC ומניחים על חרוט האף להמשך הרדמה.
2. הניחו את העכבר על גבו על כרית סופגת כחולה כשגפיו מרוסנות והלב חשוף.
3. להרדים את העכברים באמצעות exsanguination באמצעות ניקוב לב ואחריו הסרת הלב. קח את הדם מיד צנטריפוגה עבור הפרדת פלזמה ב 10,621 x גרם במשך 10 דקות.
4. לבצע נקרופסיה, ולאחסן את האיברים כנדרש לניתוח. להקפיא את האיברים בחנקן נוזלי ולאחסן ב -80 ° C למשך מספר חודשים או לטווח ארוך במיכל חנקן נוזלי.
5. הומוגניזציה מכנית של רקמת הגידול על ידי הוספת עודף פי תשעה (w/w) של מים שעברו דה-יוניזציה ופירוק הרקמה באמצעות הומוגנייזר המכה בחרוזים. חלץ דוקסורוביצין מ 600 μL של רקמה הומוגנית על ידי הוספה ברצף 75 μL של 300 מ"ג / מ"ל כסף חנקתי, 75 μL של 10 mM חומצה גופרתית, ו 2.5 מ"ל של 1: 1 isopropanol:chloroform. יש לערבב במשך 20 דקות ולאחסן בטמפרטורה של -20°C למשך הלילה.
6. כדי להכין דגימות עבור כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (HPLC), צנטריפוגו את התמיסה משלב 7.5 ב 4,500 x גרם, להסיר את שכבת הממס האורגני, ולייבש את isopropanol:chloroform תחת זרם של גז חנקן. יש להשהות מחדש ב-100 מיקרוליטר של 2:1 MeOH:H₂O. למדוד ריכוז דוקסורוביצין באמצעות HPLC-MS/MS²⁸.

8. ניסוי: הדמיית מודל עכבר והליך סוניקציה למחקרי הישרדות

הערה: למחקרי הישרדות, בצע את הליך הכנת בעלי החיים ביום לטיפול HIFU (שלב 6.1 עד 6.25).

1. לאחר סיום הטיפול, הניחו את העכבר מתחת למנורת חום כדי לאפשר לו להתאושש, ועקבו אחר נשימתו ותנועתו עד שהוא חוזר לשכיבת עצם החזה. לאחר מכן, להחזיר את החיה לכלוב שלה.
   הערה: יש לוודא שמחצית הכלוב נמצאת בקו אחד עם מנורת חום, שכן הוויסות התרמי של בעלי החיים מושפע מההרדמה ומהטיפול ב-HT.
2. עקוב אחר העכברים מדי יום להתנהגות, דפוסי האכלה וקצב נשימה לאיתור סימני מצוקה.
3. בצע טיפולים פעם בשבוע לאחר שלבים 6.1 עד 6.25 במשך 3 שבועות רצופים.
4. פעמיים בשבוע יש לבצע הדמיית MRI של העכברים למדידת הגידול. במשך שבועות במהלך הטיפול, בצע סריקת MRI אחת ואולטרסאונד אחד בכל שבוע. לאחר סיום הטיפול, בצע הדמיית אולטרסאונד דו-שבועית.
5. יש להרדים את העכבר 60 יום לאחר סיום סדרת הטיפולים, או כאשר הגיעו לנקודת קצה הומנית (גודל הגידול >1.5 ס"מ³ או תחלואה מהגידול), ולאחר מכן נקרופסיה עם הסרת הגידול והאיברים לניתוח.

תוצאות

באמצעות פרוטוקול היפרתרמיה שנוצר על ידי MRgHIFU, הגידולים בגפה האחורית היו מסוגלים להיות מחוממים באופן עקבי לטמפרטורה הרצויה שנקבעה למשך הטיפול (איור 4 מראה טיפול מייצג, 10 או 20 דקות, n = 65). כדי להחשיב טיפול כמוצלח, החזר ההשקעה היה צריך להישמר מעל 39 מעלות צלזיוס במשך כל הטיפול, עם ...

Discussion

הפרוטוקול שפותח כאן שימש לטיפול בגידולי גפיים אחוריות באמצעות MRgHIFU לטיפול קל ב-HT ולשחרור תרופות עטופות מליפוזומים in vivo. פרוטוקול זה נתקל במספר שלבים קריטיים במהלך מחקר הפיילוט, ואופטימיזציה של צעדים קריטיים אלה הסבירה את הצלחת הטיפול המשופרת בהשוואה למחקר הפיילוט. הראשון הוא הסרה מל...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5mL Eppendorf tubes	Eppendorf	22363204
1kb plus DNA Ladder	Froggabio	DM015-R500
2x HS-Red Taq (PCR mix)	Wisent	801-200-MM
7 Tesla MRI BioSpec	Bruker	T184931	70/30 BioSpec, Bruker, Ettlingen, Germany
C1000 Thermal cycler	Biorad	1851148
Clippers	Whal Peanut	8655
Compressed ultrasound gel	Aquaflex	HF54-004
Convection heating device	3M Bair Hugger	70200791401
Depiliatory cream	Nair	61700222611	Shopper's Drug Mart
DMEM	Wisent	219-065-LK
DNeasy extraction kit	Qiagen	69504
DPBS	Wisent	311-420-CL
Drug injection system	Harvard Apparatus	PY2 70-2131	PHD 22/2200 MRI compatible Syringe Pump
Eye lubricant	Optixcare	50-218-8442
F10 Media	Wisent	318-050-CL
FBS	Wisent	081-105
Froggarose	FroggaBio	A87
Gel Molecular Imager	BioRad	GelDocXR
Glutamax	Wisent	609-065-EL
Heat Lamp	Morganville Scientific	HL0100	Similar to this product
Intravascular Polyethylene tubing (0.015" ID x 0.043" OD, 20G)	SAI infusion	PE-20-100
Isoflurane	Sigma	792632
M25FV24C Cell line	Gladdy Lab	N/A
Microliter Syringe	Hamilton	01-01-7648
Molecular Imager Gel Doc XR	Biorad	170-8170
Mouse holder	The 3D printing material used was ABS-M30i, and it was printed on FDM Fortus 380mc machine	N/A	Dimensions: length = 43 mm, outer radius = 15 mm, inner width (where the mouse would sit) = 20.7 mm.
MyRun Machine	Cosmo Bio Co Ltd	CBJ-IMR-001-EX
Nanodrop 8000 Spectrophotometer	Thermo Scientific	ND-8000-GL
p53 primers	Eurofins	N/A	Custom Primers
PCR tubes	Diamed	SSI3131-06
Penicillin/Streptomycin	Wisent	450-200-EL
Proteus software	Pichardo lab	N/A
Respiratory monitoring system	SAII	Model 1030	MR-compatible monitoring and gating system for small animals
Small Bore HIFU device, LabFUS	Image Guided Therapy	N/A	LabFUS, Image Guided Therapy, Pessac, France Number of elements 8 frequency 2.5 MHz diameter  25 mm radius of curvature 20 mm Focal spot size 0.6 mm x 0.6 mm x 2.0 mm Motor: axes 2 Generator: Number of channels 8 Maximum electrical power/channel Wel 4 Maximum electrical power Wel 32 Bandwidth 0.5 - 5 MHz Control per channel: Freq., Phase and. amplitude Measurements per channel: Vrms, Irms, cos(theta) Duty Cycle at 100% power % 100% for 1 min. Transducer: Number of elements 8 frequency  2.5 MHz diameter 25 mm radius of curvature 20 mm Focal spot size  0.6 mm x 0.6 mm x 2.0 mm
SYBR Safe	ThermoFisher Scientific	S33102
TAE	Wisent	811-540-FL
Tail vein catheter (27G 0.5" )	Terumo Medical Corp	15253
Thermal probes	Rugged Monitoring	L201-08
Trypan blue	ThermoFisher Scientific	15250061
Trypsin	Wisent	325-052-EL
Ultrasound Gel	Aquasonic	PLI 01-08