שליטה בשבר חלקיקים בפיגומי חלקיקים מחושלים מיקרו-נקבוביים עבור תרבית תאים תלת-ממדית

Summary

מזעור השונות בשבר החלקיקים בתוך פיגומים גרעיניים מקל על ניסויים הניתנים לשחזור. עבודה זו מתארת שיטות ליצירת פיגומים גרעיניים עם שברי חלקיקים מבוקרים עבור יישומים של הנדסת רקמות במבחנה .

Abstract

מיקרו-ג'לים הם אבני הבניין של פיגומי חלקיקים חישוליים מיקרו-נקבוביים (MAP), המשמשים הן לתרבית תאים במבחנה והן לתיקון רקמות in vivo . בפיגומים גרעיניים אלה, הנקבוביות המולדת הנוצרת על ידי החלל הריק בין המיקרו-ג'לים מאפשרת חדירה ונדידה של תאים. שליטה בשבר הריק ובשבר החלקיקים היא קריטית לתכנון פיגומי MAP, שכן נקבוביות היא רמז ביו-אקטיבי לתאים. מיקרוג'לים כדוריים יכולים להיווצר על מכשיר מיקרופלואידי לגודל וצורה מבוקרים ולאחר מכן מיובשים בהקפאה בשיטות המונעות שבירה של רשת הפולימרים. עם התייבשות, המיקרו-ג'לים הליופיליים מובילים לשברי חלקיקים מבוקרים בפיגומי MAP. היישום של שיטות אלה עבור ליופיליזציה של מיקרוג'ל הוביל למחקרים הניתנים לשחזור המראים את ההשפעה של שבר חלקיקים על דיפוזיה של מקרומולקולות והתפשטות תאים. הפרוטוקול הבא יכסה ייצור, ליופיליזציה והתייבשות של מיקרוג'לים לשליטה בשבר חלקיקים בפיגומי MAP, כמו גם חישול המיקרוג'לים באמצעות הצלבה ביו-אורתוגונלית עבור תרבית תאים תלת-ממדית במבחנה.

Introduction

פיגומי חלקיקים חישוליים מיקרו-נקבוביים (MAP) הם תת-מחלקה של חומרים גרגיריים שבהם אבני הבניין של המיקרוג'ל (μgel) קשורות זו בזו ליצירת פיגום נקבובי בתפזורת. עם המיקרו-ארכיטקטורה הייחודית של פיגומים גרעיניים אלה, הנקבוביות המולדת שנוצרת על ידי החלל הריק בין מיקרוג'ל כדורי מקושר תומכת בחדירה מואצת של תאים ובנדידה¹. ניתן לייצר את אבני הבניין של מיקרוג'ל של פיגומי MAP מפולימרים סינתטיים וטבעיים עם שינויים כימיים². השיטות המתוארות כאן מדגישות באופן ספציפי את השימוש במיקרוג'לים המורכבים מעמוד שדרה של חומצה היאלורונית (HA) המותאם עם ידיות נורבורן פונקציונליות (NB). הידית הפונקציונלית NB בפולימר HA תומכת בתגובות כימיה של קליקים ליצירת מיקרו-ג'לים וקישורם יחד ליצירת פיגומי MAP ^3,4. נעשה שימוש בסכמות רבות לקישור המיקרו-ג'לים זה לזה (כלומר, חישול), כגון תגובות אנזימטיות¹, ^5,6 מבוססות אור וכימיה של קליקים ללא תוספים ^3,7 תגובות. כימיה של קליקים ללא תוספים מתוארת בעבודה זו, תוך שימוש בדרישת האלקטרונים ההופכית טטרזין-נורבורן Diels-Alder לחיבור המיקרו-ג'לים של HA-NB.

כדי לייצר פיגומי MAP, המשתמשים מייצרים תחילה את אבני הבניין של המיקרוג'ל באמצעות אמולסיות הפוכות במערכות אצווה או בתוך התקנים מיקרופלואידיים, כמו גם עם ריסוס אלקטרוהידרודינמי, ליתוגרפיה או פיצול מכני². הייצור של מיקרוג'לים כדוריים HA-NB תואר היטב ודווח בעבר באמצעות תחליב אצווה² וטכניקות יצירת טיפות מיקרופלואידיות 8,9,10,11^. בעבודה זו, מיקרו-ג'לים כדוריים של HA-NB נוצרו על פלטפורמה מיקרופלואידית ממוקדת זרימה עבור גודל וצורה מבוקרים, כפי שתואר קודם לכן ^8,9,10. לאחר הטיהור, המיקרוג'לים קיימים בתרחיף מימי ויש לרכז אותם כדי לגרום למצב תקוע. כאשר הם תקועים, מיקרו-ג'לים מפגינים תכונות של דילול גזירה, המאפשרות להם לתפקד כחומרים הניתנים להזרקה וממלאי חלל¹. אחת השיטות להשראת מצב תקוע היא לייבש את המיקרוג'לים באמצעות ליופיליזציה, או ייבוש בהקפאה, ולאחר מכן לייבש מחדש את המוצר המיובש בנפח^{מבוקר 12}. לחלופין, ניתן להסיר את עודפי החיץ מהמיקרוג'ל באמצעות צנטריפוגה מעל מסננת או עם הסרה ידנית של החיץ מכדור המיקרוג'ל על ידי שאיפה או באמצעות חומר סופג. עם זאת, שימוש בצנטריפוגה לייבוש המיקרוג'לים יכול ליצור טווח משתנה מאוד של שברי חלקיקים ושברים ריקים בעת יצירת פיגומים גרעיניים¹². טכניקות לליופיליזציה של מיקרוג'לים תוארו באמצעות 70% IPA עבור מיקרו-ג'לים מפוליאתילן גליקול (PEG)¹³, שמנים פלואורים עבור מיקרו-ג'ל ג'לטין מתקרילויל (GelMa) 14, ו-70% אתנול עבור מיקרו-ג'לים מסוג HA¹². פרוטוקול זה מדגיש שיטות לייבוש מיקרו-ג'ל HA כדורי בייבוש בהקפאה באמצעות 70% אתנול, מגיב מעבדה סטנדרטי, כדי לשמור על תכונות המיקרוג'ל המקוריות במהלך תהליך הייבוש. ניתן לשקול ולייבש את המיקרו-ג'לים של HA המיובשים בהקפאה ולייבש אותם מחדש באחוזי משקל המוגדרים על-ידי המשתמש כדי לשלוט בשברי החלקיקים הסופיים בפיגומי MAP¹².

השלב האחרון ביצירת פיגומים MAP מסתמך על חישול המיקרוג'לים ליצירת פיגום נקבובי^{בתפזורת 1}. על ידי שימוש ברכיבי מטריצה חוץ-תאית מקוריים ושימוש בסכמות חישול ביו-אורתוגונליות, פיגומי MAP משמשים כפלטפורמה תואמת ביולוגית הן לתרבית תאים במבחנה והן לתיקון רקמות in vivo ³. באמצעות גישות אלה, ניתן לייצר פיגומי MAP מאבני בניין HA-NB עם שברי חלקיקים המוגדרים על ידי המשתמש לצורך העסקתם ביישומי הנדסת רקמות¹². הפרוטוקול הבא מתאר את הייצור המיקרופלואידי של מיקרו-ג'לים HA-NB ולאחר מכן ליופיליזציה והתייבשות לשליטה בשבר חלקיקים בפיגומי MAP. לבסוף, שלבים לחישול המיקרוג'לים מתוארים באמצעות כימיה ביו-אורתוגונלית לניסויים בתרביות תאים תלת-ממדיות במבחנה .

Protocol

1. ייצור מכשירים מיקרופלואידיים

1. ליתוגרפיה רכה
   הערה: פרוטוקול זה מתאר ייצור התקן של תכנון התקן מיקרופלואידי ממוקד זרימה מבית de Wilson et ^al.9. עם זאת, פרוטוקול זה יכול לשמש עם כל עיצוב המכשיר על פרוסת SU-8. ניתן להדביק את הוופל לצלחת פטרי, ולאחר מכן יש לבודד אותו כדי למנוע היצמדות של ה-PDMS לתכונות הוופל¹⁵.
   1. ערבבו את בסיס האלסטומר של פולידימתילסילוקסן (PDMS) עם חומר הריפוי (ראו טבלת חומרים) ביחס של 10:1. הכן כ 100 גרם כדי לכסות את רקיק עם ~ 5 מ"מ PDMS. יוצקים את תערובת ה-PDMS על הוופל והדגה במייבש למשך כ-30 דקות. לאחר שכל הבועות נעלמו, הכניסו לתנור לטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס למשך שעתיים לפחות כדי לרפא את ה-PDMS.
   2. השתמש בסכין כדי לעקוב בעדינות סביב הפרמטר של המכשיר מבלי לפצח את הוופל; לאחר מכן, לקלף בזהירות את PDMS מן הוופל. השתמש בניקוב ביופסיה של 1 מ"מ (ראה טבלת חומרים) כדי ליצור את ערוצי הכניסה והיציאה.
      הערה: היה עדין בעת ניקוב ההתקן המיקרופלואידי. קרעים או קרעים סביב תעלות הכניסה או היציאה עלולים לגרום לדליפות במהלך ייצור המיקרוג'ל.
   3. השתמש בסרט כדי להסיר אבק מהמכשיר בצד התכונה. הניחו את המכשירים ושקופיות הזכוכית הנקיות על פלטה חמה בטמפרטורה של 135 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות לפחות כדי להסיר לחות.
   4. במכסה אדים, השתמשו באקדח פלזמה קורונה (ראו טבלת חומרים) גבוה הן על מגלשות הזכוכית והן על המכשירים (תכונה חשופה בצד) במשך כ-30 שניות, ולאחר מכן חברו אותם במהירות יחד. הפעל בעדינות לחץ כדי להבטיח אטימה טובה בין ההתקן למגלשת הזכוכית. הכניסו את המכשירים לתנור של 60 מעלות למשך הלילה כדי לאבטח את הקשר.

2. ייצור מיקרופלואידי של מיקרו-ג'לים של חומצה היאלורונית (HA) עם ידיות פונקציונליות של נורבורן (NB)

1. סינתזת HA-NB
   הערה: סינתזת HA-norbornene (HA-NB) הותאמה מ-Darling et al.3 תוך שימוש ב-79 kDa נתרן HA עם מקבילות טוחנות של 1:1.5:2.5 של יחידות HA-חוזרות ל-4-(4,6-דימטוקסי-1,3,5-טריאזין-2-yl)-4-מתילמורפוליניום כלוריד (DMTMM) ל-5-נורבורן-2-מתילאמין (NMA).
   1. שקלו את המגיבים. ממיסים את ה-HA ב-20 מ"ג/מ"ל ב-200 mM MES buffer (pH ~6) על ידי ערבוב בכוס או בקבוקון על צלחת ערבוב. לאחר ההמסה, הוסיפו את ה-DMTMM לתמיסת ה-HA ואפשרו להגיב במשך כ-20 דקות בטמפרטורת החדר. לדוגמה, 1 גרם HA + 1.09 גרם DMTMM + 845 μL NMA ניתן להשתמש.
   2. הוסף NMA באופן טיפה לתמיסת HA/DMTMM. הוסף פרפילם לפתח כלי התגובה כדי למזער את האידוי ולכסות את כלי התגובה בנייר כסף. ממשיכים לערבב תוך מתן אפשרות לתגובה להימשך כ-24 שעות.
   3. לאחר 24 שעות, צנן 200 אתנול הוכחה (בערך פי 10 מנפח התגובה). על צלחת ערבוב, מעבירים את התגובה טיפה לאתנול המצונן כדי לזרז את ה-HA-NB וממשיכים לערבב ב-200-300 סל"ד למשך 20 דקות.
   4. מעבירים את התמיסה לצינורות חרוטיים של 50 מ"ל, ולאחר מכן צנטריפוגה בעוצמה של 5,000 x גרם למשך 10 דקות. שפכו את עודפי האתנול כדי להשליך כפסולת. בשלב זה, המוצר HA-NB צריך להיות כדורי לבן בצינורות חרוטיים. משכו ואקום על ה-HA-NB בחומר ייבוש לייבוש למשך הלילה.
   5. טהרו את ה-HA-NB באמצעות צינורות דיאליזה תאית חתוכים במשקל מולקולרי של 12-14 kDa (ראו טבלת חומרים). ממיסים את HA-NB בתמיסת NaCl 2 M ומעבירים לצינורות הדיאליזה. קושרים את הצינורות ומהדקים עם מלחציים, במידת הצורך. מעבירים את צינורות הדיאליזה המלאים לדלי עם 5 ליטר מים אולטרה-טהורים ומעבירים את ה-HA-NB כנגד המים למשך הלילה.
   6. למחרת, הסר את המים והחלף בתמיסת NaCl 1 M למשך 30 דקות. הסר את תמיסת NaCl, ולאחר מכן dialyze נגד מים ultrapure במשך 3 ימים, החלפת המים מדי יום.
   7. סנן את המוצר שעבר דיאליזה באמצעות מסנן מונחה ואקום של 0.2 מיקרומטר, ולאחר מכן העבר את המוצר המסונן לצינורות חרוטיים של 50 מ"ל.
   8. הוסף חנקן נוזלי למיכל קריוגני והקפיא את צינורות HA-NB למשך 10 דקות. לאחר מכן, הסר את הצינורות החרוטיים עם מלקחיים והסר במהירות את המכסה והכיסוי עם רקמה ברמת מעבדה (ראה טבלת חומרים). אבטחו את הרקמה בעזרת גומייה והעבירו אותה למיכל או תא ליופיליזציה (ראו טבלת חומרים) ולליופיליז. יש לאחסן את המוצר הlyophilized בטמפרטורה של -20°C.
      אזהרה: חנקן נוזלי הוא חומר מסוכן. ללבוש את ציוד המגן האישי המתאים בעת עבודה עם חנקן נוזלי.
   9. כימות שינוי נורבורן על-ידי המסת ה-HA-NB ב-10 מ"ג/מ"ל ב-D₂O וניתוח באמצעות NMR של פרוטונים (איור 1A)¹⁶.
      1. כדי לקבוע את כמות הפונקציונליזציה, תחילה כייל את שיא הממס D₂O ל-4.8 PPM. שלבו את השיא של פרוטונים מתיל HA (δ2.05) וכיילו את האינטגרציה ל-3.0. לאחר מכן, שלב את הפסגות עבור קבוצות התליון נורבורן ב- δ6.33 ו- δ6.02 (פרוטונים ויניל, אנדו). לנרמל את האינטגרציה של פסגות אלה למספר המתאים של פרוטונים כדי לקבוע את המידה הממוצעת של שינוי³.
2. הכנת מבשר מיקרוג'ל HA-NB
   1. הכן מאגר HEPES של 50 mM (pH 7.5) וסנן סטרילי את המאגר באמצעות מסנן מונע ואקום של 0.2 מיקרומטר. באמצעות מאגר HEPES, הכינו בהתאמה מלאי של 50 mM של ליתיום פניל(2,4,6,-טרימתילבנזואיל)פוספינאט (LAP) יוזם פוטו-יוזם וחומר מפחית טריס(2-קרבוקסיאתיל)פוספין (TCEP). הרחק את פתרון ה-LAP מאור.
   2. הכן את רכיבי מבשר המיקרוג'ל האחרים על ידי הכנת מלאי 50 mM בהתאמה של די-תיול לינקר ופפטיד RGD במים מזוקקים סטריליים. שקלו את HA-NB והתמוססו במאגר HEPES כדי להכין מלאי של 10 מ"ג/מ"ל.
      הערה: ניתן להשתמש במקשרי די-תיול שונים להצלבה פנימית של המיקרו-ג'לים בהתבסס על העדפת המשתמש. הן מקשר מתכלה (כלומר, MMP-cleavable) והן מקשר שאינו מתכלה (dithiothreitol או DTT) נרשמו בטבלת החומרים. פפטיד RGD כלול בנוסחת המיקרוג'ל כדי לקדם הידבקות תאים בפיגומי MAP, אך ניתן להסיר רכיב זה ולהחליפו בנפח שווה של חיץ HEPES.
   3. שלב את הרכיבים המבשרים עם ריכוזים סופיים של 9.9 mM LAP, 0.9375 mM TCEP (4 תיול/TCEP), קישור די-תיול של 2.8 mM, פפטיד RGD של 1 mM ו- 3.5 wt% (w/v) HA-NB על-ידי הוספת מאגר HEPES נוסף כדי להגיע לנפח הסופי הרצוי. מערבבים היטב את המבשר באמצעות פיפטה עקירה חיובית.
   4. בעזרת פיפטה P1000, משכו באיטיות את כל התערובת. שים את הקצה על הקצה של מזרק 1 מ"ל ולהוציא את הקצה מן הפיפטה. משוך את בוכנת המזרק כדי לטעון את התערובת לתוך המזרק, ולאחר מכן הוסף מסנן 0.2 מיקרומטר בקצה המזרק וסנן לתוך צינור microcentrifuge חדש 1.5 מ"ל. צנטריפוגה של פתרון מבשר מסונן כדי להסיר את הבועות המיוצרות במהלך הסינון.
   5. שוב, באמצעות פיפטה P1000, למשוך באיטיות את המבשר המסונן נזהר לא ליצור בועות. אם יש בועות, הקישו בעדינות על הקצה כדי שהן יתנתקו ויצופו למעלה.
   6. מניחים את הקצה על קצהו של מזרק 1 מ"ל ופולטים את הקצה מהפיפטה. שמור את המזרק אנכית ומשוך את הבוכנה מזרק לאט לאט עד כל פתרון מבשר הוא במזרק. מוסיפים מחט קצה קהה למזרק ודוחפים את המבשר דרך קצה המחט. עטפו את המזרק בנייר כסף כדי שלא יהיה אור.
3. הכנת תמיסת צביטה במיקרוג'ל
   1. מכינים 5% v/v Span-80 בשמן מינרלי לבן כבד ומערבבים היטב. ייבוש כדי להסיר בועות. יש לשמור את תערובת החומרים פעילי השטח/שמן בטמפרטורת החדר עטופה בנייר כסף. יש לערבב היטב ולייבש לפני כל שימוש.
   2. השתמשו במזרק של 5 מ"ל כדי להכין את תערובת השמן/חומרים פעילי שטח (צמצמו בועות) עד שהמרחק בין הבוכנה למאחז האצבעות יהיה שווה בערך למרחק של המזרק המבשר. מוסיפים מחט קהה למזרק ודוחפים את השמן דרך קצה המחט.
4. הגדרת מכשיר מיקרופלואידי
   1. הוסיפו מחט קהה למזרק של 1 מ"ל ומלאו בתמיסת טיפול הידרופובית סינתטית (ראו טבלת חומרים). הזרימו בעדינות את התמיסה דרך ההתקן המיקרופלואידי עד שהיא תיאגר בכל כניסה/שקע. תן את הפתרון יבש במכשיר על הספסל במשך כ 30 דקות, ולאחר מכן למשוך ואקום על השקע כדי להסיר תמיסה עודפת. אבטח את המכשיר באמצעות מלחציים על מיקרוסקופ שולחני.
   2. עוטפים צינור חרוטי בגודל 15 מ"ל בנייר כסף ומניחים במדף צינורות שישמש כמיכל איסוף המיקרוג'ל. השתמש במעמד טבעת עם מהדק כדי למקם את בדיקת אור ה- UV בפתח צינור האיסוף. השתמש בגלאי UV (ראה טבלת חומרים) כדי למדוד את עוצמת ה- UV, והזז את הבדיקה עד להשגת 20 mW / cm² . כבה את אור ה- UV עד מאוחר יותר.
   3. חותכים צינורות באורך שיגיע מהמכשיר המיקרופלואידי למיכל האיסוף. בקצה אחד של הצינורות, חותכים זווית של 45 מעלות. הכנס בעדינות את הקצה הזוויתי של הצינורות לערוץ היציאה.
      הערה: היה עדין בעת הכנסת הצינורות להתקן המיקרופלואידי. קרעים או קרעים סביב תעלות הכניסה או היציאה עלולים לגרום לדליפות במהלך ייצור המיקרוג'ל.
   4. אבטחו הן את המזרק המבשר והן את מזרק השמן על משאבת מזרק כפול (ראו טבלת חומרים). חותכים עוד שתי חתיכות של צינורות באורך שיגיע מקצות המזרק למכשיר המיקרופלואידי. בקצה אחד של כל צינור, חותכים זווית של 45°. אבטחו בזהירות את הצינורות (קצה קהה) על שני קצות המזרק.
   5. שנה את ההגדרות במשאבה עבור מזרק 1 מ"ל וכלול את נפח המבשר המשוער. לאט לאט לדחוף את המשאבה קדימה עד מספיק לחץ מופעל על הבוכנות מזרק לדחוף הן את השמן ואת מבשר לקצוות הצינור, הסרת כל אוויר מהמערכת. תנו ללחץ להשתוות 5-10 דקות לפני שתעברו לשלב 2.4.6.
   6. הכנס בעדינות את הקצה הזוויתי של הצינורות לתעלות הכניסה של המכשיר המיקרופלואידי עם תמיסת מבשר המיקרוג'ל בכניסה הקדמית ושמן הצביטה בכניסה האחורית. הזיזו את המשאבה קדימה במרווחים קטנים עד לתחילת הזרימה במכשיר ומיקרו-ג'לים כדוריים מתחילים להיווצר באזור מיקוד הזרימה. הפעל את המשאבה עם קצב זרימה של 0.4 μL לדקה ותן למכשיר לפעול עד שהוא יתייצב. במידת הצורך, התאם את קצב הזרימה ±0.1 μL לדקה במרווחים קטנים כדי לייצב את ייצור המיקרוג'ל.
   7. ברגע שייצור המיקרוג'ל מתייצב כפי שמוצג באיור 1B, החליפו את צינור האיסוף בצינור חדש והפעילו את אור ה-UV. בדוק את הריצה מעת לעת כדי לוודא שייצור המיקרוג'ל יציב לאורך כל הריצה.

איור 1: ייצור מיקרופלואידי של מיקרו-ג'לים של חומצה היאלורונית (HA) עם ידיות פונקציונליות של נורבורן (NB). (A) כ-31% מהיחידות החוזרות של HA שונו בהצלחה עם NB, כפי שנקבע על ידי ניתוח NMR של פרוטונים שבוצע בתחמוצת דאוטריום. ¹ תזוזות H NMR של נורבורן תליון ב-δ6.33 ו-δ6.02 (פרוטוני ויניל, אנדו), ו-δ6.26 ו-δ6.23 ppm (פרוטוני ויניל, אקסו) הושוו לקבוצת המתיל HA δ2.05 ppm כדי לקבוע פונקציונליזציה. נדפס מחדש מתוך אנדרסון ואחרים ¹² באישור אלסבייר. (B) סכמת של התקן מיקרופלואידי ממוקד זרימה המשמש ליצירת HA-NB μgels. (C) הקרנות בעוצמה מרבית ממיקרוסקופיה קונפוקלית שימשו להדמיה של μgels המסומנים באופן פלואורסצנטי (סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר). (D) התפלגויות תדרים של קוטר מיקרוג'ל מריצות עצמאיות על מערך המיקרופלואידי מדגימות שליטה בגודל המיקרוג'ל ~50 מיקרומטר או ~100 מיקרומטר בהתאם למכשיר שבו נעשה שימוש. (E) קוטר המיקרוג'ל מדווח כממוצע וסטיית התקן עבור כל ריצה עצמאית. נדפס מחדש מתוך Wilson et ^al.9 באישורו של ויילי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

3. מיקרוג'לים מטהרים ומייבשים

1. טיהור מיקרוג'לים
   1. הכן את חיץ שטיפת המיקרו-ג'ל (300 mM HEPES, 50 mM NaCl, 50 mM CaCl 2) וכן₂% (w/v) תמיסת חומרים פעילי שטח פלורונית F-127 במאגר כביסה. עקר את הפתרונות באמצעות מסנן מונע ואקום בגודל 0.2 מיקרומטר.
   2. צנטריפוגה של צינור איסוף המיקרוג'ל (5,000 x גרם) למשך 5 דקות. במכסה מנוע סטרילי, שאפו בזהירות את שלב השמן הסופר-טבעי. שלבו את μgels 1:1 עם תמיסת חומרים פעילי שטח F-127 פלורונית 2% ומערבולת כדי לערבב היטב. צנטריפוגה (5,000 x גרם) למשך 5 דקות ושאיפה לתמיסת הכביסה הסופר-טבעית.
   3. הוסיפו את מאגר הכביסה בנפח מיקרוג'ל פי 4 ואת המערבולת כדי לערבב היטב. צנטריפוגה (5,000 x גרם) את התערובת במשך 5 דקות ולשאוף את תמיסת הכביסה. השלימו 4-8 כביסות עם חיץ הכביסה עד להסרת חומר פעילי השטח מהמערכת (כלומר, לא נשארות בועות).
2. תיוג פלואורסצנטי של מיקרו-ג'לים HA-NB
   הערה: הסינתזה הפנימית של טטרזין המסומן באופן פלואורסצנטי מסתמכת על שתי תגובות תוספת תיול-מיכאל מזורזות בסיס בסדרות שתוארו היטב ודווחו בעבר³. עבור עבודה זו, Alexa Fluor-488 היה מצומד עם tetrazine עבור תיוג של μgels שונה norbornene. המוצר הליופילי (קמח אלקסה 488-Tet) מומס בדימתילפורמיד בטמפרטורה של 1 מ"ג/מ"ל ואוחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
   1. כדי לסמן באופן פלואורסצנטי את ה-μgels, הכינו תחילה תמיסה עובדת של Alexa Fluor 488-Tet על ידי דילול מלאי של 1 מ"ג/מ"ל 1:14 ב-PBS סטרילי 1x. במכסה מנוע סטרילי, שלב את μgels עם פתרון העבודה (2:1 לפי נפח).
   2. השתמש פיפטה עקירה ומערבבים היטב. לדגור את התערובת במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר או לילה ב 4 מעלות צלזיוס.
   3. צנטריפוגה (5,000 x גרם) ולשאוף את תמיסת הצביעה. שטפו את ה-μgels פעמיים עם 1x PBS (1:1 לפי נפח) כדי להסיר את Alexa Fluor 488-Tet שלא הופעלה.
      הערה: בשלב זה, ניתן לדמות את ה-μgels המסומנים באופן פלואורסצנטי במיקרוסקופ קונפוקלי כדי לכמת את גודל המיקרוג'ל (איור 1C-E)⁹. שיטות למדידת גודל מיקרוג'ל תוארו ביסודיות על ידי Roosa et ^al.17.
3. ייבוש מיקרוג'לים HA-NB
   1. העבר μgels מטוהרים (איור 2A) לצינור מכסה בורג בטוח לקריו באמצעות פיפטה תזוזה חיובית. הוסיפו 70% אתנול ל-μgels המטוהרים ב-50% (v/v) וערבבו היטב עם פיפטה תזוזה. צנטריפוגה למשך 5 דקות ב 5,000 x גרם.
      אזהרה: אתנול הוא חומר דליק מאוד.
      הערה: ניתן לשקול את שפופרת מכסה ההברגה הבטוחה לקריו לפני הוספת μgels, ולאחר מכן לשקול אותה שוב לאחר ליאופיליזציה כדי לקבוע את המסה של μgels. זה מומלץ כדי למזער את השגיאה בעת שימוש בכמויות פחות מ 1 מ"ג. ודא שקנה המידה מותאם או מכויל באופן פנימי לפני השימוש.
   2. שאפו את הנוזל העל-טבעי והחליפו ב-70% אתנול (50% v/v) (איור 2B). מערבבים היטב עם פיפטה עקירה. לדגור לילה ב 4 °C (64 °F).
      הערה: ניתן לאחסן מיקרו-ג'ל ב-70% אתנול בטמפרטורה של 4°C לפני הליופיליזציה לאחסון לטווח ארוך, במידת הצורך. מיקרו-ג'לים ליופיליים מוצגים באיור 2C. ניתן להשתמש במדיות ליופיליזציה אחרות בשלב זה אם רוצים היווצרות קריוג'ל (איור 2D).
   3. צנטריפוגה קצרה כדי להבטיח שה-μgels נמצאים בתחתית צינור מכסה ההברגה. הוסף חנקן נוזלי למיכל קריוגני, ולאחר מכן הוסף את הצינור של μgels להקפאת הבזק.
   4. לאחר 5-10 דקות, להסיר את הצינור של μgels עם מלקחיים. הסירו במהירות את המכסה וכיסו אותו ברקמה ברמת מעבדה. מהדקים את הרקמה בעזרת גומייה ומעבירים למיכל או תא ליופיליזציה.
   5. טען את הדגימה על הליופיליזר בהתאם להוראות היצרן. Lyophilize ב 0.066 טור ו -63 °C (63 °F). יש לאחסן את ה-μgels הליופיליים (lyo-μgels) כשהם אטומים היטב בטמפרטורת החדר.
      הערה: ליופיליזציה הושלמה כאשר כל הנוזלים מוסרים מהצינור ונותר מוצר מיובש. ממיסים אורגניים יכולים לקצר את תוחלת החיים של גופי הגומי במערכות ליופיליזציה נפוצות.

איור 2: ייבוש מיקרו-ג'לים מסוג HA-NB. (A) הקרנה בעוצמה מרבית של μgels בתמיסה מימית (סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר). (B) ניתן לדגום μgels מטוהרים ביחס של 1:1 לפי נפח במדיום הליופיליזציה המועדף והליופיליזציה. (C) הקרנה בעוצמה מרבית של ליו-μgels מיובשים (סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר). (D) מיקרו-ג'לים עוברים החייאה לאחר ליאופיליזציה. EtOH (70%) מומלץ לשמירה על התכונות המקוריות של μgels לאורך כל תהליך lyophilization; עם זאת, ניתן להשתמש במדיות אחרות כגון איזופרופיל אלכוהול (IPA), מים ואצטוניטריל (MeCN) לסירוגין כדי להקל על היווצרות קריוג'ל (סרגל אבנית = 100 או 50 מיקרומטר כאמור). (E) מדידת קוטר המיקרוג'ל HA-NB לפני (אפור) ואחרי ליופיליזציה (ירוק) ב-70% EtOH מוצגת כהתפלגויות תדרים עבור שלוש אוכלוסיות מיקרו-ג'ל. נדפס מחדש מתוך אנדרסון ואחרים ¹² באישור אלסבייר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

4. ייצור פיגומי MAP

1. סינתזת מקשר טטרזין
   הערה: ניתן להשתמש במקשרי טטרזין כדי לקשר בין μgels הנושאים קבוצות נורבורן חופשיות (איור 3A). הליך הסינתזה של HA-tetrazine (HA-Tet) הותאם מ-Zhang et al.18 תוך שימוש ב-79 kDa נתרן HA עם מקבילות טוחנות של 1:1:0.25 של יחידות HA-חוזרות ל-DMTMM לטטרזין-אמין (איור 3B)¹².
   1. שקלו את המגיבים. ממיסים את ה-HA ב-20 מ"ג/מ"ל ב-200 mM MES buffer (pH ~6) על ידי ערבוב בכוס או בקבוקון על צלחת ערבוב. לאחר ההמסה, הוסיפו את ה-DMTMM לתמיסת ה-HA ואפשרו להגיב במשך כ-20 דקות בטמפרטורת החדר. לדוגמה, 100 מ"ג HA + 72.8 מ"ג DMTMM + 14.14 מ"ג טטרזין-אמין ניתן להשתמש.
   2. ממיסים את הטטרזין-אמין ב-15 מ"ג/מ"ל במאגר MES של 200 mM ומוסיפים טיפה לתמיסת HA/DMTMM. עיין באיור 3C עבור מערך התגובה של HA-Tet.
   3. הוסף פרפילם לפתח כלי התגובה כדי למזער את האידוי ולכסות את כלי התגובה בנייר כסף. ממשיכים לערבב תוך מתן אפשרות לתגובה להימשך כ-24 שעות.
   4. לאחר 24 שעות, צנן 200 אתנול הוכחה (בערך פי 10 מנפח התגובה). על צלחת ערבוב, מעבירים את התגובה באופן טיפה לאתנול המצונן כדי לזרז את ה-HA-Tet (איור 3D) וממשיכים לערבב במשך 20 דקות.
   5. מעבירים את התמיסה לצינורות חרוטיים של 50 מ"ל, ולאחר מכן צנטריפוגה בעוצמה של 5,000 x גרם למשך 10 דקות. שפכו את עודפי האתנול כדי להשליך כפסולת. יש למשוך את השואב על ה-HA-Tet בחומר ייבוש לייבוש למשך הלילה. דוגמה למוצר המיובש בשלב זה בפרוטוקול ניתן למצוא באיור 3E.
   6. לטהר את ה- HA-Tet באמצעות דיאליזה. ממיסים את HA-Tet בתמיסת NaCl 2 M ומעבירים לצינורות דיאליזה תאית עם חיתוך משקל מולקולרי של 12-14 kDa. מעבירים את צינורות הדיאליזה המלאים לדלי עם 5 ליטר מים אולטרה-טהורים, ומעבירים את ה-HA-Tet כנגד המים למשך הלילה.
   7. למחרת, הסר את המים והחלף בתמיסת NaCl 1 M למשך 30 דקות. הסר את תמיסת NaCl, ולאחר מכן dialyze נגד מים ultrapure במשך 3 ימים, החלפת המים מדי יום.
   8. סנן את המוצר שעבר דיאליזה באמצעות מסנן מונחה ואקום של 0.2 מיקרומטר, ולאחר מכן העבר את מוצר HA-Tet המסונן לצינורות חרוטיים של 50 מ"ל.
   9. הבזק להקפיא את הצינורות החרוטיים בחנקן נוזלי במשך 10 דקות, ולאחר מכן להסיר את הצינורות החרוטיים עם מלקחיים. הסירו במהירות את המכסה וכיסו אותו ברקמה ברמת מעבדה. מהדקים את הרקמה בעזרת גומייה ומעבירים למיכל ליופיליזציה או תא וליופיליז. אחסנו את המוצר הליופילי (איור 3F) בטמפרטורה של -20°C.
   10. כימות שינוי הטטרזין על-ידי המסת ה-HA-Tet ב-10 מ"ג/מ"ל ב-D₂O וניתוח באמצעות NMR של פרוטונים (איור 3G)¹⁶.
       1. כדי לקבוע את כמות הפונקציונליזציה, תחילה כייל את שיא הממס D₂O ל-4.8 PPM. שלבו את השיא של פרוטונים מתיל HA (δ2.05) וכיילו את האינטגרציה ל-3.0. לאחר מכן, שלב את הפסגות של קבוצות הטטרזין התליון ב- δ8.5 (2H) ו- δ7.7 (2H) (פרוטונים ארומטיים). לנרמל את האינטגרציה של פסגות אלה למספר המתאים של פרוטונים כדי לקבוע את המידה הממוצעת של שינוי¹².
2. קישור ליו-μgels ליצירת פיגומי MAP לאפיון
   1. הכן את רכיבי פיגום MAP (כלומר, μgels, HA-Tet, נפח התייבשות). שקלו את הליו-מיקרונים (איור 4A) ושחזרו ב-84% מנפח ה-MAP הסופי של 1x PBS. אפשרו למיקרו-ג'לים להתנפח במשך כ-20 דקות (איור 4B,C). ניתן לבחור את ה-wt% MAP המשמש להתייבשות על סמך העדפת המשתמש לשבר חלקיק סופי (עיין באיור 4D, E).
   2. ממיסים את ה-HA-Tet ב-PBS 1x בריכוז הנבחר (ראו הערה בהמשך).
      הערה: שינוי חלק האריזה (באמצעות wt% MAP) כמו גם הריכוז של HA-Tet ישנה תכונות מכניות של פיגומים בתפזורת. לדוגמה, פיגום MAP של 3.4 wt% עם 0.02 מ"ג/מ"ל HA-Tet (יחס חישול של 2.6 מול טט:מול HA-NB) מייצר פיגומי MAP עם כ-700 מודולוס אחסון גזירה Pa¹².
   3. השתמש פיפטה תזוזה כדי לשלב את HA-Tet ו lyo-μgels ומערבבים היטב. בשלב זה, ניתן להעביר את התערובת באמצעות פיפטה תזוזה על גבי מגלשות זכוכית, צלחות באר או מיכל לבחירת המשתמש. יש לאפשר ל-μgels לרדת בטמפרטורה של 37°C למשך 25 דקות, ולאחר מכן להשתמש במרית כדי להעביר את פיגומי MAP ללוחות באר מלאים ב-PBS אחד. שמור את פיגומי MAP ב- PBS אחד עד שיהיו מוכנים לאפיון.
3. חישוב שבר חלקיקי פיגום MAP
   1. לקבלת איכות תמונה משופרת, העבר פיגום MAP לכיסוי זכוכית באמצעות מרית. Image MAP פיגומים על מיקרוסקופ קונפוקלי באמצעות הלייזר לעירור ופליטה של FITC. Image MAP פיגומים על מטרה של פי 20 ומקבלים מחסנית Z שחוצה 250-300 מיקרומטר בכיוון Z עם גודל צעד של 2.5 מיקרומטר. רשום לעצמך את כיול המיקרומטר/פיקסל של התמונה.
   2. ייבא את תמונת Z-stack לתוכנת הניתוח (ראה טבלת חומרים). בחר בלחצן הוסף משטחים חדשים . סמן את התיבה לפלח רק אזור עניין ולאחר מכן בחר בלחצן החץ הכחול הבא: אזור עניין.
   3. הגדר אזור עניין, תוך מעקב אחר ממדי X, Y ו- Z של אמצעי האחסון המנותחים. בחר בלחצן החץ הכחול הבא: ערוץ מקור.
      הערה: מידות X ו- Y הן ביחידות פיקסלים ואילו ממד Z הוא מספר הצעדים. גובה Z מומלץ עבור אזור העניין צריך לכלול מינימום של שני μgels.
   4. השתמש ברשימה הנפתחת ערוץ מקור כדי לבחור את ערוץ FITC. סמן את התיבה לצד חלק והזן פרט משטח של 2.50 מיקרומטר. תחת סף, בחר עוצמה מוחלטת ולאחר מכן בחר בלחצן החץ הכחול הבא: סף.
   5. השתמש בערך הסף המוצע עבור ערוץ FITC. סובב את ההקרנה התלת-ממדית כדי להעריך את איכות הרינדור והתאם לפי הצורך. בחר הבא: סווג משטחים.
      הערה: ניתן להשתמש בלחצן ' הקודם' כדי לערוך שלבים קודמים בתהליך, כגון Z-dimension, לפי הצורך.
   6. בדוק אם מספר Voxels הוא 10.0, ולאחר מכן בחר בלחצן החץ הכפול הירוק סיום: בצע את כל שלבי היצירה וסיים את האשף.
      הערה: ניתן לאחסן פרמטרים של עיבוד אמצעי אחסון לניתוח אצווה, כך שאותן הגדרות יוחלו על ניתוח כל הפיגומים.
   7. כדי לייצא את הנתונים, בחר בכרטיסיה סטטיסטיקה ולאחר מכן בכרטיסיה מפורט . השתמש בתיבה הנפתחת השנייה כדי לבחור את המשתנה עוצמת קול. בחר בלחצן התקליטון ייצא נתונים סטטיסטיים בתצוגת טאבים לקובץ ושמור כקובץ גיליון אלקטרוני (.xls) כשתתבקש לעשות זאת.
   8. פתח את הקובץ והשתמש בפונקציה SUM ב - Column A Volume כדי לקבוע את הנפח הכולל (μm³) של μgels באזור העניין.
   9. המר את הממדים של אזור העניין שנותח מפיקסלים ל- μm. השתמש בכיול μm/pixel של התמונה משלב 4.3.1 כדי להמיר את המידות X ו- Y. הכפל את ממד Z (מספר הצעדים) בגודל הצעד של התמונה כדי להמיר את ממד Z ל- μm. חשב את נפח אזור העניין (μm³) על-ידי הכפלת הממדים X, Y ו-Z.
   10. כדי לקבוע את חלק החלקיקים של הפיגום, חלק את הנפח הכולל של μgels באזור העניין (נמצא בשלב 4.3.8) בנפח של אזור העניין (נמצא בשלב 4.3.9).

איור 3: סינתזה של מקשר טטרזין לייצור פיגומי חלקיקים חישוליים מיקרו-נקבוביים (MAP). (A) סכמת של HA-NB μgels המקושרת עם מקשר טטרזין ליצירת פיגומי MAP. (B) סכמת תגובה לסינתזת HA-Tet. (C) תגובת HA-Tet הוגדרה והותר לה להגיב במהלך הלילה ואחריה (D) משקעים של HA-Tet באתנול. (E) לאחר טיהור וייבוש, ה-HA-Tet התייבש מחדש ועבר ליופיליזציה כדי להניב (F) מוצר מיובש בצבע ורוד בהיר. (G) ניתוח פרוטון NMR מראה שינוי מוצלח של 11% מיחידות החזרה של HA. נדפס מחדש מתוך אנדרסון ואחרים ¹² באישור אלסבייר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 4: התייבשות של מיקרו-ג'לים ליופיליים לייצור פיגומי MAP. (A) הקרנה בעוצמה מרבית של ליו-מיקרונים מיובשים (סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר). (B) לאחר ייבוש בהקפאה, הודגם כי התייבשות של ליו-μgels אורכת כ-20 דקות (סרגל אבנית = 100 מיקרומטר). (C) ניתן לייבש את Lyo-μgels ב-wt% MAP משתנה כדי לייצר μgels תקועים (סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר). (D) הגדלת ה-wt% MAP בעת ייבוש מחדש של ליו-מיקרו-ג'ל משנה את שבר החלקיקים בפיגומי MAP, כפי שמוצג על-ידי פרוסות Z בודדות של פיגומי MAP ותחזיות נפח (סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר). (E) באמצעות פיגומי wt% MAP אלה, המוגדרים על-ידי המשתמש, ניתן להשיג שברי חלקיקים ייחודיים (NL = μgels שאינם lyophilized). ANOVA חד-כיווני עם Tukey HSD בוצע על הדגימות (n = 3), עם מובהקות שדווחה ב- p < 0.05 (*), p < 0.01 (**), p < 0.005 (***) ו- p < 0.001 (****). נדפס מחדש מתוך אנדרסון ואחרים ¹² באישור אלסבייר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

5.3D תרבית תאים בפיגומי מפה

1. הכנת התקנים של תרביות תאים
   1. כדי ליצור התקן תרבית תאים מותאם אישית לניסויים האלה (איור 5A-C), השתמש במדפסת תלת-ממד כדי להדפיס תבנית שלילית באמצעות קובץ ה-CAD שנמצא בקובץ קידוד משלים 1.
      הערה: הממדים של התקן תרבית התאים הם כדלקמן: 94.9 מ"מ x 94.9 מ"מ x 4.8 מ"מ עם 2.6 מ"מ גובה כולל היטב. קוטר הבארות הפנימיות והבארות החיצוניות הוא 4 מ"מ ו -6 מ"מ, בהתאמה.
   2. מערבבים בסיס אלסטומר פולידימתילסילוקסן (PDMS) עם חומר הריפוי ביחס של 10:1 לפי מסה. יוצקים את תערובת ה-PDMS לתוך צלחת פטרי גדולה מפלסטיק ודגה בייבוש למשך כ-30 דקות או עד שכל הבועות נעלמות.
   3. לאחר שכל הבועות נעלמו, הכניסו בזהירות את התבנית המודפסת בתלת-ממד לתוך ה-PDMS כדי למזער את היווצרותן של בועות חדשות. מכניסים לתנור ל-60 מעלות למשך שעתיים לפחות כדי לרפא את ה-PDMS.
   4. השתמש בסכין או סכין גילוח כדי לעקוב בעדינות סביב הפרמטר של התקן התרבית, ולאחר מכן להסיר בזהירות את התבנית. השתמש באגרוף ביופסיה של 4 מ"מ כדי להסיר כל PDMS מתחתית הבארות. חותכים את המכשירים כך שיתאימו לכיסוי זכוכית.
      הערה: ניתן להצמיד מכשירי תרבית תאים גם לשקופיות זכוכית, אך כיסויי זכוכית משפרים את הדמיית הדגימה.
   5. השתמש בסרט כדי להסיר אבק מהצד התחתון של התקני התרבית. הניחו את כיסויי הזכוכית הנקיים ואת מכשירי התרבית (הצד התחתון למעלה) על פלטה חמה בטמפרטורה של 135 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות לפחות כדי להסיר לחות.
   6. במכסה אדים, השתמשו באקדח פלזמה קורונה גבוה הן על כיסוי הזכוכית והן על הצד התחתון של המכשיר למשך 30 שניות, ולאחר מכן חברו במהירות את המשטחים המטופלים זה לזה. הפעילו בעדינות לחץ כדי להבטיח אטימה טובה בין התקן התרבית לכיסוי הזכוכית.
   7. חזור על שלב 5.1.6 עבור כל המכשירים, ולאחר מכן הכנס לתנור של 60 מעלות למשך הלילה כדי לאבטח את הקשר. יש לעקר את המכשירים באופן אוטומטי לפני השימוש במבחנה.
2. תרבית תאים בפיגומי MAP
   1. הכן את רכיבי פיגום MAP (כלומר, μgels, HA-Tet, נפח מדיה) בהתבסס על שבר החלקיקים הרצוי (עיין באיור 4D-E). שקלו את הליו-מיקרונים במכסה מנוע סטרילי ושחזרו ב-84% מנפח ה-MAP הסופי של מדיית התאים בהתבסס על ה-wt% MAP שנבחר. אפשרו ל-μgels להתנפח במשך כ-20 דקות.
      הערה: שיטות אלה דורשות מהמשתמש לשקול את מוצר הליו-מיקרוג'ל לצורך התייבשות. עבור מסות קטנות (1 מ"ג או פחות), מומלץ לשקול תחילה את הקריו-טיוב לפני הוספת ו-lyomilizing μgels, ולאחר מכן לשקול מחדש את הצינור לאחר lyophilization כדי לקבוע את המסה של המוצר כדי למזער את השגיאה.
   2. ממיס את ה-HA-Tet במדיה התאית ב-16% מנפח ה-MAP הסופי.
      הערה: השלבים הבאים להכנת תאים לזריעה בפיגומי MAP ניתנים לשינוי בהתאם לסוג התא שבו נעשה שימוש. בפרוטוקול זה, תאים מזנכימליים של עכבר D1 גודלו ב-Modified Eagle Medium (DMEM) של דולבקו, בתוספת 1% פניצילין-סטרפטומיצין (עט-סטרפ) ו-10% סרום בקר עוברי (FBS) (ראו טבלת חומרים). יש לעקוב אחר פרוטוקולים סטנדרטיים של תרביות תאים דבקים עבור תאים אלה, כאשר התרביות נשמרות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO₂ בכלי תרבית שטופלו בתרביות רקמה.
   3. לאחר שתאי D1 mouse mesenchymal הגיעו למפגש של 70%-80%, שאפו את המדיה ושטפו את התאים עם PBS אחד. הרם את התאים על ידי הוספת נפח מספיק של 1% טריפסין-EDTA כדי לכסות על פני השטח של כלי תרבית הרקמה. דגירה ב-37 מעלות צלזיוס למשך 1-3 דקות, ולאחר מכן הרוו את הטריפסיניזציה על ידי הוספת מדיית DMEM בתוספת 1% עט-סטרפ ו-10% FBS בנפח של פי 2 מטריפסין-EDTA.
   4. צנטריפוגה של מתלה התא ב 100 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי לזרוק את התאים. שאפו את המדיה הסופר-טבעית והחזירו את התאים למדיית DMEM של 1 מ"ל בתוספת 1% עט-סטרפ ו-10% FBS.
   5. ודא שמתלה התא מעורבב היטב, ולאחר מכן העבר 20 μL לצינור microcentrifuge חדש. מוסיפים 20 μL תמיסת טריפאן כחולה ומערבבים היטב. השתמש ב-20 μL של תערובת זו כדי לספור את התאים באמצעות המוציטומטר או מונה תאים אוטומטי עם שקופיות תא ספירת תאים.
   6. העבר את מספר התאים הדרושים לזריעת 10,000 תאים/μL MAP לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש. צנטריפוגה ב 100 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי לזרוק את התאים. שאפו בזהירות את המדיה העל-טבעית מכדור התא מבלי לשאוף את התאים.
   7. הוסף את μgels ו crosslinker גלולה התא עם פיפטה עקירה. מערבבים היטב עם פיפטה עקירה, ולאחר מכן זרע 10 μL של התערובת לכל באר. בעת הציפוי, פיפטה בתנועה מעגלית כדי להפיץ באופן שווה את התערובת בבאר.
   8. אפשרו ל-μgels להתרחב לטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור התא למשך 25 דקות לפני הוספת מדיית תאים למילוי הבארות (~50 μL של מדיה לבאר). שמור על תרביות התלת-ממד בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ושנה את המדיה לפי הצורך. כדי להימנע משאיפת הפיגום בעת החלפת מדיה, ייצבו את קצה הפיפטה לאורך רכס הבאר העליונה.
      הערה: בעת הוספה או הסרה של נוזל מבארות התרבית, הנח את קצה הפיפטה על המדף מעל פיגום MAP כדי למזער את הסיכוי לשבש או לשאוף את הפיגום מהבאר.
   9. בנקודות הזמן הרצויות, לתקן דגימות על ידי הסרת המדיה והוספת 50 μL של 4% paraformaldehyde לכל באר במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לשטוף את הדגימות 3x עם 50 μL של 1x PBS או חיץ מועדף. בשלב זה בפרוטוקול, ניתן לעקוב אחר שיטות סטנדרטיות עבור צביעת אימונופלואורסצנציה או פלואורסצנטיות, תוך שימוש ב -50 μL לכל נפח העבודה.
      הערה: שיטות אלה לקיבוע ולצביעת תאים מתארות באופן ספציפי את השימוש בכתמים פלואורסצנטיים; עם זאת, ניתן לבצע אימונוסטינינג עם הצמדות נוגדנים ראשוניות ו/או משניות בפיגומים אלה גם על פי הוראות היצרן תוך שימוש ב-50 μL כנפח העבודה לכל באר.
   10. תמונה של תאים בפיגומי MAP במיקרוסקופ קונפוקלי באמצעות מטרה של פי 20 וקבלת מחסנית Z החוצה 200-250 מיקרומטר בכיוון Z בגודל צעד של 2.5 מיקרומטר. דוגמה לצביעת פלואורסצנציה עם DAPI (כתם גרעיני מדולל 1:1000 ב-0.15% טריטון-X ב-1x PBS) ופאלוידין-647 (כתם F-אקטין מדולל 1:40 ב-0.15% טריטון-X ב-1x PBS) מוצגת באיור 5E, F עם תאי D1 קבועים בתרבית בפיגומי MAP במשך 3 ימים.
       הערה: טיפול בפלזמה במשטחי זכוכית גורם להידרופיליות מוגברת, שהוכחה כמשפרת את הידבקות התאים. סביר להניח שתאים ייצפו מתפשטים לאורך החלק התחתון של בארות תרבית התאים, אך אין לכלול אותם בספירת תאים או בכימות נפח התאים להערכת תגובת התאים בפיגומי MAP.

איור 5: תרבית תאים בפיגומי MAP. (A) התבנית ליצירת בארות תרבית תאים יכולה להיות מודפסת בתלת-ממד ויצוקה באמצעות PDMS. קוטר התבנית כולה 95 מ"מ, קוטר הבארות הגדולות הוא 6 מ"מ, והבארות הפנימיות הקטנות בקוטר 4 מ"מ. (B) לאחר יציקת PDMS, מכשירי תרבית התאים מלוכדים בפלזמה לכיסויים לקבלת יכולות מיקרוסקופיה משופרות. (C) החתך של באר תרבית תאים מתאר את המאגר עבור מדיה תאית (~50 μL) ומאגר קטן יותר עבור זריעת פיגום MAP עם תאים (~10 μL). (D) תהליך הזריעה של תאים בפיגומי MAP מסתמך תחילה על התייבשות של ליו-מיקרו-ג'לים ב-wt הרצוי של המשתמש, ולאחר מכן ערבוב עם תאים וההצלבה לקישור בין ה-μgels. (E) ניתן לעטוף תאים בפיגומי MAP (ירוק) עם wt% MAP מגוון. התמונות המייצגות הן מהיום החמישי של תרבית תאי D1 בפיגומי MAP (סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר). (F) פרוסות Z בודדות מראות הבדלים בגדילת התאים בפיגומים הכוללים wt% MAP שונים (סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר). נדפס מחדש מתוך אנדרסון ואחרים ¹² באישור אלסבייר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

תוצאות

מטרת פרוטוקול זה היא להדגים את הכנתם של פיגומי חלקיקים מחושלים מיקרו-נקבוביים (MAP) עם סכמת הצלבה ביו-אורתוגונלית, כמו גם שברי חלקיקים מבוקרים לתרבית תאים תלת-ממדית. ראשית, HA שונה עם קבוצות תליוני norbornene כדי לשמש הן ביצירת מיקרוג'ל והן בקישור ליצירת פיגומי MAP. באמצעות שיטות אלה, כ-31% מהיחידות הח...

Discussion

ייצור מיקרופלואידי של מיקרו-ג'לים HA-NB הוכח כמייצר מיקרו-ג'לים עם טווח צר יותר של התפלגות גודל מאשר ייצור אצווה תחליב ^3,9. המיקרו-ג'לים המתוארים בפרוטוקול זה פותחו באמצעות קרוסלינקר הניתן לחיתוך MMP (Ac-GCRDGPQGIWGQDRCG-NH₂) כדי לתמוך בפירוק חומרים. עם זאת, מיקרו-ג'לי?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL Luer-Lok syringe sterile, single use, polycarbonate	BD	309628
5 mL Luer-Lok syringe sterile, single use, polycarbonate	BD	309646
Alexa Fluor 488 C5 maleimide	Invitrogen	A10254	For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine
Alexa Fluor 647 Phalloidin	Invitrogen	A22287	For staining cell culture samples
Aluminum foil	VWR	89107-726
Biopsy punch with plunger, 1.0 mm	Integra Miltex	69031-01
Biopsy punch, 4 mm	Integra Miltex	33-34
Blunt needle, 23 G 0.5", Non-Sterile, Capped	SAI Infusion Technologies	B23-50
Bottle-top vacuum filter, 0.22 μm	Corning	CLS430521
Calcium chloride	VWR	1B1110	For microgel washing buffer
Capillary-piston assemblies for positive-displacement pipettes, 1000 μL max. volume	Rainin	17008609
Capillary-piston assemblies for positive-displacement pipettes, 25 μL max. volume	Rainin	17008605
Capillary-piston assemblies for positive-displacement pipettes, 250 μL max. volume	Rainin	17008608
Countess Cell Counting Chamber Slides	Invitrogen	C10228
Countess II FL Automated Cell Counter	Invitrogen	AMQAF1000
Centrifuge tube, 15 mL	CELLTREAT	667015B
Centrifuge tube, 50 mL	CELLTREAT	229421
Chloroform, ACS grade, Glass Bottle	Stellar Scientific	CP-C7304	For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine
Corona plasma gun, BD-10A High Frequency Generator	ETP	11011
CryoTube Vials, Polypropylene, Internal Thread with Screw Cap	Nunc	368632
D1 mouse mesenchymal cells	ATCC	CRL-12424	Example cell line for culture in MAP gels
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542	For staining cell culture samples
Deuterium oxide, 99.9 atom% D	Sigma-Aldrich	151882	For NMR spectroscopy
Dialysis tubing, regenerated cellulose membrane, 12-14 kDa molecular weight cut-off	Spectra/Por	132703	For purifying HA-NB and HA-Tet
Diethyl ether	VWR	BDH1121-4LPC	For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine
Dimethylformamide	Sigma-Aldrich	277056	For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine
4-(4,6-dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methylmorpholinium chloride (DMTMM)	TCI-Chemicals	D2919	For modifying HA
Dithiothreitol (DTT)	Thermo Scientific	R0861	Non-degradable dithiol linker (substitute for MMP-cleavable peptide)
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), high glucose, w/ 4500 mg/L glucose, L-glutamine, sodium pyruvate, and sodium bicarbonate, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture	Sigma-Aldrich	D6429-500ML	For D1 cell culture
EMS Paraformaldehyde, Granular	VWR	100504-162	For making 4% PFA
Ethanol absolute (200 proof)	KOPTEC	89234-850
Fetal bovine serum (FBS)	ATCC	30-2020	For D1 cell culture
Heating Plate	Kopf Instruments	HP-4M
Hemacytometer with coverglass	Daigger Scientific	EF16034F
2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid (HEPES)	Sigma-Aldrich	H3375
Sodium hyaluronate, 79 kDa average molecular weight, produced in bacteria Streptococcus zooepidemicus, pharmaceutical grade, microbial contamination <100 CFU/g, bacterial endotoxins <0.050 IU/mg	Contipro	N/A	79 kDa average molecular weight was used for HA-Tet synthesis, but these methods could be adapted for other molecular weights.
IMARIS Essentials software package	Oxford Instruments	N/A	Microscopy image analysis software
Infusion pump, dual syringe	Chemyx	N/A
Kimwipe	Kimberly-Clark	34120
Laboratory stand with support lab clamp	Geyer	212100
Liquid nitrogen	Airgas	NI 180LT22
Lithium Phenyl(2,4,6-trimethylbenzoyl)phosphinate	TCI-Chemicals	L0290
Lyophilizer	Labconco	N/A	Labconco FreeZone 6 plus has been discontinued, but other lab grade console freeze dryers could be used for this protocol.
Methyltetrazine-PEG4-maleimide	Kerafast	FCC210	For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine
2-(4-Morpholino)ethane Sulfonic Acid (MES)	Fisher Scientific	BP300-100	For modifying HA
Micro cover glass, 24 x 60 mm No. 1	VWR	48393-106
Microfluidic device SU8 master wafer	FlowJem		Custom design made either in-house in clean room or outsourced
Mineral oil, heavy	Sigma-Aldrich	330760
MMP-cleavable dithiol crosslinker peptide (Ac-GCRDGPQGIWGQDRCG-NH2)	GenScript	N/A
5-Norbornene-2-methylamine	TCI-Chemicals	95-10-3	For HA-NB synthesis
Packing tape	Scotch	3M 1426
Parafilm	Bemis	PM996
PEG(thiol)2	JenKem Technology USA	A4001-1	For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine
Penicillin-Streptomycin, 10,000 units/mL	Thermo Fisher Scientific	15140122	For D1 cell culture
Petri dish, polystyrene, disposable, Dia. x H=150 x 15 mm	Corning	351058
Pluronic F-127	Sigma-Aldrich	P2443	For washing HMPs
Phosphate buffered saline (PBS) 1x	Gibco	10010023
RainX water repellent glass treatment	Grainger	465D20	Synthetic hydrophobic treatment solution for microfluidic device treatment
RGD peptide (Ac-RGDSPGERCG-NH2)	GenScript	N/A
Rubber bands	Staples	112417
Sodium chloride	Chem-Impex	30070	For dialysis
Span 80 for synthesis	Sigma-Aldrich	1338-43-8
Sylgard 184 Silicone Elastomer	Electron Microscopy Science	4019862	polydimethylsiloxane (PDMS) elastomer for making microfluidic devices and tissue culture devices
Syringe filter, Whatman Uniflo, 0.2 μm PES, 13 mm diameter	Cytvia	09-928-066
Tetraview LCD digital microscope	Celestron	44347
Tetrazine-amine HCl salt	Chem-Impex	35098	For HA-Tet synthesis
Triethylamine	Sigma-Aldrich	471283	For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine
Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP)	Millipore Sigma	51805-45-9
Triton X-100	VWR	97063-864
Trypan blue solution, 0.4%	Thermo Fisher Scientific	15250061
Trypsin EDTA (0.25%), Phenol red	Fisher Scientific	25-200-056	For lifting adherent cells to seed in MAP gels
Tygon ND-100-80 Non-DEHP Medical Tubing, Needle Gauge=23, Wall Thickness=0.020 in, Internal diameter = 0.020, Outer diameter = 0.060 in	Thomas Scientific	1204G82
UV curing system controller, LX500 LED	OmniCure	010-00369R
UV curing head, LED spot UV	OmniCure	N/A
UV light meter, Traceable	VWR	61161-386
Vacuum dessicator	Bel-Art	08-594-15C
X-Acto Z Series Precision Utility Knife	Elmer's	XZ3601W