כריתת בלוטות לימפה בכלי הדם הפופליטאליים בגפה האחורית של הארנב לאינדוקציה של בצקת לימפה משנית

Summary

כאן מתוארת האינדוקציה הכירורגית של בצקת לימפה נרכשת יציבה בגפה האחורית של הארנב. ניתן להשתמש בחיית ניסוי זו כדי לחקור עוד יותר את השפעת הטיפול בלימפאדמה בטכניקות מיקרו-כירורגיות.

Abstract

בצקת לימפה היא מצב שכיח הקשור לעתים קרובות לסרטן ולטיפול בו, מה שמוביל לפגיעה במערכת הלימפה, והטיפולים הנוכחיים הם בעיקר פליאטיביים ולא מרפאים. שכיחותו הגבוהה בקרב חולים אונקולוגיים מעידה על הצורך לחקור הן תפקוד לימפטי תקין והן תפקוד פתולוגי. כדי לשחזר לימפאדמה כרונית, יש צורך לבחור חיית ניסוי מתאימה. ניסיונות לבסס מודלים של בעלי חיים מוגבלים על ידי יכולת ההתחדשות של מערכת הלימפה. מבין המועמדים הפוטנציאליים, הגפה האחורית של הארנב קלה לטיפול ואקסטרפולציה לתרחיש הקליני האנושי, מה שהופך אותה ליתרון. בנוסף, גודלו של מין זה מאפשר בחירה טובה יותר של כלי לימפה לכריתת בלוטות לימפה בכלי דם.

במחקר זה אנו מציגים הליך של כריתת בלוטות לימפה וסקולריות בגפה האחורית של הארנב לגרימת לימפאדמה משנית. בעלי חיים מורדמים עברו מדידה היקפית, חדירת V כחולה פטנט ולימפוגרפיה ירוקה אינדוציאנין (ICG-L) באמצעות פלואורסצנציה קרובה לאינפרא אדום בזמן אמת, טכניקה המאפשרת זיהוי של בלוטות פופליטאליות בודדות ותעלות לימפה. הגישה למבנים המזוהים מושגת על ידי כריתת הצומת הפופליטאלי וקשירת הלימפה האפרנטית האפרנטית האמצעית והרוחבית. יש לנקוט בזהירות מיוחדת כדי להבטיח שניתן יהיה לזהות ולקשור כל כלי לימפה המצטרף למערכת הלימפה של עצם הירך בתוך הירך מבלי להיכנס לצומת הפופליטאלי.

הערכה לאחר הניתוח בוצעה 3, 6 ו-12 חודשים לאחר הזירוז באמצעות מדידות היקפיות של הגפה האחורית ו-ICG-L. כפי שהודגם במהלך המעקב, החיות פיתחו זרימה חוזרת עורית שנשמרה עד החודש^ה-12 , מה שהופך את חיית הניסוי הזו לשימושית להערכות חדשות לטווח ארוך בניהול בצקת לימפה. לסיכום, הגישה המתוארת כאן היא ישימה וניתנת לשחזור. בנוסף, במהלך חלון הזמן המוצג, הוא יכול לייצג לימפאדמה אנושית, ובכך לספק כלי מחקר שימושי.

Introduction

בצקת לימפטית היא מצב כרוני הראוי לתשומת לב מיוחדת, בשל שכיחותה ברחבי העולם, היעדר טיפול מרפא וסטנדרטי והשפעתה החמורה על איכות חייהם של החולים ^1,2.

במדינות מפותחות, בצקת לימפה נרכשת בעיקר והיא משנית לסרטן השד, בשל השכיחות הגבוהה של ממאירות זו; השכיחות המצטברת של לימפאדמה הקשורה לסרטן השד 10 שנים לאחר הניתוח יכולה להגיע עד 41.1%³. עם זאת, מחלות כמו מלנומה, סרטן גינקולוגי, גידולים באברי המין וניאופלזמות ראש וצוואר קשורות גם לשכיחות גבוהה של מחלה זו⁴. כריתה אזורית של בלוטות הלימפה, כחלק מהטיפול האונקולוגי הדרוש להגדלת שיעורי ההישרדות, מובילה לשיבוש הניקוז הלימפטי התפקודי. במקרים מסוימים, הדבר מביא למנגנוני פיצוי המונעים או מעכבים את הופעת הלימפאדמה⁵. עם זאת, כאשר ניתנים כימותרפיה והקרנות, מנגנונים אלה אינם מסוגלים לפצות על השינוי, וכתוצאה מכך מתרחשת בצקת לימפה. יש לכך השפעה שלילית על איכות החיים של המטופלים, ומשפיעה על רווחתם התפקודית, החברתית והפסיכולוגית ^6,7.

הצורך בריפוי יעיל לבצקת לימפה דורש הבנה של הפיזיופתולוגיה של מערכת הלימפה, כמו גם תובנה עמוקה של המנגנונים התאיים המורכבים ותגובותיהם במערכות לימפה תקינות ולא מתפקדות ^8,9,10. תובנות כאלה ניתן לקבל בתחילה ממודלים ניסיוניים של בעלי חיים שיכולים לשחזר מחלות אנושיות כרוניות¹¹.

נעשו ניסיונות רבים לשכפל לימפאדמה במודלים ניסיוניים של בעלי חיים; עם זאת, רובם נפגעו על ידי מגבלות מסוימות, כולל חוסר היכולת לשחזר אי ספיקה לימפטית כרונית במודל חי יציב, עלויות המחקר, והכי חשוב, יכולת ההתחדשות הגדולה של מערכת הלימפה, המאפשרת לה להחזיר את זרימת הדם^12,13.

מחקר זה מציג את הגישה הניסיונית להשראת בצקת לימפה נרכשת יציבה בניתוח באמצעות הגפה האחורית של הארנב. בהתבסס על סקירת ספרות, חיה זו יכולה להיחשב אופטימלית להתפתחות לימפאדמה בגלל האנטומיה העקבית של מערכת הלימפה האחורית שלה, הכוללת צומת פופליטאלי יחיד המנקז את הגפה האחורית ומגיע למערכת הלימפה העיקרית של עצם הירך ברגל^14,15.

האנטומיה הספציפית של הגפה האחורית של הארנב מאפשרת רבייה של ההליכים הכירורגיים המבוצעים בבני אדם כדי לגרום לבצקת לימפה משנית. לכן, הליך זה יכול לשמש להכשרה מיקרוכירורגית ולמחקר פרה-קליני כדי להוציא את התוצאות לרפואה האנושית.

Protocol

כל ההליכים אושרו על ידי ועדת האתיקה של המרכז לכירורגיה זעיר פולשנית חסוס אוסון והנחיות הרווחה של הממשלה האזורית, המבוססות על חקיקה אירופאית.

1. הכנה טרום ניתוחית וכירורגית

1. מאכלסים תשע נקבות ארנבות לבנות ניו זילנדיות במשקל 4-4.5 ק"ג וגילן 4 חודשים בכלובים נפרדים המוחזקים בטמפרטורה של 22-25 מעלות צלזיוס, עם גישה חופשית למזון ומים. וודאו כי הכלובים מכילים מגש פוליסולפון בשטח פנים של 3 מ^"ר וגובה 40 ס"מ, כמו גם מיטה עם שבבי עץ.
   1. זהה את הכלובים עם קוד הפרויקט ומספר זיהוי החיה.
   2. אקלום את בעלי החיים במשך שבוע לפני הניתוח כדי למנוע בעיות הנגרמות על ידי לחץ. אסוף ערכי מעבדה לפני הניתוח של דגימות דם כדי להבטיח שכל בעל חיים במצב בריאותי תקין לפני ההרדמה.
2. ודא שכל הארנבים עוקבים אחר צום של 12 שעות לפני כל הליך כירורגי.
   1. לאחר תרופות מקדימות יש לחמצן את הארנבים באמצעות מסכת פנים (מסכת הול) למשך 5 דקות עם 100% חמצן וזרימת גז טרי של 3-5 ליטר לדקה. בצע את שלב האינדוקציה המשותפת עם מידזולם (0.3 מ"ג/ק"ג) ופרופופול (10 מ"ג/ק"ג) תוך ורידי.
3. החדרו את הארנבים עם 3.0-3.5 צינורות אנדוטרכיאליים, עם פנאומוטפונציה, המחוברים למעגל מעגלי סגור למחצה המקושר למכונת הנשמה עם זרימת גזים טריים במהירות של 1 ליטר לדקה למשך 5 דקות ראשוניות, ולאחר מכן מוגדר על 0.5 ליטר לדקה.
   1. בצע הרדמה תחזוקתית על ידי שאיפת סבופלורן בריכוז של 3%-3.5% המוגדר על הוופורייזר.
4. יש לתת עירוי רציף של תמיסת הלקטט של רינגר (2-4 מ"ל/ק"ג/שעה) דרך הווריד השולי של האוזן לארנבים המורדמים לאורך כל ההליך הכירורגי.
   1. השתמש במשחת עיניים מגן כדי להגן על פני העין.
5. ניטור הרדמה כללית: השתמש במדחום רקטלי כדי לנטר את הטמפרטורה ב-38.7-39.7 מעלות צלזיוס, לבדוק את צבע הקרום הרירי ולעקוב אחר רוויית O₂ב->95% וקצב הלב ב-180-240 פעימות לדקה באמצעות אוקסימטר דופק ארנב.
6. הניחו תמיכה תרמית כך שהחיה תשמור על טמפרטורה קבועה לאורך כל ההליך.
7. יש לתת קטורולאק (1.5 מ"ג/ק"ג) בתוספת טרמדול (3 מ"ג/ק"ג) תוך ורידי לשיכוך כאבים תוך ניתוחי.
8. יש לתת אנטיביוטיקה (7.5 מ"ג/(ק"ג∙יום) אנרופלוקסצין תת עורי [s.c.]) לפני הניתוח ו-5 ימים לאחר הניתוח, כמו גם משככי כאבים לאחר הניתוח (10 מיקרוגרם/(ק"ג∙יום) בופרנורפין S.C.) למשך 5 ימים.
9. הניחו את הארנבים במצב שכיבה וגלחו את הגפיים האחוריות והמפשעה של החיה. הניחו את החיה בשכיבה גבית/שכיבה וגזיזו את השיער מהגפיים האחוריות ומאזורי המפשעה.
10. בצע חיטוי עור על ידי מריחת 0.5% כלורהקסידין ו-70% אתנול על העור שגולח בעבר. לאחר חיטוי האזור, כסו את הארנב במטלית סטרילית, למעט הגפה האחורית השמאלית.

2. ניתוח כריתת בלוטות לימפה בכלי הדם הפופליטאליים (איור 1)

1. הסתנן 0.2-0.3 מ"ל של אינדוציאנין ירוק (ICG) תוך עורי במרחבים הבין-דיגיטליים השני והשלישי של הגפה האחורית השמאלית. עסו, כופפו בעדינות והאריכו את הגפה האחורית למשך מספר דקות כדי להקל על ספיגת הצבע לכלי הלימפה. השתמש בגפה הנגדית כבקרה.
2. השתמשו במצלמת פלואורסצנטיות קרובה לאינפרא-אדום בזמן אמת כדי לדמיין ולסמן (באמצעות סמן כירורגי) את כלי הלימפה החוצים בגובה הברך ואת בלוטת הלימפה הפופליטאלית (PLN) על העור (איור 2).
3. הזרקת V כחול פטנט (0.2 מ"ל) לאזור הבין-דיגיטלי לזיהוי לאחר מכן של כלי הלימפה ובלוטות הלימפה.
4. ברגע שה-PLN מזוהה באמצעות מצלמת פלואורסצנטיות קרובה לאינפרא-אדום בזמן אמת (איור 3), צרו חתך של 2 ס"מ במרכז הפוסה הפופליטאלית, לאורך הציר הארוך של הגפה האחורית דרך הווריד האיסכיאלי, שנראה דרך העור.
   1. כדי לקבל תמונות פנורמיות בזמן אמת של מערכת הלימפה עם מצלמת הקרינה הקרובה לאינפרא אדום בזמן אמת, השתמש בראש האופטי המצויד בלייזר מסוג 1 כמקור אור העירור ובמצלמה רגישה לאינפרא אדום, מהקרסול ועד הברך של הגפה האחורית של החיה.
   2. דמיין את כלי הלימפה מעל פאשיה השריר על ידי כריתת השומן התת עורי⁵. כלי הלימפה נראים כחולים עקב צביעת ה-V הכחולה הפטנט בשלב 2.3.
   3. השתמש במלקחיים מיקרו-כירורגיים כדי למתוח את החתך ולחשוף את ה- PLN, כולל כלי הדם והלימפה הנכנסת. הקפידו על נראות ברורה של כל מבני הלימפה וכלי הדם (איור 4).
   4. זהה את ה- PLN, בקוטר של 0.8 מ"מ, מתחת לווריד האיסכיאלי ובין שרירי הזרוע שרירי הירך האחורי המדיאלי.
5. זהה את שני כלי הלימפה העיקריים בהיבט המדיאלי של ה- PLN. כלים אלה ממוקמים במקביל לווריד הספנוס הדיסטלי ומתחלקים לרשת של מיקרו-כלים כשהם מתקרבים ל-PLN (איור 5).
6. לנתח את פדיקל בלוטות הלימפה תוך הימנעות מנזק לרקמות ולכלי הדם שמסביב (איור 6).
7. קשרו את העורק המדיאלי (ענף של העורק הפופליטאלי) ואת הווריד הספנוס הצדדי באופן דיסטלי וקרוב באמצעות תפרי ניילון 10/0 שאינם נספגים.
8. זהה וצרב את שתי הקבוצות של כלי לימפה אפרנטיים המצטרפים ישירות למערכת הלימפה של עצם הירך בתוך הירך, אך אינם נכנסים ל-PLN (איור 7).
   הערה: הקבוצה הראשונה מתאימה לכלי הלימפה המדיאליים המנקזים את הלימפה מהרגל העליונה והשוק. הקבוצה השנייה מורכבת מכלי לימפה בשרירי הגפיים התחתונות. כלים אלה עוברים לאורך שריר הגסטרוקנמיוס, יחד עם הווריד הספנוס.
9. אשר שיבוש מוחלט של מערכת הלימפה על ידי חזרה על הדמיה פלואורסצנטית קרובה לאינפרא אדום בזמן אמת.
10. הסר לחלוטין את רקמת השומן שמסביב כדי למנוע לימפאנגיוגנזה אפשרית.
11. לתפור את חתך העור עם תפרים קלועים נספגים של 4-0 חומצה פוליגליקולית (PGA) (עם מחט משולשת 16 מ"מ 3/8) באמצעות דפוס תוך-עורי רציף כדי למנוע השחתה אוטומטית לאחר הניתוח.
12. לשכן את הארנבים בנפרד בכלובים לאחר הניתוח; שמור אותם תחת מעקב ובטמפרטורת החדר בין 16 ל-22 מעלות צלזיוס.

3. הערכה לאחר הניתוח

1. בצע הערכות לאחר הניתוח 3, 6 ו-12 חודשים לאחר האינדוקציה.
2. הרדמו את הארנבים לפי השלבים ששימשו קודם לכן (שלבים 1.2-1.7).
3. מדוד את היקף הגפיים האחוריות של הארנבים המורדמים בעזרת סרט מדידה. בצע מדידות כל 2 ס"מ, כאשר הנקודה הראשונה היא בקרסול והאחרונה בברך. חשב את הנפח הכולל באמצעות נוסחת החרוט החתוך.
4. השתמש בלימפוגרפיה ירוקה אינדוציאנין (ICG-L) להערכת תפקוד הלימפה.
   1. החדרו 0.2-0.3 מ"ל של ICG תוך עורית לתוך החללים הבין-דיגיטליים השני והשלישי ועסו בעדינות במשך דקה אחת כדי להקל על קליטת ICG לכלי הלימפה.
5. אסוף תמונות לאחר 15 דקות באמצעות מערכת הקרינה הקרובה לאינפרא אדום כדי להעריך זרימה חוזרת עורית.
6. לאחר השלמת המעקבים, המתת חסד של הארנב לפי אותו פרוטוקול הרדמה כמו זה ששימש בהתערבות. לאחר השגת מישור ההרדמה הרצוי, יש לתת אשלגן כלורי תוך ורידי לווריד האפרכסת בקצב ממוצע של 2 מק"ל/ק"ג.

תוצאות

תשעה ארנבים עברו השראת לימפאדמה במחקר זה, אולם שלושה ארנבים מתו בתקופה המיידית שלאחר הניתוח ולא ניתן היה להעריך אותם. נתוני המחקר התקבלו לאחר 3, 6 ו-12 חודשים לאחר הניתוח על ידי שלושה חוקרים עצמאיים. מדידות גפיים אחוריות היקפיות ו-ICG-L בוצעו בהרדמה כללית כדי להעריך את תפקוד מ...

Discussion

כריתת ה- PLN בבעל חיים ניסיוני היא הליך חדש יחסית שיכול לגרום לבצקת לימפתית משנית בגפיים לצורך הערכה ומחקר. לאחר כריתת בלוטות הלימפה, יש תקופה של שינוי בתפקוד מערכת הלימפה, הצטברות לימפה ושינויים היסטולוגיים של כלי הלימפה שנראים מורחבים. כאשר הצטברות לימפה זו מגיעה לרמות ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bleu Patente V sodique (Guerbet)	Guerbet. Villepinte, France		2.5 g/100 mL
Buprenorphine (Bupaq)	Richter Pharma. Wels, Austria	0820645AA	3 mg/10 mL
Fluobeam	Fluoptics. Grenoble, France		Fluorescence imaging
IBM SPSS software	IBM	version 21.0
Indocyanine green (Verdye, Diagnostic Green GmbH)	Diagnostic Green GmbH. Aschheim-Dornach, Germany		5 mg/mL
Ketorolaco  (Normon)	Normon, S.A. Madrid, Spain	T01H	30 mg/mL
Microsoft Excel	Microsoft	version 16.66.1
Midazolam (Normon)	Normon, S.A. Madrid, Spain	T35M	15 mg/3 mL
Pentero 800 microscope, fluorescence module	Carl Zeiss Meditec AG. Goeschwitzer Strasse 51-52. Jena, Germany	302581-9245-000
Potassium chloride (Braun)	B.Braun. Barcelona, Spain	19262010	20 mmol/10 mL
Propofol (Propomitor, Orion Pharma)	Orion Pharma. Spoo, Finland	20R039B	200 mg/20 mL
RÜSCH endotracheal tubes	Teleflex Medical IDA Business and Technology Park. Athione, Ireland.	12CE 12	Size Tube 4.0 I.D. mm
Sevoflurano (SevoFlo, Zoetis)	Zoetis Belgium. Luvain-la-Neuve, Belgium	6093559	1000 mg/g (250 mL)
Tramadol (Normon)	Normon, S.A. Madrid, Spain	T08U	100 mg/2 mL