תרבית תלת מימדית של רקמת שומן תרמוגנית וסקולרית מקטעים מיקרו-וסקולריים

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט המתאר את השימוש בשברים מיקרו-וסקולריים שבודדו מרקמת מכרסם או מרקמת שומן אנושית כגישה פשוטה להנדסת רקמת שומן פונקציונלית בצבע בז' וסקולרית.

Abstract

רקמת שומן תרמוגנית הנדסית (למשל, רקמות שומן בצבע בז' או חום) נחקרה כטיפול פוטנציאלי למחלות מטבוליות או לתכנון מיקרו-רקמות מותאמות אישית לבדיקת בריאות ובדיקות סמים. האסטרטגיות הנוכחיות הן לעתים קרובות מורכבות למדי ואינן מצליחות לתאר במדויק את התכונות הרב-תאיות והתפקודיות של רקמת השומן התרמוגנית. שברים מיקרו-וסקולריים, מיקרו-כלים קטנים ושלמים המורכבים מעורקים, ורידים ונימים שבודדו מרקמת השומן, משמשים כמקור אוטולוגי יחיד של תאים המאפשרים וסקולריזציה ויצירת רקמת שומן. מאמר זה מתאר שיטות לאופטימיזציה של תנאי תרבית כדי לאפשר יצירה של רקמות שומן תרמוגניות תלת-ממדיות, וסקולריות ומתפקדות ממקטעים מיקרו-וסקולריים, כולל פרוטוקולים לבידוד מקטעים מיקרו-וסקולריים מרקמת השומן ומתנאי תרבית. בנוסף, נדונות שיטות עבודה מומלצות, כמו גם טכניקות לאפיון הרקמות המהונדסות, ותוצאות דגימה הן ממכרסמים והן מקטעים מיקרו-וסקולריים אנושיים מסופקות. לגישה זו יש פוטנציאל לשמש להבנה ופיתוח של טיפולים להשמנת יתר ומחלות מטבוליות.

Introduction

מטרת פרוטוקול זה היא לתאר גישה לפיתוח רקמת שומן בז' וסקולרית ממקור יחיד, שעשוי להיות אוטולוגי, מקטע מיקרו-וסקולרי (MVF). רקמות שומן חומות ובז' הוכחו כבעלות תכונות מועילות הקשורות לוויסות מטבולי; עם זאת, הנפח הקטן של מחסני רקמת שומן אלה במבוגרים מגביל את ההשפעה הפוטנציאלית על חילוף החומרים המערכתי, במיוחד במצבים חולים כגון השמנת יתר או סוכרת מסוג 2 1,2,3,4,5,6,7. קיים עניין משמעותי בשומן חום/בז' כיעד טיפולי למניעת ההשפעות המטבוליות המזיקות הקשורות להשמנת יתר ותחלואה נלווית 8,9,10,11,12.

MVFs הם מבני כלי דם שניתן לבודד ישירות מרקמת השומן, לגדל בתרבית ולתחזק אותם בתצורה תלת ממדית לפרקי זמן ממושכים 13,14,15. עבודות קודמות של הקבוצה שלנו, ואחרות, החלו לנצל את היכולת הרב-תאית והרב-פוטנטית של MVFs, במיוחד בכל הנוגע להיווצרות רקמת שומן^16,17,18. כהצטברות של עבודה זו, הדגמנו לאחרונה כי MVFs שמקורם במודלים של מכרסמים של סוכרת בריאה ומסוג 2¹⁹ ומנבדקים אנושיים (מבוגרים מעל גיל 50)²⁰ הכילו תאים המסוגלים לקבל השראה ליצירת רקמת שומן תרמוגנית, או בז'.

זוהי גישה חדשנית שממנה נעשה שימוש ב-MVF ממקור יחיד, המסוגל לא רק ליצור רקמת שומן בצבע בז' אלא גם את מרכיב כלי הדם הקשור והקריטי שלה²¹. השימוש בטכניקה זו יכול להיות בעל ערך רב עבור מחקרים המחפשים גישה פשוטה מהונדסת רקמות להיווצרות רקמת שומן תרמוגנית. בניגוד לשיטות אחרות השואפות להנדס רקמת שומן בצבע בז' 22,23,24,25,26,27,28^, התהליך המתואר במחקר זה אינו דורש שימוש במספר סוגי תאים או משטרי אינדוקציה מורכבים. ניתן ליצור מודלים של שומן ובז' ולבן עם MVFs שמקורם במכרסמים ובמקורות אנושיים, מה שמדגים פוטנציאל תרגום גדול. התוצר הסופי של פרוטוקול זה הוא רקמת שומן תרמוגנית בצבע בז' מהונדס, בעלת מבנה ותפקוד מטבולי הדומים לרקמת שומן חומה. בסך הכל, פרוטוקול זה מציג את הרעיון כי MVF מקור נגיש ואולי אוטולוגי עשוי להיות התערבות טיפולית ראויה וכלי לחקר הפרעות מטבוליות.

Protocol

מחקר זה נערך בהתאם לחוק צער בעלי חיים ולתקנות צער בעלי חיים בהתאם לעקרונות המדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה. כל ההליכים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת טקסס בסן אנטוניו.

הערה: עבור השלבים המתוארים להלן, עכברושי לואיס זכרים משמשים. יש לבצע התאמות פרוטוקול קלות עבור נקבה, כמו גם אוסף מקטע כלי דם עכבר (MVF)²⁹. עבור פרוטוקולים המשתמשים ב- MVFs אנושיים (h-MVFs), השלבים היחידים הנדרשים הם השעיית h-MVFs בעקבות פרוטוקול היצרן, הכנת מדיה גדילה (1.3), היווצרות הידרוג'ל פיברין (5) ותרבית (6). לקבלת סקירה כללית של הפרוטוקול, ראה איור 1.

איור 1: מתווה ניסויי. פירוט של שישה שלבים מרכזיים, לפני ניתוח, להיווצרות רקמת שומן תרמוגנית באמצעות MVF. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

1. הכנת מגיב

הערה: ריאגנטים להלן מתאימים לחולדה אחת, נשקלת ומיוצרת בתוך ביו-הוד.

1. הכינו אלבומין בסרום בקר (BSA) ב-PBS.
   1. הכינו 10 מ"ג/מ"ל (1.0%) BSA ב-PBS לדילול לשלבי שטיפה (1 מ"ג/מ"ל, 0.1%) ועיכול (4 מ"ג/מ"ל, 0.4%).
   2. הכינו ריכוזים שונים של BSA, כמתואר בשלב 1.1.1, לפי שלבים 1.1.3-1.1.5.
   3. 10 מ"ג/מ"ל BSA ב-PBS (1% BSA ב-PBS)
      1. הוסף 500 מ"ג של BSA ו 500 מ"ל של PBS לצינור חרוטי 50 מ"ל מערבולת את הפתרון להמסת BSA.
      2. אם נוצרות בועות מוגזמות, צנטריפוגו את התמיסה ב 350 x גרם למשך 2 דקות. סנן לעקר את התמיסה עם מסנן ניילון נטו 0.22 מיקרומטר.
   4. 1 מ"ג/מ"ל BSA ב-PBS (0.1% BSA ב-PBS)
      1. יש לדלל 15 מ"ל של 10 מ"ג/מ"ל BSA ב-PBS 1:10 עם PBS על ידי הוספת 15 מ"ל של 10 מ"ג/מ"ל BSA ב-PBS ל-135 מ"ל PBS בבקבוק סטרילי של 500 מ"ל ולנער בעדינות את הבקבוק כדי להבטיח תערובת הומוגנית.
   5. 4 מ"ג/מ"ל BSA ב-PBS (0.4% BSA ב-PBS)
      1. יש לדלל 35 מ"ל של 10 מ"ג/מ"ל BSA ב-PBS 1:2.5 עם PBS על ידי הוספת 35 מ"ל של 10 מ"ג/מ"ל BSA ב-PBS + 57.5 מ"ל של PBS בבקבוק סטרילי של 100 מ"ל ולנער בעדינות את הבקבוק כדי להבטיח תערובת הומוגנית.
2. הכינו collagenase ב BSA לעיכול של כריות שומן טחון.
   1. הכינו 6 מ"ג/מ"ל קולגנאז.
      1. בצינור חרוטי של 50 מ"ל, שוקלים 72 מ"ג של collagenase (תווית "עבור Epi").
      2. בשלושה צינורות חרוטיים של 50 מ"ל, שוקלים 144 מ"ג של collagenase (תווית "עבור Ing 1", "עבור Ing 2", ו "עבור SubQ") כל אחד.
      3. יש לאחסן את ה-collagenase השקוקל ב-4°C עד לשימוש.
         הערה: אין להוסיף BSA/PBS עד ממש לפני העיכול.
      4. הוסף 12 מ"ל של 4 מ"ג / מ"ל BSA ב PBS לצינור המכיל 72 מ"ג של collagenase.
      5. הוסף 24 מ"ל של 4 מ"ג / מ"ל BSA ב PBS לצינורות המכילים 144 מ"ג של collagenase.
      6. נערו את הצינורות כדי להבטיח תמיסה הומוגנית וסננו לעקר את התמיסה עם מסנן ניילון נטו 0.22 מיקרומטר.
3. הכינו מצע גדילה בתוספת חומצה אמינוקפרואית (ACA) כדי להאכיל/להבדיל את ה-MVF המבודד.
   1. מצע גדילה (GM): תוסף DMEM עם 20% FBS, 1% פניצילין-סטרפטומיצין (סטרפטוקוקוס עט), 0.2% מיקופלסמה מניעתית, ו-1 מ"ג/מ"ל ACA.
   2. הכינו מדיה אדיפוגנית לבנה (WAM).
      1. השראת WAM: תוסף DMEM/F12 עם 20% FBS, 1% סטרפטוקוקוס עט, 0.2% מיקופלסמה מניעתית, 10 מיקרוגרם / מ"ל אינסולין, 10 מיקרומטר של פורסקולין, 1 מיקרומטר של דקסמתזון, ו 1 מ"ג / מ"ל ACA.
         הערה: עבור h-MVFs, בנוסף, להוסיף 125 מיקרומטר של indomethacin.
      2. תחזוקת WAM: תוסף DMEM/F12 עם 20% FBS, 1% סטרפטוקוקוס עט, 0.2% מיקופלסמה מניעתית, 5 מיקרוגרם/מ"ל אינסולין ו-1 מ"ג/מ"ל ACA.
         הערה: עבור h-MVFs, שנה את ריכוז האינסולין ל -10 מיקרוגרם / מ"ל.
   3. הכינו מדיה אדיפוגנית בצבע בז' (BAM).
      1. השראת BAM: תוסף DMEM/F12 עם 20% FBS, 1% סטרפטוקוקוס עט, 0.2% מיקופלסמה מניעתית, 10 מיקרוגרם / מ"ל אינסולין, 10 מיקרומטר של פורסקולין, 1 מיקרומטר של דקסמתזון, 1 מיקרומטר של רוזיגליטזון, 20 ננומטר 3,3′,5-Triiodo-L-thyronine (T3), ו 1 מ"ג / מ"ל ACA.
         הערה: עבור h-MVFs, שנה את הריכוז של T3 ל- 120 ננומטר.
      2. תחזוקת BAM: תוסף DMEM/F12 עם 20% FBS, 1% סטרפטוקוקוס עט, 0.2% מיקופלסמה מניעתית, 5 מיקרוגרם/מ"ל אינסולין, 10 מיקרומטר פורסקולין, 1 מיקרומטר רוזיגליטזון, 20 ננומטר T3 ו-1 מ"ג/מ"ל ACA.
         הערה: עבור h-MVFs, שנה את ריכוז האינסולין ל -10 מיקרוגרם / מ"ל ואת ריכוז T3 ל -120 ננומטר.
4. הכינו טרומבין (רק צריך להיות מיוצר אם הפתרון aliquoted מלאי אינו זמין) כדי להפוך את סוכן קרישה לשמש ג'ל פיברין.
   1. תרומבין 10 U/mL ב- ddH₂O:
      1. להשהות אבקת טרומבין באמצעות 1-5 מ"ל של ddH₂O בבקבוקון מהיצרן ולהעביר את ההשעיה ל 250 מ"ל כד.
      2. להעלות את התמיסה ל 100 מ"ל ו pipet את הפתרון למעלה ולמטה פעמים רבות כדי להבטיח תערובת הומוגנית. Aliquot התמיסה לתוך צינורות חרוטי 15 מ"ל (~ 10 מ"ל / צינור) ולאחסן את aliquots במקפיא -20 ° C.
         הערה: כדי להשתמש, הפשיר את הטרומבין בטמפרטורת החדר (RT).

2. הכנת כלים/חומרים

הערה: כל המכשור צריך להיות autoclaved/מעוקר לפני השימוש.

1. בידוד שומן אפידימלי/מפשעתי/תת עורי (ניתוח שייעשה באזור כירורגי מוגדר)
   1. ודא את זמינותם של תחתיכות חד פעמיות, שני מספריים, hemostat אחד (אופציונלי), שני מלקחיים, וארבעה צינורות חרוטי 50 מ"ל עם 10-15 מ"ל של 1 מ"ג / מ"ל BSA (0.1%) ב- PBS.
2. בידוד מקטע כלי דם
   1. לטחינה (שתיעשה בביוהוד), יש לוודא זמינות של שלוש צלחות פטרי סטריליות 100 מ"מ לא מצופות, זוג מלקחיים אחד וזוג מספריים מעוקלים.
   2. לעיכול ובידוד (שייעשה בביוהוד), יש לוודא זמינות של זוג מספריים אחד, זוג מלקחיים אחד, שמונה צלחות פטרי סטריליות לא מצופות בקוטר 100 מ"מ, שלוש צלחות פטרי סטריליות 35 מ"מ לא מצופות, קולגנאז במשקל ובטמפרטורה של 4°C, ארבע צלוחיות 250 מ"ל, מחזיק פלסטיק אחד עם חור במרכז, 4 רשתות 500 מיקרומטר (חתוכות ל-3 בריבועים מעוגלים), ארבעה מסכים 37 מיקרומטר (לחתוך ל 3 ריבועים מעוגלים), ו 11 50 מ"ל צינורות חרוטיים.
3. תרחיף פיברין
   1. עבור הידרוג'ל פיברין (להיעשות בביוהוד), ודא כי פיברינוגן, תרומבין ומדיה גדילה (שנעשו במהלך הכנת מגיב) זמינים.

3. פרוטוקול בידוד שומן

1. צעדים מקדימים
   1. מלא עם אתנול כדי לשטוף ולחטא את כלי הניתוח לפני השימוש בהם. לאחר מכן, הכינו את השולחן לטיפול בחולדה והכינו ואקום מוכן לשאוף את הפרווה שנוצרה במהלך שלב הגילוח.
   2. הכינו דלי עם קרח שבו יוצבו צינורות חרוטי 50 מ"ל שהוכנו בעבר, שכל אחד מהם מכיל 10 מ"ל של 1 מ"ג / מ"ל BSA. תייגו את הצינורות בהתאם.
      הערה: ייתכן שיהיה צורך בשני צינורות חרוטיים נפרדים עבור השומן המפשעה, שכן יש לחלץ שני צדדים וכמות השומן שנאספה מאזור זה נוטה להיות הגדולה ביותר בהשוואה לאפידידימלית ותת עורית אחורית.
   3. התחילו עם חולדה מורדמת באזור הכירורגי המוגדר עם כלי הניתוח הנדרשים. באופן כללי, CO₂ משמש להרדים את החולדות בהתאם לפרוטוקולים של IACUC.
   4. בעזרת קוצצי שיער, לגלח את החולדה סביב האזור המעניין. באופן ספציפי, יש להתגלח בין המפשעות למחצית הבטן לצורך בידוד שומן אפידידימלי ומפשעתי (השתמש במכונת הגילוח הקטנה יותר עבור הפרווה באזור זה). יש לגלח את כל הגב כדי שהשומן התת עורי האחורי ימוקם בין השכמה (עדיף להשתמש במכונת גילוח גדולה יותר מכיוון שהפרווה עבה יותר בחלק האחורי של החולדה).
   5. הכינו את החולדה על ידי ריסוס שלה באתנול 70%. באופן כללי, מומלץ לנקות את האזור שעומד להיחתך פעמיים.
2. בידוד מחסני שומן שונים
   1. מפשעתי (תת עורי)
      1. במצב שכיבה, להרים את העור מתחת לפין עם זוג מספריים. מתחילים את החתך עם מספריים, מתחילים במרכז וחותכים לרוחב, יוצרים צורת "V" ולולאה לחלק האחורי של החולדה כדי לגשת לכל מחסן השומן. זכרו לחתוך באופן שטחי כך שהשומן למטה יהיה שלם. במהלך שלב החיתוך, הקפידו על הפרדת העור מהשומן על-ידי חיתוך רקמת הפאשיה המחוברת (איור 2A).
      2. לאחר חיתוך הפאשיה כראוי, ודא ששני הצדדים של השומן המפשעתי נראים לעין (השומן המפשעתי משתרע מאזור המפשעה לכיוון הגב). לאחר מכן, הסירו את השומן משני הצדדים בשתי צינוריות חרוטיות נפרדות המכילות 10 מ"ל של 1 מ"ג/מ"ל BSA (איור 2B).
   2. אפידידימל (קרביים)
      1. קצרו את השומן האפידידיסמלי על-ידי חיתוך דרך עור הבטן ובזהירות דרך השכבה הדקה שמקיפה את האשכים (איור 2C).
      2. בעזרת מלקחיים, משכו בעדינות את רקמת השומן החוצה וגזרו אותה באמצעות מספריים. הימנעו מלנתח כלי דם גדולים הנראים לעין (אם האשכים והאפידידימיס נקצרים, הסירו אותם במהלך שלב הניקוי בביו-הוד).
      3. מניחים בזהירות את השומן שהוסר לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל עם 10 מ"ל של 1 מ"ג / מ"ל BSA ב- PBS.
         הערה: הסרת השומן האפידידימלי צריכה להיעשות לאחר הסרת השומן המפשעתי. השומן האפידידימלי הוא בדרך כלל קטן יותר בנפחו וממוקם מתחת לשומן המפשעה, מתחת לעור הבטן סביב האשכים והאפידידימיס.
   3. תת עורית אחורית
      1. סובבו את החולדה נוטה (הצד הגבי כלפי מעלה) ובעזרת מספריים גדולים חתכו את עור הגב (העור באזור הזה עבה) עד לקרקפת, תוך הקפדה לא לחתוך עמוק מדי, ממש מתחת לעור (איור 2D).
      2. חותכים את הפאשיה המחברת את העור לרקמה; השומן ממוקם באזור interscapular. שימו לב להבדיל/להפריד את השומן התת עורי מהשומן החום. השומן החום קרוב יותר לעמוד השדרה (איור 2E).
      3. בודדו והניחו את השומן בצינור(ות) החרוטיות המתאימות של 50 מ"ל עם 10 מ"ל של 1 מ"ג/מ"ל BSA ב-PBS.

איור 2: בידוד של מחסני רקמת שומן שונים . (A) חתכים ראשוניים הדרושים לכריתה של רקמת השומן המפשעתית. (ב) מיקום מחסן השומן המפשעה. (C) מיקום מחסן השומן האפידידימלי, תוך ציון חתך העור החיצוני הדרוש לגישה. (D) חתכים נוספים הדרושים לאחר שהעכברים ממוקמים מועדים לגישה לשומן נוסף. (ה) מיקום מחסן השומן התת עורי האחורי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

4. פרוטוקול בידוד שברים מיקרו-וסקולריים

1. מניחים 50 מ"ל צינוריות חרוטיות המכילות שומן נכרת מהחולדה לתוך biohood.
2. באמצעות מלקחיים, הניחו את השומן בצלחת פטרי סטנדרטית של 100 מ"מ (עם ~0.5 מ"ל של 1 מ"ג/מ"ל BSA ב-PBS כדי לשמור על לחות הרקמה).
3. נקו והוציאו את כל כלי הדם הנראים לעין ואת רקמת השריר/חוץ מהשומן.
4. טוחנים את השומן עם מספריים במשך ~ 10 דקות (טחון מספיק כדי שניתן יהיה להעביר אותו עם פיפט 10 מ"ל).
5. בדוק גושים על ידי הוספת ~ 0.5 מ"ל של 1 מ"ג / מ"ל BSA ב- PBS; ממשיכים לטחון במידת הצורך.
6. מעבירים את השומן הטחון לבקבוק סטרילי של 250 מ"ל עם פיפט של 10 מ"ל.
   הערה: שים לב לעוצמת הקול באמצעות פיפט.
7. הוסף מספיק BSA (1 מ"ג / מ"ל) כך נפח הסופי הוא 20 מ"ל.
8. הוסף 4 מ"ג / מ"ל BSA ב- PBS ל- collagenase (ריכוז סופי של collagenase: 6 מ"ג / מ"ל) (כלומר, 12 מ"ל עבור 72 מ"ג של collagenase או 24 מ"ל עבור 144 מ"ג של collagenase).
   הערה: אין להוסיף עד לסיום הטחינה, שכן היא רגישה לזמן.
9. נערו בעדינות את הצינור החרוטי כדי להבטיח תמיסה הומוגנית וסננו לעקר את התמיסה עם מסנן רשת ניילון 0.22 מיקרומטר.
10. עבור שומן epididymal, לעכל במשך ~ 8-10 דקות; עבור השומן התת עורי המפשעה והאחורי, לעכל במשך ~ 15-20 דקות באמבט מים 37 מעלות צלזיוס, לנער את הבקבוק בתנועה סיבובית לאורך כל הדרך (לעצור ברגע שהשומן מגיע למקום שבו נותרו רק כמה גושים).
11. מעבירים את השומן המעוכל לתוך צינור חרוטי של 50 מ"ל (צריך להיות ~30 מ"ל / צינור), ותייגו את הצינור כ"שומן מעוכל".
12. סובב את הצינור ב 400 x גרם במשך 4 דקות; לאחר סיבוב, הגלולה חייבת להיות אדומה (איור 3A).
13. במהלך הסיבוב, הניחו את המסך הסטרילי בגודל 37 מיקרומטר ומסכי 500 מיקרומטר בצלחת פטרי סטרילית עם 5 מ"ל של 1 מ"ג/מ"ל BSA ב-PBS כדי להשרות לפני השימוש.
14. לאחר הסיבוב, דקנט את הסופרנאטנט לתוך צינור חרוטי של 50 מ"ל המסומן כ"פסולת". בצעו את הדקציה בעדינות כדי להסיר את השומן השטחי ולא להפריע לגלולה העשויה MVFs.
15. הוסף 10 מ"ל של 1 מ"ג / מ"ל BSA ב- PBS לצינור המכיל את הגלולה ("שומן מעוכל"). טריטוראט (פייפ למעלה ולמטה) את הגלולה 2x.
16. הימנע להיות גס מדי על הגלולה כדי לא לשבש את השברים.
17. הניחו את המסך בגודל 500 מיקרומטר בצלחת פטרי חדשה מעל מחזיק מסך הפלסטיק (איור 3B).
18. פיפט 10 מ"ל מצינור "גלולה מעוכלת" מעל מסך של 500 מיקרומטר באמצעות מעגלים קונצנטריים (איור 3C).
19. שטפו את המסנן עם 5 מ"ל נוספים של 1 מ"ג/מ"ל BSA ב-PBS. התאים הרצויים יסתננו דרך צלחת הפטרי; לכן, השליכו את מסך 500 מיקרומטר אך שמרו את הנוזל המסונן בתוך צלחת הפטרי.
20. הניחו את המסך בגודל 37 מיקרומטר בצלחת פטרי חדשה מעל מחזיק מסך הפלסטיק.
21. החליפו את הצינור כדי לסלק גושים לפני השימוש במסך 37 מיקרומטר.
22. פיפט את הנוזל המתקבל מהסינון הראשון על מסך 37 מיקרומטר באמצעות מעגלים קונצנטריים.
23. שטפו את המסנן עם 5 מ"ל נוספים של 1 מ"ג/מ"ל BSA ב-PBS. התאים הרצויים יישארו בפילטר, ולכן השליכו את הנוזל המסונן, אך שמרו את מסך 37 מיקרומטר.
24. החלק את המסך בגודל 37 מיקרומטר לתוך צלחת פטרי חדשה המכילה 5 מ"ל של 1 מ"ג/מ"ל BSA ב-PBS.
25. נערו את התבשיל על ידי הדבקתו על מחזיק חרוטי כדי לעקור את השברים. אין לנער במרץ רב מדי, שכן הנוזל/התאים עלולים להישפך מתוך צלחת הפטרי.
26. יש לשטוף את המסנן ב-5 מ"ל נוספים של 1 מ"ג/מ"ל BSA ב-PBS. התאים הרצויים יישארו בתמיסה נוזלית בצלחת הפטרי. שמור את המסך בגודל 37 מיקרומטר ואת המקטע שנעקר ממקומו המכיל נוזל בתוך צלחת הפטרי לשלבים הבאים.
27. מעבירים את BSA + קטע המכיל נוזל לצינור חרוטי סטרילי של 50 מ"ל.
28. חזור על שטיפה של מסך 37 מיקרומטר מספר פעמים נוספות (בכל פעם עם ~ 5 מ"ל של 1 מ"ג / מ"ל BSA ב- PBS) והוסף לצינור החרוט. חזור על הפעולה עד שהנפח הכולל שנאסף הוא ~ 15-20 מ"ל. בסופו של דבר, התאים הרצויים ייאספו מהתמיסה הנוזלית בצלחת הפטרי ויונחו בצינור חרוט; בשלב זה, השליכו את מסך 37 מיקרומטר לאחר השטיפה הסופית, אך שמרו את השברים שנעקרו ממקומם המכילים נוזל בתוך הצינור החרוטי של 50 מ"ל.
29. גזור את קצהו של קצה צינור 200 μL באמצעות מספריים. נערו בעדינות את צינור 50 מ"ל, הסירו שתי דגימות של 20 מיקרוליטר והניחו אותן בצלחת פטרי נקייה של 35 מ"מ.
30. ספרו את מספר השברים בכל דגימה בצלחת הפטרי כדי לקבל את המספר הכולל של MVF שבודדו.
    סה"כ שברים =
31. סובב את החלק שנותר שנעקר המכיל נוזל בצינור חרוטי של 50 מ"ל ב 400 x גרם במשך 4 דקות כדי לאסוף את ה- MVF.

איור 3: בידוד של MVFs. (A) לאחר עיכול של רקמת השומן, תיאור ההפרדה של MVFs המכילים גלולה וסופרנאטנט לאחר ספין-דאון. (B) פריסת חומרים לסינון ולכידה של MVFs. (C) איור של שיטת המעגל הקונצנטרי לשלבי סינון/שטיפה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

5. היווצרות הידרוג'לים פיברין

1. חישובים לדוגמה:
   הערה: להלן החישובים עבור MVFs שנזרעו ב~15,000-20,000 MVF/mL ויחס ג'ל פיברינוגן:טרומבין ב-2:5, כאשר פיברינוגן משמש בריכוז של 20 מ"ג/מ"ל.
   1. לייצור חמישה ג'לים של 250 מיקרוליטר, נדרש נפח כולל של 1,250 מיקרוליטר. תמיד חשבון שגיאות pipetting, ולכן, לעשות מספיק עבור 1.5 מ"ל של ג'לים.
      1. חישוב נפח הפיברינוגן הנדרש כדלקמן:
         , X₁ = 428.57 μL של פיברינוגן,
      2. חשב את נפח התרומבין הנדרש כדלקמן:
         , X₂ = 1,071.43 מיקרוליטר של טרומבין
      3. עבור נפח נדרש של 428.57 μL, לעשות 500 μL של פיברינוגן כדלקמן:
         20 מ"ג / מ"ל * 0.5 מ"ל = 10 מ"ג פיברינוגן. להשעות את זה ב 500 μL של DMEM
      4. כדי להשיג כל ג'ל, לחשב את נפח פיברינוגן וטרומבין כדלקמן:
         1. פיברינוגן:
            ,_{X 1} = 71.43 מיקרוליטר של פיברינוגן (ב-DMEM) + MVF
         2. טרומבין:
            , X₂ = 178.57 מיקרוליטר של טרומבין
2. יציקת ג'ל פיברין MVF
   1. דקנט את רוב הנוזל בשבר המסובב למטה בצינור החרוטי 50 מ"ל. השתמש פיפטה כדי להסיר את נפח קטן של נוזל שתופס על שפת הצינור החרוט.
   2. הוסיפו תרומבין לבארות שבהן ייוצרו ג'לים (איור 4A).
   3. יש לגזור את קצהו של קצה פיפט של 200 μL ולהשהות מחדש את ה-MVFs בעדינות באמצעות פיברינוגן כדי לקבל צפיפות סופית של ~15,000-20,000 MVF/mL פעם אחת בג'ל.
   4. יש לקצץ קצה של 200 מיקרוליטר פיפט ופיפט MVF+פיברינוגן לתמיסת הטרומבין בעדינות. מזלפים במהירות למעלה ולמטה כדי להבטיח תערובת הומוגנית. חזרו על הפעולה עד שכל הג'לים מיוצרים (איור 4B).
   5. הניחו את לוחות הבאר באינקובטור (37°C, 5% CO₂) למשך ~15 דקות כדי לאפשר הצלבת ג'ל (איור 4C).
   6. הוסף 100-150 μL של מצע צמיחה לכל באר.

איור 4: היווצרות של ג'ל פיברין MVF . (A) תערובת תרומבין בת 5/7 חלקים מוחדרת לבאר המתאימה. (B) לאחר מכן, עם קצה פיפט חתוך (כדי לא להפריע ל-MVFs), תערובת פיברינוגן+MVF בת 2/7 חלקים מוחדרת לתוך הבאר ומעורבבת בעדינות. (C) לבסוף, כל הג'לים שהושלמו ממוקמים באינקובטור בטמפרטורה של 37°C, מה שמאפשר להידרוג'ל להתמצק באופן מלא לפני שהמדיה מונחת למעלה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

6. תנאי טיפוח של MVFs

1. לטיפוח רקמת שומן לבנה ובז' לא וסקולרית (+ GM Control), השתמשו בצירי הזמן¹⁹ המוצגים באיור 5.
2. לתרבית של רקמת שומן לבנה ובז' וסקולרית (+ GM Control), השתמשו בצירי הזמן¹⁹ המוצגים באיור 6.
3. הידרוג'לים צריכים להישמר באינקובטור (37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂) למשך התרבית למחקר, כאשר התקשורת מתחלפת כל יומיים. לקיבוע וטיפול בדוגמאות לניתוח, עיין בעבודות שפורסמו בעבר^16,19,20.

איור 5: תזמון להיווצרות רקמת שומן לא וסקולרית. נתון זה שונה מ Acosta et ^al.19. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 6: תזמון להיווצרות רקמת שומן וסקולרית. נתון זה שונה מ Acosta et ^al.19. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

תוצאות

ישנם מספר מאפיינים מורפולוגיים פנוטיפיים עיקריים של רקמת שומן בצבע בז'/חום: הוא רב-לוקולרי/מכיל טיפות שומנים קטנות, בעל מספר רב של מיטוכונדריה (הסיבה להופעתו ה"חומה" האופיינית in vivo), יש לו בהתאמה קצב צריכת חמצן גבוה/ביו-אנרגטיקה מיטוכונדריאלית, הוא מאוד וסקולרי, יש לו ספיגת גלוקוז מוגבר...

Discussion

תחום הנדסת רקמת השומן החומה/בז' אינו בשל ברובו 22,23,24,25,26,27,28, כאשר רוב דגמי השומן מפותחים עבור רקמת שומן לבנה ^8,22,31

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aminocaproic Acid	Sigma Aldrich	A2504-100G	Added in DMEM at the concentration of 1 mg/mL
Blunt-Tipped Scissors	Fisher scientific	12-000-172	Sterilize in autoclave
Bovin Serum Albumin (BSA)	Millipore	126575-10GM	Diluted in PBS to 4 mg/mL and 1 mg/mL
Collagenase Type 1	Fisher scientific	NC9633623	Diluted to 6 mg/mL in BSA 4 mg/mL, Digestion of minced fat
Dexamethasone	Thermo Scientific	AC230302500	Diluted in ethanol at a 2 mg/ml stock concentration
Disposable underpads	Fisher scientific	23-666-062	For fluid absorption during surgery
Dissecting Scissors	Fisher scientific	08-951-5	Sterilize in autoclave
Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium (DMEM)	Fisher scientific	11885092
Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham (DMEM/F12)	Sigma Aldrich	D8062
Fetal Bovine Serum	Fisher scientific	16140089	Added in DMEM to 20% v/v.
Fibrinogen	Sigma Aldrich	F8630-25G	Solubilized in DMEM at the concentration of 20 mg/mL, Protein found in blood plasma and main component of hydrogel
Flask, 250 mL	Fisher scientific	FB500250	Allows for digestion of fat using a large surface area
Forceps	Fisher scientific	50-264-21	Sterilize in autoclave, For handling of tissue and filters
Forskolin	Sigma Aldrich	F6886	Diluted in ethanol at a 10 mM stock concentration
Human MVF	Advanced Solutions Life Scienes, LLC	https://www.advancedsolutions.com/microvessels	Human MVFs (hMVFs) isolated from three different patients (52-, 54-, and 56-year old females) were used in the current study.
Indomethacine	Sigma Aldrich	I7378	Diluted in ethanol at a 12.5 mM stock concentration
Insulin from porcine pancreas	Sigma Aldrich	I5523	Diluted in 0.01 N HCl at a 5 mg/ml stock concentration
MycoZap	Fisher scientific	NC9023832	Added in DMEM to 0.2% w/v, Mycoplasma Prophylactic
Pennycilin/Streptomycin (10,000 U/mL)	Fisher scientific	15140122	Added in DMEM to 1% v/v.
Petri dishes, polystyrene (100 mm x 15 mm).	Fisher scientific	351029	3 for removal of blood vessels and mincing, 8 (lid) for presoaking of screens & 8 (dish) for use when filtering with 500 or 37 µM screens
Petri dishes, polystyrene (35 mm x 10 mm).	Fisher scientific	50-202-036	For counting fragments
Phosphate Buffer Saline (PBS)	Fisher scientific	14-190-250	Diluted to 1x with sterile deionized water.
Rat Clippers (Andwin Mini Arco Pet Trimmer)	Fisher scientific	NC0854141
Rosiglitazone	Fisher scientific	R0106200MG	Diluted in DMSO at a 10 mM stock concentration
Scissors	Fine Science Tools	14059-11	1 for initial incision, 1 for epididymal incision, 1 for tip clipping
Screen  37 µM	Carolina Biological Supply Company	652222R	Cut into 3" rounded squares and sterilized in ethylene oxide, Fragment entrapment and removal of very small fragments/single cells and debris
Screen 500 µM	Carolina Biological Supply Company	652222F	Cut into 3" rounded squares and sterilized in ethylene oxide, Removes larger fragments/debris
Serrated Hemostat	Fisher scientific	12-000-171	Sterilize in autoclave, For clamping of skin before incision
Steriflip Filter 0.22 μm	Millipore	SE1M179M6
Thrombin	Fisher scientific	6051601KU	Diluted in deionzed water to 10 U/mL, Used as a clotting agent turning fibrinogen to fibrin
Thyroid hormone (T3)	Sigma Aldrich	T2877	Diluted in 1N NaOH at a 0.02 mM stock concentration
Zucker diabetic fatty (ZDF) rats - obese (FA/FA) or lean (FA/+) male	Charles River	https://www.criver.com/products-services/find-model/zdf-rat-lean-fa?region=3611 https://www.criver.com/products-services/find-model/zdf-rat-obese?region=3611	Obtained from Charles River (Wilmington, MA). Rats were acquired at 4 weeks of age and fed Purina 5008 until euthanasia (15-19 weeks of age). Glucose levels (blood from the lateral saphenous vein) were greater than 300 mg/dL in all FA/FA rats used in the study. All animals were housed in a temperature-controlled environment with a 12-h light-dark cycle and fed ad libitum.