הדמיה תלת-ממדית בהילוך מהיר של דינמיקה של דופן התא באמצעות calcofluor ב-Moss Physcomitrium patens

Summary

כתב יד זה מציג פרוטוקול מפורט להדמיה של הדינמיקה התלת-ממדית של דופן התא ברקמת טחב חי, המאפשר הדמיה של ניתוק דפנות התא במוטנטים מסוג ggb ועיבוי דפוסי דופן התא בסוג הבר במהלך ההתפתחות לאורך תקופה ארוכה.

Abstract

הדמיה בהילוך מהיר עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי מאפשרת התבוננות בשינויים הדינמיים של גדילה והתפתחות ברמה התאית והתת-תאית. באופן כללי, עבור תצפיות על פני תקופה ארוכה, הטכניקה דורשת טרנספורמציה של חלבון פלואורסצנטי; עם זאת, עבור רוב המערכות, טרנספורמציה גנטית גוזלת זמן או אינה זמינה מבחינה טכנית. כתב יד זה מציג פרוטוקול להדמיית קיטוע זמן תלת-ממדי של דינמיקת דופן התא במשך 3 ימים באמצעות צבע קלקופלור (המכתים תאית בדופן תא הצמח), שפותח בפטנס פיסקומיטריום טחב. אות צבע הקלקופלור מדופן התא יציב ויכול להימשך שבוע ללא ריקבון ברור. באמצעות שיטה זו, הוכח כי ניתוק התאים במוטציות ggb (שבו תת-היחידה בטא geranylgeranyltransferase-I הוא דפק החוצה) נגרמת על ידי התרחבות תאים בלתי מבוקרת פגמים שלמות דופן התא. יתר על כן, דפוסי צביעת calcofluor להשתנות עם הזמן; אזורים מוכתמים פחות בעוצמה מתואמים עם אתרי ההתפשטות/הסתעפות העתידיים של התאים בסוג הבר. שיטה זו יכולה להיות מיושמת על מערכות רבות אחרות המכילות קירות התא וכי יכול להיות מוכתם על ידי calcofluor.

Introduction

דפנות תאי הצמח עוברות שינויים דינמיים במהלך התרחבות התאים והתפתחותם ^1,2,3. שמירה על שלמות דופן התא היא קריטית להידבקות תאי צמח במהלך גדילה והתפתחות, כמו גם לתגובה לאותות סביבתיים. למרות שהדמיית דינמיקה של דופן התא של תאים חיים לאורך תקופת זמן ארוכה היא קריטית להבנת האופן שבו הידבקות התא נשמרת במהלך הפיתוח והסתגלות לשינויים סביבתיים, השיטות הנוכחיות לצפייה ישירה בדינמיקה של דופן התא עדיין מאתגרות.

הדמיה בהילוך מהיר של שינויים תאיים יכולה לספק דינמיקה התפתחותית אינפורמטיבית של אורגניזם באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ברזולוציה גבוהה 4,5,6,7. בעוד שהדמיית תלת-ממד בהילוך מהיר היא בעלת פוטנציאל רב לחקר שינויים דינמיים בצורת התא במהלך גדילה והתפתחות, הטכניקה דורשת בדרך כלל טרנספורמציה של חלבון פלואורסצנטי 4,5,6,7. עם זאת, עבור רוב המערכות, טרנספורמציות גנטיות גוזלות זמן רב או מאתגרות מבחינה טכנית. כחלופה, צבעים פלואורסצנטיים המתחברים לרכיבים תאיים זמינים זה מכבר. הצבעים הפלואורסצנטיים יכולים לפלוט אור פלואורסצנטי לאחר הקרנה עם אור באורך גל מסוים. דוגמאות נפוצות הן Edu, DAPI, PI, FM4-64 ו- calcofluor לבן ^8,9,10. חיסרון עיקרי אחד, עם זאת, הוא שצבעים אלה יכולים לשמש בדרך כלל רק ברקמות קבועות או לניסויים קצרים, בין השאר בשל הנזק שהם גורמים לתא ^8,9,10.

עם הפרוטוקול המוצג כאן, אותות calcofluor יציבים כאשר calcofluor לבן מעורבב בתוך התווך במהלך ניסויים time-lapse ב טחב P. patens. באמצעות שיטה זו, ניתוק תאים במוטציות ggb באמצעות הדמיה תלת-ממדית בהילוך מהיר נצפה^{במשך תקופה של} 3 ימים 3 (איור 1). שיטה זו יכולה להיות מיושמת על מערכות רבות אחרות המכילות קירות התא וכי יכול להיות מוכתם על ידי calcofluor.

Protocol

הערה: עיין בטבלת החומרים לקבלת רשימת החומרים והציוד ובטבלה 1 לקבלת רשימת הפתרונות שישמשו בפרוטוקול זה.

1. הכנת צמחים לכלים תחתונים מזכוכית

1. לגדל את הרקמה פרוטונמלית טחב בתווך אגר BCDAT בצלחת פטרי 13 ס"מ תחת אור לבן קבוע (~ 50 μmol ^{m-2 s-1}) במשך 7 ימים ב 25 ° C בתא הצמיחה.
2. יש לסנן-לעקר את הקלקופלור בלבן ולאחסן בטמפרטורה של 4°C עד לשימוש. מגיב יציב במשך מספר חודשים.
3. פזרו את רקמת הטחב בת 7 הימים לתוך מיקרו-צינורית בנפח 1.5 מ"ל המכילה 20 מיקרוליטר מים מעוקרים. ודא שרקמת הטחב פרוטונמלית מפוזרת מספיק כחתיכות קטנות במים. עבור סוג פראי (WT), השתמש במלקחיים כדי להפריד את הפרוטונמטה; עבור מוטציית GGB , השתמש בפיפט P-1000.
4. הוסף 10 μL של calcofluor לבן מעוקר לתוך microtube 1.5 מ"ל ולהשאיר את microtube זקוף במכסה המנוע במשך 2 דקות עבור צביעה.
5. מיד לאחר הצביעה, יש לערבב את הצמחים עם 200 μL של BCDATG מקורר, המכיל BCDAT בינוני בתוספת 0.5% (w/v) גלוקוז ו-0.4% (w/v) gellan gum, על ידי פיפטה חמש פעמים עם פיפטה P-1000.
   הערה: ודא שמדיום BCDATG מקורר מספיק (ממש לפני שהתווך מתמצק) כדי למנוע לחץ על הצמחים.
6. מעבירים את התערובת המכילה את הצמחים ואת מדיום BCDATG לצלחת בסיס זכוכית בקוטר 27 מ"מ. ודא כי נפח BCDATG לערבוב התאים אינו עולה על 200 μL וכי 200 μL של BCDATG עם דגימות מופץ באופן שווה על פני השטח של צלחת תחתית זכוכית 7 מ"מ כדי לייצר שכבה דקה של סרט, כך הדגימות נמצאות במרחק העבודה האובייקטיבי במהלך ההדמיה.
7. לאחר התמצקות במשך 2 דקות בטמפרטורת החדר, מכסים את השכבה הדקה ב-3 מ"ל BCDATG מקורר ומניחים לה להתייצב למשך 10 דקות כדי להתמצק שוב.
   הערה: ודא ששלבים 1.2-1.5 מתבצעים במכסה מנוע סטרילי כדי למנוע זיהום.
8. בתחתית המנה, ציירו תשעה קווים כל אחד בכיוונים מקבילים ומאונכים (איור 2). סמן את השורות בתווים מ- a עד h וסמן את העמודות במספרים מ- 1 עד 8. השתמש בחלק העליון, התחתון, הימני, האמצעי והשמאלי כדי לסמן את המיקומים בתוך כל ריבוע. לדוגמה, אם צמח נמצא בריבוע בשורה השנייה ובעמודה השישית וממוקם בחלק השמאלי העליון של הריבוע, אז צמח זה מקבל את השם "b6_upper_left".
9. קדם גידול צלחת תחתית זכוכית המכילה את הצמחים תחת אור אדום במשך 5 ימים ב 25 ° C בתא הצמיחה, ולאחר מכן תחת אור לבן במשך 1-2 ימים לפני להיות נתון הדמיה time-lapse כל יום עד 3 ימים. עבור WT, טרום גידול הצמחים באור אדום חלש (0.5 μmol ^{m-2 s-1}) מלעיל במשך 5 ימים כדי לגרום לתגובה פוטוטרופית של הפרוטונמטה, כך שהצמחים יכולים להתחבר לתחתית הכלים¹¹.
   הערה: האור האדום החלש מסופק על ידי העברת אור לבן דרך מסנן פלסטיק אקרילי אדום בעובי 3 מ"מ לתוך קופסאות חסינות אור. עבור מוטנטים של ggb, גידול באור אדום הוא אופציונלי, מכיוון שלמוטנטים של ggb אין תגובה פוטוטרופית³.

2. הדמיה ושחזור תלת מימד

1. הניחו את צלחת תחתית הזכוכית המכילה צמחים על במה של מיקרוסקופ קונפוקלי הפוך, כאשר תחתית הזכוכית פונה למטרה. השתמש במיקרוסקופ קונפוקלי להדמיה של calcofluor עם עדשה אובייקטיבית 20x. צלם תמונות עם לייזר של 405 ננומטר, חור הסיכה ב- 1.0, רווח HV ב- 100, כוונון רקע היסט ב- 0, עוצמת לייזר ב- 5%-7%, גודל סריקה של 1,024 x 1,024 ומהירות סריקה של 1/2 מסגרת לשנייה. אסוף 17-30 מקטעים אופטיים מסדרה z בגודל צעד של 1.0 מיקרומטר. תן שם לתמונות באמצעות הקוד בשלב 1.6, כגון "b6_upper_left-day0", ושמור.
   1. בחר את ערוץ DAPI ברכישה וסמן את התיבה Z ב- ND Acquisition. כדי להגדיר את הגבול התחתון והעליון עבור ערימת Z, לחץ על הלחצנים העליון והתחתון.
2. לבנייה מחדש של התמונות התלת-ממדיות, פתחו את קובץ ה-nd2 (איור 3A; ראו טבלת חומרים) ולחצו על אמצעי האחסון (איור 3B).

3. הדמיה של אותם צמחים בנקודות זמן שונות

1. לאחר כל הדמיה, החזירו את צלחת בסיס הזכוכית לתא הצמיחה.
2. חזור על הפעולה משלב 2.1 עבור הדמיה ושחזור תלת-ממדי.
   הערה: כדי למצוא את אותם צמחים, השתמש בקוד המוזכר בשלב 1.6 ותן את השם "b6_upper_left-day1", או "b6_upper_left-day2", בהתאם לגיל הצמחים.

תוצאות

שיטה זו מאפשרת תצפית על דינמיקה של דופן התא במהלך ההתפתחות במוטנטים מסוג בר ומוטציות ggb (איור 1). התוצאות הראו שאזורים עם פחות עיבוי של דופן התא מתואמים עם אתרי ההתפשטות/הסתעפות של התא, מה שמאפשר חיזוי של אתרי התפשטות/הסתעפות בסוג הבר (איור 1A). פני השטח של ...

Discussion

שחזור תלת-ממדי בהילוך מהיר, או הדמיה 4-D, הוא כלי רב עוצמה לצפייה בדינמיקה של המורפולוגיה התאית במהלך תהליכים התפתחותיים. בפרוטוקול זה, על ידי ערבוב הקלקופלור הלבן בתווך, ניתן לראות את הדינמיקה של המורפולוגיה התאית התלת-ממדית בטחב P. patens. באמצעות שיטה זו, ראינו כי פני השטח של דפנות התא במ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-mm-thick red plastic light filter	Mitsubishi	no.102
27 mm diameter glass base dish	Iwaki	3930-035
Agar	Sigma	A6924
Calcofluor white	Sigma	18909-100ML-F	Calcofluor White M2R, 1 g/L and Evans blue, 0.5 g/L
Confocal microscope	Nikon	A1	NIS element software; .nd2 file in NIS-elements Viewer, download from https://www.microscope.healthcare.nikon. com/en_AOM/products/software/nis-elements/viewer
Fluorescence microscope	Nikon	TE200	Equipped with a DS-U3 camera;
Gellan gum	Nacali Tesque	12389-96
Plant Growth Chambers	SANYO	Sanyo MLR-350H
Sterilized syringe 0.22 μm filter	Millipore	SLGV033RS