קביעת פירוק חוץ גופי של רכיבים רב-אינדקסיים ברפואה הטיבטית גרגרי רודיולה

Summary

כאן, אנו בודקים את המסת גרגרי רודיולה (RG) במבחנה, מציירים עקומות המסה של סלידרוסיד, חומצה גאלית ואתיל גלאט במים טהורים במיוחד, ומתאימים את העקומות למודלים מתמטיים שונים. פרוטוקול זה מספק מידע והדרכה עבור מחקרי שקילות ביולוגית in vivo ומחקרי מתאם in vivo-in vitro של RG.

Abstract

הרכב התרופה הטיבטית גרגרי רודיולה (RG) הוא מורכב, וקשה לקבוע את האיכות הכוללת של RG. לכן, קביעת שיטה לקביעת פירוק רב-רכיבי במבחנה של RG היא בעלת משמעות רבה לבקרת איכות. מחקר זה משתמש בשיטת ההנעה השנייה של הכלל הכללי הרביעי 0931 מהפרמקופיאה הסינית (מהדורת 2020), התואמת למנגנון 2 של הפרמקופיאה האמריקאית (USP). מנגנון הפירוק הוגדר למהירות סיבוב של 100 סל"ד עם מים אולטרה-טהורים כאמצעי המסה. נפח דגימה של 1 מ"ל נאסף בכל נקודת זמן. יתר על כן, המסה מצטברת של חומצה גאלית, סלידרוסיד וחומצה גאלית אתילית ב- RG בנקודות זמן שונות נקבעה על ידי כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (HPLC). לבסוף שורטטו עקומות ההתמוססות, והעקומות הותאמו למשוואות גומפרץ, גומפרץ, לוגיסטיקה וויבול. התוצאות הראו כי המסה מצטברת של חומצה גאלית ב- RG הייתה מעל 80% בדקה אחת, המסה מצטברת של חומצה סלידרוזית וחומצה גאלית אתילית הייתה מעל 65% לאחר 5 דקות, וההמסה המצטברת של כל רכיב מדד פחתה לאחר 30 דקות. התאמת העקומה הראתה כי משוואת GompertzMod היא המודל המתאים ביותר עבור כל רכיב אינדקס של RG. לסיכום, שיטת בדיקת הפירוק המתוארת בפרוטוקול זה היא פשוטה, מדויקת ואמינה. זה יכול לאפיין את התנהגות הפירוק של רכיבי המדד ב- RG in vitro, המספק התייחסות מתודולוגית לבקרת איכות של RG והערכת איכות של תרכובות אתניות אחרות.

Introduction

בסין שכיחות מחלות הלב וכלי הדם ממשיכה לעלות, ושיעורי התחלואה והתמותה ממחלות לב וכלי דם מדורגים במקום הראשון בקרב תושבי סין¹. אנגינה פקטוריס של מחלת לב כלילית נגרמת על ידי היצרות לומינלית עקב טרשת עורקים כלילית, מה שמוביל אספקת דם כלילית לא מספקת יחסית איסכמיה שריר הלב היפוקסיה². בשנים האחרונות, ההשפעה המרפאת של הרפואה הסינית המסורתית בטיפול במחלת לב כלילית מוכרת על ידי רופאים רבים³.

לרפואה הסינית המסורתית תפקיד חשוב בהקלת הסימפטומים הקליניים ובשיפור איכות החיים של החולים⁴. גרגרי רודיולה (RG) מופקים ומזוקקים מצמח המרפא של הרמה הטיבטית Rhodiola rosea L. המרכיבים העיקריים של RG הם סלידרוסיד, רודיוסין ופלבנואידים ^5,6. RG יש את ההשפעה של תוספת Qi⁷ והפעלה וקידום זרימת הדם כדי להקל על הכאב. מבחינה קלינית, הוא משמש לטיפול בחסימות חזה הנגרמות על ידי מחסור בצ'י וקיפאון דם, מחלת לב כלילית, אנגינה פקטוריס⁸. קביעת התוכן לבדה אינה משקפת במלואה את האיכות הפנימית של התרופות, שכן הן ההתפוררות והן הפירוק במבחנה יכולים להשפיע על הזמינות הביולוגית והיעילות של התרופות ^9,10. שיטות הבדיקה לפירוק הרפואה הסינית כוללות את שיטת הסל המסתובב, שיטת המשוט ושיטת הכוס הקטנה. החיסרון של שיטת הסל המסתובב הוא שרק החלק החיצוני של הסל המסתובב בא במגע עם תווך הפירוק במהלך הסיבוב, דבר שאינו משקף את התנהגות הפירוק בעולם האמיתי. שיטת ההנעה יכולה להתגבר על החיסרון הנ"ל, מה שהופך אותה למתאימה יותר משיטת הסל לחלק מתכשירי הרפואה הסינית המוצקה¹¹. נכון לעכשיו, אין דו"ח על ניתוח פירוק חוץ גופי של RG. על מנת לשלוט באיכות RG באופן מקיף יותר, נחקרה התנהגות הפירוק של שלושת מרכיבי האינדקס (חומצה גאלית, סלידרוסיד ואתיל גלאט) ב-RG. מחקר זה מספק נתונים לבקרת האיכות של RG והתייחסות מתודולוגית להערכת איכות של תכשירי תרכובות אתניות אחרות.

Protocol

1. הכנת פתרון

1. הכינו את תמיסת מלאי חומרי הייחוס: שקלו 10.6 מ"ג סלידרוסיד, 5.24 מ"ג חומצה גאלית ו-5.21 מ"ג חומצה גאלית בנפרד על איזון אנליטי אלקטרוני והוסיפו אותם בנפרד לצלוחית נפחית של 5 מ"ל. לאחר מכן, הוסף מתנול כיתה HPLC להתמוסס ולדלל ל 5 מ"ל. לבסוף, יש לנער היטב כדי לקבל את תמיסת מלאי חומרי הייחוס עם ריכוזי מסה של 2.120 מ"ג/מ"ל, 1.048 מ"ג/מ"ל ו-1.042 מ"ג/מ"ל, בהתאמה.
   הערה: תמיסת מלאי חומרי הייחוס מכילה 2.120 מ"ג/מ"ל סלידרוסיד, 1.048 מ"ג/מ"ל חומצה גאלית ו-1.042 מ"ג/מ"ל אתיל גלאט כתמיסת המניות של כל תמיסה בעקומת התקן הבאה.
2. הכן את הפתרון לדוגמה לבדיקה. חלץ 2.8 גרם RG (רשימת חומרים) עם 10 מ"ל מתנול באיכות HPLC באמצעות מכונת ניקוי קולית (הספק: 200 W, תדר: 40 kHz) למשך 30 דקות, ולאחר מכן סנן אותו עם מסנן 0.22 מיקרומטר לבדיקת הסתגלות המערכת.
3. הכינו תמיסת ייחוס מעורבת המכילה 0.590 מ"ג/מ"ל סלידרוסיד, 2.030 מ"ג/מ"ל חומצה גאלית ו-1.930 מ"ג/מ"ל אתיל גלאט.
   הערה: כל תקן (2.950 מ"ג סלידרוסיד, 10.150 מ"ג חומצה גאלית ו-9.650 מ"ג חומצה אתילית גאלית) מומס בבקבוק נפחי של 5 מ"ל במתנול ברמת HPLC כמדיום המסה.
4. קבל את התוכן התיאורטי של כל מרכיב אופייני של RG עבור מיצוי מים טהורים במיוחד.
   1. מניחים 2.8 גרם RG בצלוחית חרוטית של 500 מ"ל, מוסיפים 200 מ"ל מים טהורים במיוחד, ומוציאים אולטרה-סאונד (הספק: 200 W, תדר: 40 קילוהרץ) למשך 60 דקות. לאחר מכן, סנן אותו עם מסנן 0.22 מיקרומטר.
   2. לקבוע את התוכן של פתרון הבדיקה על פי המשוואה הליניארית המתקבלת בניסוי הבא.

2. מצב כרומטוגרפי

1. הגדר את התנאים הכרומטוגרפיים כפי שמוצג בטבלה 1 עבור כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים. לפרטים על המכשיר שבו נעשה שימוש, עיין בטבלת החומרים.

3. בדיקת הסתגלות המערכת

1. לחקור את הקשר הלינארי.
   1. דללו את תמיסות מלאי הייחוס של חומצה גאלית ואתיל גלאט פי 5, 10, 25, 50 ו-125, ואת תמיסות מלאי הייחוס של סלידרוסייד פי 2, 4, 8, 16 ו-32 פעמים כדי לקבל את תמיסת ריכוז השיפוע לשרטוט עקומה סטנדרטית.
      הערה: התאמת יחס הדילול של העקומה הסטנדרטית בהתאם לניסוי המקדים של הטיפול בדגימה. בניסוי הראשוני, פתרונות המניות של שלושת התקנים דוללו תחילה 5, 10, 25, 50 ו-125 פעמים, ולאחר מכן שורטטה עקומת התקן הראשונה. עם זאת, כאשר זוהה ריכוז דגימת הבדיקה, נמצא כי ריכוזי הסלידרוזיד אינם נמצאים בטווח הליניארי של עקומה סטנדרטית זו, ולכן הותאמו הריכוזים כך שיכללו אותם בעקומה. לסיכום, הניסויים המקדימים לעיל שימשו לקביעת ריכוזי הדילול הסופיים של שלוש דגימות הבדיקה למחקרים הניסיוניים הבאים.
2. בדיקות מדויקות: הזריקו 10 μL של תמיסת הייחוס המעורבת למערכת HPLC שש פעמים ביום והריצו את הדגימות עם אותם תנאי HPLC המתוארים בשלב 2.1. הקלט את אזור השיא של כל רכיב תכונה.
3. ניסויי בדיקת יציבות: הזריקו 10 מיקרוליטר של תמיסת הדגימה שהוכנה וקבעו את אזורי השיא של HPLC בהתאם לתנאים הכרומטוגרפיים לאחר 0 שעות, 6 שעות, 10 שעות, 12 שעות, 14 שעות, 16 שעות, 18 שעות, 20 שעות ו-24 שעות, בהתאמה.
   הערה: אזורי השיא נרשמים באופן אוטומטי על-ידי מערכת HPLC.
4. בדיקת שחזור: קח שש דגימות של אותה אצווה של RG כדי להכין את פתרון דגימת הבדיקה בהתאם לשיטה בשלב 1.2. יש להזריק 10 μL מכל דגימה למערכת HPLC. הפעל את הדגימות כמתואר בשלב 2.1 וקבע את יכולת השחזור.
   הערה: יכולת החזרה הוערכה על ידי השוואת הבדלי הריכוז בין שש הדגימות.
5. ניסוי שחזור
   1. הכינו שש מנות של אותה אצווה של RG לפתרון הבדיקה. לאחר מכן, הוסף כ -50% מחומר הייחוס של כל רכיב מדד בתמיסת הבדיקה כדי לחשב את שיעור ההתאוששות. הפעל דגימות אלה במערכת HPLC עם אותם תנאים המתוארים בשלב 2.1.
   2. חשב את קצב ההתאוששות.
      הערה: קצב התאוששות = (C - A) / B x 100, כאשר A הוא כמות הרכיב שיש למדוד בתמיסת הבדיקה, B הוא כמות חומר הייחוס שנוספה ו- C הוא הערך הנמדד של התמיסה המכילה את חומר הייחוס ואת דגימת RG. עיין בשלב 2.1 לקבלת התנאים הכרומטוגרפיים לביצוע השלבים לעיל (כלומר, שלבים 3.1-3.5).

4. בדיקת המסה חוץ גופית

1. בצע את בדיקת הפירוק בשיטת ההנעה של השיטה השנייה של כלל כללי 0931 מהפרמקופיאה הסינית (מהדורת 2020)¹².
   הערה: טכניקת הדגימה והציוד: למנגנון המסת התרופות (טבלה של חומרים) יש המסה, משוט, מערכת בקרת טמפרטורה ומערכת התאמת מהירות. לפני תחילת ניסוי ההתמוססות, המים מחוממים מראש לטמפרטורה מוגדרת, ולאחר מכן נקבעת המהירות המתאימה. התחל להקליט את השעה מיד לאחר הוספת RG.
2. הוסף 100 מ"ל של מים טהורים במיוחד לתוך המסה של מנגנון המסת התרופה ולשמור על הטמפרטורה ב 37 °C ± 0.5 °C (75 °F). הגדר את מהירות הסיבוב ל- 100 סל"ד.
   הערה: למנגנון הפירוק יש מכשיר חימום המאפשר להגדיר את הטמפרטורה בתוך המערכת. לא היה הבדל משמעותי בקצב המסת הסלידרוזיד במים, מיץ קיבה מלאכותי (16.4 מ"ל חומצה הידרוכלורית מדוללת [234 מ"ל חומצה הידרוכלורית מרוכזת מדוללת ל-1000 מ"ל עם מים] עם כ-800 מ"ל מים ו-10 גרם פפסין, מזועזע היטב ומדולל במים עד 1,000 מ"ל), ומיץ מעיים מלאכותי (חיץ פוספט [pH 6.8] המכיל טריפסין)¹³. המים הזמינים ביותר (אולטרה טהורים) נבחרו כמדיום המסה.
3. הוסיפו 2.8 גרם RG לכוס המסה והתחילו להקליט את משך ההמסה באופן מיידי. אספו סך של 1 מ"ל של הדגימה עם מזרק (ראו טבלת חומרים) בדקה, 5 דקות, 10 דקות, 20 דקות, 30 דקות ו-60 דקות, והשלימו את הנפח בכוס ההמסה עם מדיום המסה באותה טמפרטורה באופן מיידי.
   הערה: צינור הדגימה בכוס ההמסה אינו יכול לאסוף נפחי דגימה קטנים, ולכן המזרק משמש לאיסוף הדגימה. יש לאסוף דגימות במהירות כדי למנוע החמצת נקודות זמן איסוף שצוינו.
4. מיד לסנן את הדגימות שנאספו דרך קרום microporous 0.22 מיקרומטר ולקחת את הסינון הבא. קבע את התוכן של כל רכיב בכל נקודת זמן לפי HPLC (לפי שלב 2.1) וחשב את הפירוק המצטבר.
   1. כדי לחשב את הפירוק המצטבר, חשב את הפירוק של כל נקודת זמן (X_n):
      X_n = A / B x 100, כאשר A היא כמות הרכיבים הנמדדת בכל נקודת זמן ו- B הוא התוכן התיאורטי של כל רכיב.
   2. לאחר מכן, חשב את הפירוק המצטבר (Y):
      Y = X n + (X 1 + ... + X_n-1) x V 2 / V 1, כאשר V ₁ הוא הנפח הכולל של מדיום הפירוק ו_- V ₂ הוא נפח המומס שנוסף לאחר כל דגימה.
      הערה: בשל ערכי התגובה הנמוכים של סלידרוסיד וחומצה גאלית בכרומטוגרמה, ההמסה המצטברת של סלידרוסיד ואתיל גלאט בנקודת הזמן של דקה אחת לא שורטטה בעקומת ההתמוססות.

5. התאמת מודל הפירוק

1. יבא את נתוני הפירוק המצטברים בכל נקודת זמן לתוכנת ניתוח הנתונים.
2. השתמש בתוסף ניתוח פירוק תרופות בתוכנת ניתוח הנתונים כדי להתאים למשוואת GompertzMod, משוואת Gompertz, המשוואה הלוגיסטית ומשוואת Weibull¹⁴. ככל שהערך של R² גדול יותר, כך אפקט התאמת העקומה טוב יותר.
   1. הפעל את התוכנה, בחר בחלון Book1 כדי להיכנס לחלון עריכת נתוני מקור .
   2. בעמודה הראשונה A(X)-Long Name input Time, הגדר Time כזמן והזן כל זמן לקביעת פירוק. הזן נתונים בעמודה השניה B(Y)-Long Name, הגדר נתונים כפירוק המצטבר, הזן את אחוז הפירוק המצטבר של כל זמן קביעת פירוק.
   3. לאחר הזנת הנתונים, בחר את העמודה A(X ) ו - B(Y), ובחר את התוסף Drug Dissolution Analysis בשורת התפריטים של התוכנה ולחץ על Fit Dissolution Data > Concatenate Fit > OK. התוכנה מייצרת את התוצאות המתאימות של כל דגם.

תוצאות

במחקר זה, הדיוק, היציבות, החזרתיות ושחזור הדגימה של RG היו כולם בטווח המתודולוגי שצוין בפרמקופיאה הסינית (Volume 4, 2020)¹², מה שמצביע על כך שהשיטה אפשרית. לאחר ניפוי באגים חוזר, נקבע כי שיפוע האלוציה ששימש במחקר זה היה ברזולוציה טובה (איור 1) עבור שלושת רכיבי האינדקס ב-RG....

Discussion

בדיקת ההמסה היא שיטה אידיאלית במבחנה המדמה התפוררות ופירוק של תכשירים אוראליים מוצקים במערכת העיכול¹⁵. זהו מדד חשוב להערכה ובקרה של איכות של תכשירים אוראליים מוצקים. לכן, מבחן הפירוק ממלא תפקיד חיוני בפיתוח תכשירים אוראליים מוצקים¹⁶. בפרט, עם התפתחות טכנולוג?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chromatographic column	ZORBAX Eclipse	XDB-C18	4.6 mm x 250 mm, 5 µm
Drug dissolution tester	Shanghai Huanghai Pharmaceutical Inspection Instrument Co., Ltd.	RCZ-6B3
Electronic analytical balance	Shanghai Liangping Instruments Co., Ltd.	FA1004
Ethyl gallate (HPLC, ≥98%)	Chengdu Desite Biotechnology Co., Ltd.	DSTDM006301
Function drawing software	OriginLab Corporation, Northampton, MA, USA	2022
Gallic acid (HPLC, ≥98%)	Chengdu Desite Biotechnology Co., Ltd.	DSTDM000802
High performance liquid chromatography	Agilent Technologies Singapore (International) Pte. Ltd.	Agilent 1260 Infinity
HPLC grade methanol	Thermo Fisher Scientific (China) Co., Ltd.	216565
Injector	Chengdu Xinjin Shifeng Medical Apparatus & Instrument Co., Ltd.	0.7 (22 G)
Millipore filter	Tianjin Jinteng Experimental Equipment Co., Ltd	φ13 0.22 Nylon66
Rhodiola granules	Tibet Nodikang Pharmaceutical Co., Ltd.	210501
Salidroside (HPLC, ≥98%)	Chengdu Desite Biotechnology Co., Ltd.	DST200425-037
Ultra pure water systemic	Merck Millipore Ltd.	Milli-Q
Ultrasonic cleansing machine	Ningbo Xinyi Ultrasonic Equipment Co., Ltd	SB-8200 DTS