תסיסה משותפת של Marsdenia tenacissima עם Ganoderma lucidum והשפעה אנטי-סרטנית של מוצרי התסיסה

Summary

כאן, אנו מתארים פרוטוקול להקמת מערכת תסיסה משותפת שיטתית ומקיפה לייצור מוצרי טרנספורמציה ביולוגית עשירים בספונינים חריפים באמצעות Marsdenia tenacissima (Roxb.) וייט וארן. (MT) כמדיום תסיסה עבור Ganoderma lucidum. זה ישמש כהתייחסות מתודולוגית לפיתוח תרופות אתניות אחרות.

Abstract

Marsdenia tenacissima (Roxb.) וייט וארן. (MT), כתרופת צמחי מרפא סינית ודאי מסורתית, יש לה תכונות אנטי דלקתיות, אנטיבקטריאליות ואנטי גידוליות. עם זאת, רוב החומרים הפעילים העיקריים שלו הם אגליקונים, כגון טנציגנין A וטנסיגנין B. מכיוון שהזמינות הביולוגית של MT נמוכה ומרכיביו הפעילים הרפואיים מאתגרים לסינתזה, הוא נחקר בעיקר על ידי טרנספורמציה ביולוגית. מחקר זה נועד לייצר מוצרי טרנספורמציה ביולוגית עשירים בספונינים חריפים על ידי שימוש ב-MT כמדיום תסיסה עבור Ganoderma lucidum (G. lucidum).

באמצעות סינון ראשוני של שלוש פטריות מרפא, נמצא כי G. lucidum ו-Ophiocordyceps sinensis (O. sinensis) יכולים בדרך כלל לגדול במדיום עבור MT; לפיכך, יעילות התסיסה של שני סוגי הפטריות נבדקה באמצעות מודל עכברי של סרטן ריאות. לבסוף, התסיסה המשותפת של G. lucidum ו-MT נבחרה למחקר נוסף. ניתוח מטבולומי שאינו מטרה בוצע על תוצרי MT עם תסיסה משותפת של G. lucidum . זיהינו 12 ספונינים ספציפיים של MT מתוצרי התסיסה, וקיבלנו תרכובת מונומרית, tenacigenin A, ממוצרי התסיסה.

רוב הטנציגנין הראה מגמת עלייה משמעותית, דרך רמות טנציגנין A וטנסיגנין B. התוצאות הראו כי היעילות של MT השתפרה לאחר התסיסה על ידי G. lucidum. יתר על כן, הטרנספורמציה הביולוגית של גליקוזידים סטרואידים C₂₁ ב-MT הייתה התגובה המרכזית בתהליך תסיסה זה. לסיכום, מחקר זה ביסס מערכת תסיסה משותפת שיטתית ומקיפה ושיטת הערכה פרמקודינמית ל-MT, שלא רק שיפרה את הניצול המלא של חומרים פעילים יעילים ב-MT אלא גם סיפקה התייחסות מתודולוגית לפיתוח תרופות אתניות אחרות.

Introduction

סרטן ריאות שייך לקטגוריה של "קרבונקל ריאות" ברפואה הסינית המסורתית. הפתוגנזה של קרבונקל ריאות היא חולשה של ה"צ'י" הבריא של החולים, חוסר איזון של יין ויאנג, רעלים וקיפאון בריאות, מה שמוביל לתפקוד לקוי של הריאות, חסימת דם ואיבוד נוזלים בריאה. לפיכך, קיפאון דם לטווח ארוך ורעלני כיח בריאות יוצרים מסת ריאות¹. לכן, חיזוק הצ'י וסילוק גורמים פתוגניים הוא העיקרון הבסיסי לטיפול בסרטן הריאות. השיטות להזנת יין לאיזון יין ויאנג, ניקוי חום, ניקוי רעלים ופיזור קיפאון, השלמת צ'י והזנת יין וניקוי ליחה משמשות לטיפול ומניעה של היווצרות קרבונקלים ריאתיים².

מרסדניה (שם מדעי: Marsdenia tenacissima ) הוא צמח מרפא ממשפחת ה-Asclepiadaceae (Marsdenia ssp.), הידוע גם בשם ווגוטנג. יש לו השפעות של פינוי חום וניקוי רעלים, הקלה על שיעול ואסטמה, ויש לו תכונות אנטי-גידוליות³. הזרקת Xiaoaiping, תכשיר העשוי מעשב יחיד של MT, נמצא בשימוש נרחב במרפאות ומראה השפעה אנטי-סרטנית טיפולית טובה⁴. עם זאת, עם גידול האוכלוסייה, הביקוש ל-MT גדל בחדות. בהתאם, אספקת משאבי MT פראיים אינה מספקת, ואיכות החומרים הרפואיים המעובדים אינה אחידה. ישנן בעיות כמו איכות ירודה של חומרי צמחים, תכולה לא יציבה של מרכיבים וזמינות ביולוגית נמוכה, המאיימות ברצינות על התפתחות MT. בין התרכובות הביו-אקטיביות הללו, ספונינים מ-MT נחקרו מאוד. זוהו יותר מ-100 ספונינים מ-MT; ניתן לחלק אותם לשני סוגים עיקריים: (1) C₂₁ גליקוזידים סטרואידים ב-MT, כולל tenacissoside A-P, marsdenoside A-M, tenacigenoside A-L ו-tenacigenin A-D. (2) טריטרפנים פנטציקליים, כגון חומצה אולאנולית וחומצה אורסולית. מחקרים רבים הצביעו על כך שהפעילות האנטי-סרטנית של תמציות אתר נפט גבוהה יותר מהמולקולות הקוטביות ביותר מ-MT. לפיכך, כדאי להמיר את הפוליסכריד העיקרי של ספונינים מ-MT לאגלקון מינורי אחר של MT עם זמינות ביולוגית ופעילות ביולוגית גבוהה יותר⁵.

ביוטרנספורמציה, הידועה גם בשם ביוקטליזה, מתייחסת לתגובות הפיזיולוגיות והביוכימיות של טרנספורמציה או שינוי מבני של מצעים אקסוגניים על ידי שימוש באנזימים קשורים במערכות ביולוגיות⁶. הוא חסכוני יותר, בטוח יותר, סלקטיבי מבחינה אזורית וסטריאוסלקטיבי יותר מסינתזה כימית מסורתית ויכול לייצר כמה תרכובות ביו-אקטיביות שקשה להכין על ידי כימיה סינתטית קונבנציונלית ^7,8. לכן, פיתוח הרפואה הסינית המסורתית והתרופות הטבעיות חיוני לקידום המודרניזציה והבינלאומיות של הרפואה הסינית המסורתית.

מערכת התסיסה המשותפת של MT הוקמה באמצעות טרנספורמציה ביולוגית. החומרים הרפואיים המקוריים עברו טרנספורמציה על ידי מערכות אנזימים מיקרוביאליות. מצד אחד, תמצית MT שימשה כמצע לייצור תרבית התסיסה של פטריות במצב זה. במקביל, תסיסה פטרייתית קיצרה את מחזור הרבייה של חיידקים, הפחיתה את עלויות הייצור ושיפרה את יעילות הייצור⁹. מצד שני, המשקעים המוגברים של רכיבים פעילים על ידי תסיסה פטרייתית מועילים, מייצרים רכיבים כימיים ויעילות משופרת¹⁰. השימוש בטכנולוגיית תסיסה דו-כיוונית נוזלית מועיל להגנה על החומרים הפעילים של חומרים רפואיים, שיפור היעילות, חיסכון במקורות תרופות ועשוי לייצר יעילות טובה יותר על ידי מתן טכניקות לשינוי מבני של חומרים פעילים של חומרי צמחים. יש חשיבות רבה לשיפור רמת המודרניזציה של הרפואה הסינית המסורתית.

במחקר זה, G. lucidum, O. sinensis ו-Inonotus obliquus (I. obliquus) נבחרו כמיקרואורגניזמים לתסיסה בשלב מוקדם לאחר סקירת הספרות, והזנים נבדקו מראש. לאחר מכן, זני התסיסה הסופיים נקבעו על ידי בחינת היעילות של הזנים המוקרנים באמצעות מודל עכבר הגידול. לבסוף, המטבוליטים הראשוניים והמטבוליטים המשניים של תוצרי התסיסה נותחו והוערכו באופן שיטתי על ידי LC-MS, וקיבלנו תרכובת מונומרית, tenacigenin A, מתוצרי תסיסה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

מחקר זה נערך בעקבות המלצות המרכז לחיות ניסוי של אוניברסיטת מינזו (No. ECMUC2019008AA). הפרוטוקול אושר על ידי הוועדה האתית של חיות ניסוי של אוניברסיטת מינזו. MT נאסף מקונמינג, מחוז יונאן.

1. הכנה ללימוד

1. חלץ MT עם מים חמים (100 מעלות צלזיוס; MT/water = 1/10, w/v) למשך 30 דקות ולאסוף את שאריות מיצוי MT כחומר הבדיקה.
2. שמור על קו תאי סרטן הריאות של עכבר LLC במדיום הנשר המותאם (DMEM) של Dulbecco בתוספת 10% סרום בקר עוברי, 100 U/mL פניצילין ו-100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין באווירה לחה ב-37 מעלות צלזיוס מתחת ל-5% CO₂.
3. שמור את עכברי C57BL/6J, בני 6-8 שבועות ובמשקל 19 ± 2 גרם, בחדר מבוקר סביבתי עם מחזור אור/חושך של 12 שעות/12 שעות ועם גישה בלתי מוגבלת למזון ומים. לחטא אותם באופן קבוע.

2. סינון ראשוני של זנים

1. לחסן שלושה זני פטריות למדיום מוצק דקסטרוז אגר תפוחי אדמה (PDA) באמצעות טכניקות סטריליות ולגדל אותם בחושך בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס. לאחר שהכלים מכוסים במלואם בפטריות, יש לאחסן אותם בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
2. יש לחסן את הזנים שנשמרו במדיום המוצק PDA בתמיסת הזרעים של בקבוק השייק בשלב הראשון ולתרבית אותם בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס, עם ניעור ב-120 סל"ד למשך 4-5 ימים. חסנו את נוזל הפטריות בשלב הראשון לתוך בקבוק השייק המכיל את נוזל הפטריות המשני ביחס נפח של 1:20 בשייקר טמפרטורה קבועה למשך 4-5 ימים.
3. מדללים את ה-MT במים ל-100 מ"ג/ליטר (MT/מים) ומוסיפים את התמיסה לאגר ליצירת מדיום מוצק. יש לחסן 1 מ"ל מהנוזל הפטרייתי המשני של כל אחד משלושת הזנים לתוך התרבית המוצקה המכילה MT בלבד, ולאחר מכן לחלק למערכות תרבית G. lucidum-MT, I. obliquus-MT ו-O. sinensis-MT. מקם את מערכות התרבות הללו בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס מבלי לרעוד בחושך.
4. לאחר זמן מה, התבונן בצמיחת הזנים בשלוש מערכות התרבית הנ"ל, ובחר את הזנים שיכולים לגדול רק עם MT לבדיקה נוספת.

3. סינון מחדש של בחירת זנים

הערה: לאחר הקרנה ראשונית, רק G. lucidum ו-O. sinensis יכלו לגדול באופן נורמלי על מדיום מוצק המכיל MT. כדי לבחור עוד יותר את המערכת עם אפקט אנטי-גידולי טוב, נבדקה היעילות האנטי-גידולית במודל עכבר גידול מושתל.

1. יש לחסן את G. lucidum ו-O. sinensis למדיום נוזלי המכיל רק MT-MT עם תסיסה משותפת של G. lucidum (MGF) ו-MT עם תסיסה משותפת של O. sinensis (MOF), ולתסוס במשך 10 ימים ב-28 מעלות צלזיוס עם ניעור ב-180 סל"ד.
2. לאחר התסיסה יש לסנן את התפטיר דרך גזה ולייבש אותו. תמצית עם 80% אתנול 3 x 12 שעות.
3. בדוק את הפעילות האנטי-גידולית של ה-MT המותסס והלא מותסס בעכברי C57BL/6J נושאי תאי גידול LLC.
   1. הזרקה תת עורית של תאי LLC (1.0 × 10⁶ תאים ב-0.2 מ"ל של מי מלח עם חוצץ פוספט (PBS) לכל עכבר) לאגף הימני של עכברי C57BL/6J זכרים (למעט בקבוצת הביקורת).
   2. כדי לאשר הקמה מוצלחת של המודל, גע בגושי הגידול וודא שהם בגודל ~5 מ"מ. קבץ באופן אקראי את העכברים נושאי הגידול (n = 10 לקבוצה) לקבוצת המודל, קבוצת MGF, קבוצת OF, קבוצת MT וקבוצת ציספלטין (ביקורת חיובית). מתן מי מלח לקבוצת הביקורת (ללא תאי גידול) ולקבוצת המודל. הקריבו את העכברים לאחר 14 יום של טיפול ואספו את רקמת הגידול.

4. ניתוח הרכב כימי של מוצרי תסיסה

הערה: לאחר אימות יעילות התסיסה, G. lucidum נבחר כזן התסיסה במחקר זה. ביצענו ניתוח מטבולומי של MGF על ידי כרומטוגרפיה נוזלית-ספקטרומטריית מסה (LC-MS)¹¹.

1. יש לחלץ 10 מ"ג של MT, G. lucidum ו-MT עם תסיסה משותפת של G. lucidum (MGF) עם 500 מיקרוליטר של מתנול:H₂O (7:3), לנער ב-4 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת, סוניקט למשך 30 דקות וצנטריפוגה למשך 20 דקות ב-1,200 × גרם. אסוף את הסופרנטנטים, סנן אותם דרך קרום פלואוריד פוליווינילידן של 0.22 מיקרומטר, והזריק לתוך מערך ספקטרומטריית המסה של כרומטוגרפיה נוזלית-טנדם (LC-MS/MS).
   הערה: מטבוליטים מופרדים של כרומטוגרפיה נוזלית אולטרה ביצועים (UPLC) וספריית דגימות בקרת איכות (QC) נבנו על ידי ספקטרומטריית מסה ברזולוציה גבוהה (ראה טבלת חומרים).
2. השתמש בתנאי ה-UPLC הבאים: עמודת C18 (100 מ"מ x 2.1 מ"מ; 8 מיקרומטר), חומצה פורמית ניידת A-0.1% (v/v) במים טהורים במיוחד, שלב נייד B-אצטוניטריל. הגדר את פרופיל שפיכת מעבר הצבע ל- 0 דקות 5% B; 2 דקות 5% B; 14 דקות 98% B; 17 דקות 98% B; 17.1 דקות 5% B; 20 דקות 5% בקצב זרימה של 0.3 מ"ל לדקה.
3. זיהוי וזיהוי המטבוליטים על ידי ספקטרומטריית מסה ברזולוציה גבוהה. הגדר את טמפרטורת העמודה ל-40 מעלות צלזיוס, את טמפרטורת המזרק האוטומטי ל-4 מעלות צלזיוס ואת נפח ההזרקה ל-2 מיקרוליטר. שמור על תנאי MS הבאים: כרךtage של מקור היונים האלקטרו-ספריי: +5,500/-4,500 וולט; הלחץ של גז הווילון, מקור היונים 1 ומקור היונים 2: 35, 60 ו-60 psi, בהתאמה; טמפרטורת מקור היונים: 600 מעלות צלזיוס; פוטנציאל הדה-פולימריזציה: ± 100 וולט.
4. הכן את דגימות בקרת האיכות (QCs) על ידי ערבוב נפחים שווים של תמציות MT, GL ו-MGF, וקרא לשלושת השכפולים QC 1-3, בהתאמה. לעבד ולזהות דגימות בקרת איכות וניתוח על ידי ביצוע אותם שלבים. הכנס דגימת QC עבור כל שלוש דגימות כדי לחקור את יכולת החזרה של זיהוי וניתוח.

5. מיצוי ובידוד של מוצרי תסיסה

1. ממיסים את תמצית התסיסה המתקבלת ממרק התסיסה במים מזוקקים ומערבבים היטב.
   הערה: כאן, 2 ק"ג תמצית תסיסה התקבלו מ -40 ליטר מרק תסיסה.
2. מקטע 4, הסר 10%, 30%, 50%, 70% ו-95% שברי אתנול באמצעות עמודת שרף ספיחה מקרו-נקבובית ואסוף את השברים.
   הערה: כאן התקבלו 10.72 גרם מחלק האתנול 95%, 34.72 גרם מחלק האתנול 70%, 61.57 גרם מחלק האתנול 50% ו-79.7 גרם מחלק האתנול 30%.
3. בהתבסס על הקוטביות של השברים, יש להוציא את שבר האתנול של 70% באמצעות כרומטוגרפיה של עמודת סיליקה ג'ל עם אתיל אצטט: פליטת מתנול ולאסוף את השברים.
   הערה: כאן, נאספו Fr. 1-Fr. 7.
4. בצע כרומטוגרפיה של עמודת Sephadex LH-20 כדי לטהר עוד יותר את השברים (כאן, Fr. 3 ו-Fr. 4) ואחריו הפרדת פאזה נוזלית חצי מכינה לאחר הטיהור באמצעות 1.0 גרם מכל שבר.
   הערה: על ידי שימוש בכרומטוגרפיה נוזלית הכנה למחצה וכרומטוגרפיה של עמודת סיליקה ג'ל, בודדנו וטיהרנו את חלק האתנול של 95%.
5. בצע מיקרוספקטרוסקופיה וספקטרוסקופיה של תהודה מגנטית גרעינית והשווה את מבנה התרכובת עם מבנים ממאגרי נתונים עבור 600M ו-700M וקבע את המבנה המישורי של התרכובת/ים.
   הערה: כאן, נעשה שימוש בספקטרומטר מסה היברידי כדי לקבוע את המשקל המולקולרי של התערובת. זיהינו את המבנה של תרכובת אחת (ראו איור משלים S1).

6. ניתוחים סטטיסטיים

1. חזור על כל ניסויי התסיסה שש פעמים. הערכת מובהקות סטטיסטית באמצעות מבחן t של סטודנט. בטא את כל הנתונים כממוצע ± SD, חזור על כל הניסויים במשולש והגדר p < 0.05 למובהקות סטטיסטית (*0.01 ≤ p ≤ 0.05, **0.001 ≤ p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001).
2. השתמש בתוכנת SCIEX OS כדי לזהות מטבוליטים בעיקר על סמך שגיאת מסה, זמן שמירה, התאמת איזוטופים, ציון טוהר ספריית MS/MS ונוסחה מולקולרית חישובית. השתמש בפרמטרים הבאים של הגדרת ספריה: שגיאת מסה < 5 עמודים לדקה, הפרש יחס איזוטופים < 20 וציון ספרייה > 50.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

תוצאות סינון ראשוניות של זנים
כדי לחקור פטריות המסוגלות לתסוס במשותף עם MT, בחרנו שלוש פטריות: G. lucidum, I. obliquus ו- O. sinensis. ראשית, הזנים הופעלו: G. lucidum, I. obliquus ו-O. sinensis חוסנו בתווך PDA כפי שמוצג באיור 1A-C;

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

לאחר ניסויי סינון זנים, מצאנו שלא כל פטריות המרפא יכולות לשרוד באופן נורמלי על חומרי עשב. ללא כל מדיום נוסף, הישרדותן של פטריות מרפא תלויה בפירוק הרכיבים בחומרים רפואיים באמצעות אנזימים משלהם לסינתזה של מקורות הפחמן והחנקן הנדרשים. ניתן להסיק כי I. obliquus עשוי שלא להכי...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetonitrile	Tonguang Fine Chemicals Company, Beijing, China	20200923
Agar	Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd., USA	NO.20080107
Autoclave	BinJiang Medical Co., Ltd., Jiangyin, China	LS-50LD
constant shaking incubator	Zhicheng Inc. All rights reserved., Shanghai, China	ZWY-100D
Ganoderma lucidum	BeNa Culture Collection, Beijing, China	31732
Inonotus obliquus	BeNa Culture Collection, Beijing, China	117822
LLC Mouse lung cancer cell	National Infrastructure of Cell Line Resource, Beijing, China	PUMC000673
Male C57BL/6J mice	Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd., Beiijng, China	No.110011210107024684
Methanol	Tonguang Fine Chemicals Company, Beijing, China	20210723
Ophiocordyceps sinensis	BeNa Culture Collection, Beijing, China	118371
Poly tetra fluoroethylene	Jinteng Experiment Equipment Co., Ltd., Tianjing,China	No.997
QTRAP 5500 LC/MS	AB Sciex Pte. Ltd., USA	CV20231711
Rotary Evaporator	BUCHI Co., Ltd., Shanghai, China	R-300
Syringe	Zhiyu Medical Instrument Co., Ltd., Jinagsu, China	V500111
Ultra-clean bench	BOXUN Medica Bioological Instrument Co., Ltd., Shanghai, China	SW-CJ-LFD