ניתוח והדמיה של אוסטיאוציטים

Summary

מחקר זה מתאר את השיטה לדמיין ולפתח מודלים תלת-ממדיים (תלת-ממדיים) של אוסטיאוציטים בתוך הרשת הלאקונרית-קנאליקולרית (LCN) לניתוח דינמיקת נוזלים חישובית (CFD). המודלים שנוצרו בשיטה זו מסייעים להבין אוסטיאוציטים mechanosensation בעצמות בריאות או חולות.

Abstract

אוסטיאוציטים הם תאי עצם שנחשבים כמגיבים לזנים מכניים וללחץ גזירה של זרימת נוזלים (FFSS) על ידי הפעלת מסלולים ביולוגיים שונים בתהליך המכונה מכנוטרנסדוקציה. מודלים קונפוקליים של רשתות אוסטיאוציטים הם כלי רב ערך לביצוע ניתוח Computational Fluid Dynamics (CFD) להערכת עומסי גזירה על קרום האוסטאוציטים, שלא ניתן לקבוע באמצעות מדידה ישירה. מודלים חישוביים באמצעות תמונות ברזולוציה גבוהה אלה של הארכיטקטורה המיקרו-מבנית של העצם שימשו כדי לדמות מספרית את העומס המכני המופעל על העצם ולהבין את הגירוי המושרה על ידי עומס של אוסטיאוציטים.

מחקר זה מרחיב את השיטות לפיתוח מודלים תלת-ממדיים של אוסטיאוציטים בודדים באמצעות תמונות מיקרוסקופ קונפוקלי של רשת Lacunar-Canalicular Network (LCN) לביצוע ניתוח CFD תוך שימוש בתוכנות מידול חישוביות שונות. לפני מיקרוסקופיה קונפוקלית, עצמות העכבר חתוכות ומוכתמות בצבע פלואורסצאין איזותיוציאנט (FITC) כדי לסמן את LCN. ברזולוציה של 100x, תמונות Z-stack נאספות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי ומיובאות לתוכנת MIMICS (תוכנת עיבוד מבוססת תמונה תלת-ממדית) כדי לבנות מודל פני שטח של תהליכי LCN ואוסטאוציטים-דנדריטים.

לאחר מכן משטחים אלה מופחתים באמצעות פעולה בוליאנית בתוכנת 3-Matic (תוכנת אופטימיזציה לנתונים תלת-ממדית) כדי למדל את החלל הנוזלי הלאקונרי סביב גוף התא האוסטיאוציטי ואת החלל הקנליקולרי סביב הדנדריטים המכילים נוזל לאקונוקנליקולרי. גיאומטריית נוזל נפחי תלת מימדית מיובאת לתוכנת ANSYS (תוכנת סימולציה) לניתוח CFD. ANSYS CFX (CFD תוכנה) משמשת להפעלת עומס פיזיולוגי על העצם כלחץ נוזלים, ונקבעים לחצים על האוסטיאוציטים והתהליכים הדנדריטיים. המורפולוגיה של LCN משפיעה על ערכי עקת הגזירה שחשים קרום התא האוסטיאוציטי ותהליכי התא. לכן, הפרטים על האופן שבו מודלים מבוססי תמונה קונפוקלית מפותחים יכולים להיות בעלי ערך בהבנת אוסטיאוציטים מכנוסנסציה ויכולים להניח את היסודות למחקרים עתידיים בתחום זה.

Introduction

אוסטיאוציטים מניחים לווסת את מסת העצם בתגובה לפעילות גופנית¹. עיוות ממברנה של אוסטיאוציטים והתהליכים הדנדריטיים שלהם עקב עומס מכני, חושף אותם ל- FFSS, אשר מזוהה על ידי האוסטיאוציטים ומפעיל איתות תוך תאי ^2,3,4. מיקרו-מבנה העצם עובר הידרדרות או שינויים במורפולוגיה הלאקונרית-קנאליקולרית שלו עקב הזדקנות או מחלות עצם כגון אוסטאופורוזיס וסוכרת ובמצבים כגון מחסור בפרלקן הגורם לפגיעה בתגובת מכנו של אוסטיאוציטים ^5,6. שינויים אלה בארכיטקטורת העצם גורמים לאוסטיאוציטים לחוות רמות שונות של FFSS וזנים ^7,8. חשוב לציין, FFSS שחווים אוסטיאוציטים בתגובה לעומס מכני קשה לכימות in vivo מכיוון שהם מוטמעים במטריצת העצם המסוידת.

מודלים מבוססי תמונה קונפוקלית היא טכניקה רבת עוצמה להתגבר על המגבלות של חקר אוסטיאוציטים בלתי נגישים בסביבתם הטבעית על ידי שכפול מודלים ממוחשבים של LCN ^9,10. עיבוד ומידול הרשת המחוברת של LCN בתלת-ממד היה מאתגר. קיימות מספר טכניקות הדמיה, כגון מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת (TEM), מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM), חתך פנים של בלוקים טוריים ומיקרוסקופ אלקטרונים לסריקת קרן יונים ממוקדת טורית (FIB/SEM)^2,11,12. טכניקה רבת ערך פותחה כדי לדמיין עצם 13,14,15 וליצור מודלים תלת ממדיים של אוסטיאוציטים באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי (CLSM). CLSM נבחרה כאן למידול חישובי ולא לטכניקות הדמיה אחרות בשל יכולתה לצלם את כל נפח הלקונה ואת רוב הקנליקולי בתלת מימד^16,17. ניתן ליצור את גאומטריית LCN באמצעות CLSM עבור ניתוח אלמנטים סופיים של אוסטיאוציטים (FEA) לחיזוי זני עצם. עם זאת, ניתוח נוזלים כדי לחזות FFSS שחווים אוסטיאוציטים הוא מסובך יותר מכיוון שהוא דורש מידול של קרום התא של האוסטיאוציטים והדנדריטים שלו בתוך LCN כדי לאפשר מידול של החלל הלאקונרי-קנליקולרי הצר, שבו הנוזל הבין-תאי נע סביב¹⁸.

בפרוטוקול זה, צבע פלואורסצאין איזותיוציאנט (FITC) מוחל על חלקי עצם עבים לא מסוידים לפני מיקרוסקופ קונפוקלי כדי לתייג את LCN בתוך העצם, וממברנות אוסטיאוציטים-דנדריטיות מודלות על סמך נתוני הדמיה מה-LCN. המרחב הלאקונרי-קנליקולרי מדומה באמצעות מודלים חישוביים, ועומס פיזיולוגי כתוצאה מפעילות גופנית ממודל באמצעות גישת CFD. האוסטיאוציטים נתונים לשיפוע לחץ נוזל בתוכנת CFD כדי לנתח את פרופיל הנוזל בתוך ה- LCN ולמדוד FFSS על האוסטיאוציטים והקרומים הדנדריטיים. יתר על כן, גישת FEA יכולה למדוד זנים או לחצים של אוסטיאוציטים על ידי הפעלת עומס מכני דחוס.

טכניקת שינוי גיאומטריה פותחה גם כדי לשנות את המיקרו-מבנים הנגזרים מתמונות של עצם צעירה ובריאה על מנת לדמות את המורפולוגיה הלאקונרית-קנאליקולרית שהשתנתה בבעלי חיים זקנים או באלה עם מחלות עצם. שינויים במיקרו-מבנה העצם כללו הפחתת מספר הקנליקולי עם ההזדקנות, הקטנת שטח החלל הלאקונרי-קנליקולרי כדי למדל מה קורה במחסור בפרלקן והגדלתו להשפעות הזדקנות מודל, והקטנת שטח הדופן הקנליקולרית והדנדריטית למודל עצם סוכרתית ^5,6. טכניקת שינוי הגיאומטריה מאפשרת לנו להשוות FFSS שחווים אוסטיאוציטים בעצמות עם מיקרו-מבנים שונים, כגון צעירים לעומת זקנים או עצמות בבעלי חיים בריאים לעומת חולים.

באופן כללי, מידול מבוסס תמונה קונפוקלית הוא כלי רב ערך להדמיית המורפולוגיה של אוסטיאוציטים בעצמות בריאות, כמו גם בשינויים הקשורים להזדקנות / מחלות במורפולוגיה של אוסטיאוציטים. יתר על כן, פרמטרים מורפולוגיים של אוסטיאוציטים, כגון שטח הפנים ונפח החלל הלאקונרי-קנאליקולרי, ניתנים למדידה ולהשוואה בעצמות שונות כדי לחזות תגובות תאיות למתח מכני.

Protocol

ניסויים בבעלי חיים בוצעו באישור הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת מיזורי, קנזס סיטי (UMKC), ותאמו את ההנחיות הפדרליות הרלוונטיות.

1. תהליך הכנת העצם

1. אספו את עצם הירך מעכברות C57BL6 בנות 4 חודשים ו-22 חודשים וקיבעו אותן בפרפורמלדהיד קר 4% ב-PBS למשך 24 שעות ב-4°C עם נדנוד עדין, ואז שטפו אותן ב-PBS ואחסנו אותן באתנול 70% לפני ההטבעה.
   הערה: נפח קיבוע צריך להיות בערך פי 20 מנפח הרקמה
2. יש להטמיע עצמות במהירות באקריליק מתפלמר מהיר (טבלת חומרים) בהתאם להוראות היצרן.
   הערה: חשוב להשתמש בשרף פילמור מהיר לשלב זה (~ 10 דקות). המטרה היא לתמוך ברקמת העצם במהלך החתך באמצעות מסור היהלום, אך מבלי שהשרף יחדור לתוך ה- LCN, מה שיחסום את כתם ה- FITC מלחדור פנימה.
3. חתכו פרוסות רוחביות עבות בעובי 300 מיקרומטר מאתר סטנדרטי מעל הטרוכנטר השלישי באמצעות מסור יהלום ואחסנו אותן בטמפרטורה של 4°C באתנול 70% לפני צביעת FITC.
4. לטש את החלקים באמצעות 600, 800, ולאחר מכן 1200 grit נייר זכוכית לעובי סופי של ~ 90-100 מיקרומטר.
   הערה: השגת עובי מתאים הובטחה באמצעות קליפר דיגיטלי.
5. שטפו את החלקים באתנול 70%, 95% ו-100% במשך 5 דקות כל אחד.
6. הכתימו אותם ב-1% FITC ב-100% אתנול למשך 4 שעות בטמפרטורת החדר (RT) בחושך עם רעד מתון.
7. שטפו את החלקים באתנול 100% במשך 30 דקות עם רעד עדין בחושך. לאחר מכן, יבשו אותם באוויר למשך הלילה בחושך.
8. כדי להרכיב, מקם את החלק בטיפת מדיה להרכבה על שקופית מיקרוסקופ זכוכית. השתמש במלקחיים כדי למקם את החלק שטוח ככל האפשר כנגד המגלשה, הימנע מיצירת בועות אוויר ושימוש בשרף שמסביב כדי לתפעל את הדגימה. הרכיבו תלוש כיסוי על הדגימה.

2. מיקרוסקופ קונפוקלי

1. השתמש במיקרוסקופ קונפוקלי להדמיית פרוסות עצם מוכתמות ב- FITC.
2. השתמש במטרה של שמן 100x 1.44NA עם זום דיגיטלי של 1.7 וגודל צעד של 0.126 מיקרומטר כדי לאסוף ערימות Z מפורטות של 400 מישורי Z ברזולוציה של 1024 x 1024 פיקסלים, רזולוציה של 0.089 מיקרומטר.
3. השתמש בלייזר 488 ננומטר לעירור, עם חלון איסוף פליטה של 496-596 ננומטר. אסוף את אוספי התמונות באמצעות הגדרות פיצוי כדי לתקן אובדן אות עם הגדלת עומק ההדמיה.
4. הגדל את הדיוק והרזולוציה של התמונות באמצעות טכניקות איסוף תמונות, כגון דגימת יתר והגדלת ממוצע הקו. כמו כן, אספו את התמונות ברזולוציה של 5x, 20x ו-100x של מקטעים רוחביים של מקטעי עצם הירך כפי שמוצג באיור 1.
   הערה: התמונה ברזולוציה נמוכה (5x) באיור 1 מציגה את אזור החתך המלא של עצם הירך, עם שלושה אזורים שנבחרו עבור שדות הדמיה של 100x.
5. השתמש 100x Z-stacks עבור מודלים המחשב של אוסטיאוציטים.

3. דוגמנות מחשב

1. ייבא את תמונות 100x שנאספו, בפורמט TIFF, לתוכנת ImageJ כדי לבנות רצף של תמונות של LCN בכיוון Z.
2. ייבא את ערימות Z לתוכנת עיבוד תמונה תלת-ממדית כדי לבנות מסיכה של LCN לאחר הגדרת כיוון התמונה.
3. סף התמונה המקורית של העכברים הצעירים והמבוגרים בין 30,012-45,677 יחידות Hounsfield ו 15,000-46,701 יחידות Hounsfield, בהתאמה, כדי להיות דומה מאוד LCN. התאימו את 'סף' בתפריט המקטעים כדי לשנות את מגבלות עוצמת הפיקסלים לצורך הכללה במסיכה.
4. חתוך לאקונה אחת עם הקנליקולי שלה כאזור העניין (ROI) מהערימה באמצעות הפעולה מסיכת חיתוך . הגדירו את החזר ההשקעה כך שיקיף את הלקונה במרכז הקובייה, וכל הקנליקולי המחובר אליה יתרחב לדפנות הקובייה. עטפו את הלקונה בקובייה דמיונית גדולה יותר עם אורכי צד של 21 מיקרומטר, 14 מיקרומטר ו-19 מיקרומטר.
5. מכיוון שהמודל נוצר ממספר חלקים, בצע פעולת הגדלת אזור כדי לבחור את אזורי הפיקסלים המחוברים, להסיר רעש ולהסיר כתמים כדי ליצור LCN אחיד.
6. המר את המסיכה הלאקונרית-קנאליקולרית לאובייקט באמצעות הפעולה 'חלק מחושב' בתוכנת העיבוד מבוססת התמונה התלת-ממדית.
7. בנה את האוסטיאוציטים ואת הממברנות הדנדריטיות על ידי הפחתת נפח LCN באמצעות פעולת החלקה. בצע פעולה זו מספר פעמים כדי להשיג עובי חלל לאקונרי ותעלות של 0.75 מיקרומטר ו 0.08 מיקרומטר, בהתאמה ^9,18.
8. יצא את האובייקטים (תבנית STL) כשלב האחרון בתוכנת עיבוד מבוססת תמונה תלת-ממדית.
9. ייבא שתי שכבות של הממברנות LCN ואוסטאוציטים-דנדריטים לתוכנת אופטימיזציית הנתונים התלת-ממדית כדי ליצור רשת נפח.
10. השתמש בכלי אשף התיקון בתוכנה כדי לזהות בעיות רשת בכל חלק. בדוק את איכות רשת השינוי במקטע האבחון של אשף התיקון לאחר כל פעולה.
11. הסר את החלקים הרגילים ההפוכים, המשולשים המצטלבים וקווי המתאר הפגומים באמצעות פעולת התיקון האוטומטי באשף התיקון.
12. החלף את המשולשים החופפים באופן ידני על-ידי הגדרת משולשים חדשים או באופן אוטומטי באמצעות הפעולה Fill Hole Normal .
13. שפרו את איכות רשת השינוי באמצעות פעולות הכוללות סינון משולשים חדים, קצוות קטנים וקליפות קטנות.
14. לאחר שיפור איכות הרשת, יש לשלב שני משטחים של ממברנות LCN ואוסטאוציטים-דנדריטים למשטח אחד (חלל נוזלי לאקונרי-קנליקולרי) השייך לשני החלקים באמצעות מכלול ללא סעפת.
15. צור מודל נפחי של המרחב הלאקונרי-קנליקולרי באמצעות פעולת Remesh ולאחר מכן יצא אותו כקובץ STL. התאם את קנה המידה של האובייקטים כך שיהיה במיקרומטרים במקטע הייצוא.

4. טכניקת שינוי גיאומטריה בתוכנת עיבוד מבוססת תמונה תלת ממדית ובתוכנת אופטימיזציה לנתונים תלת ממדית

הערה: טכניקת שינוי הגיאומטריה משמשת למדל שינויים במורפולוגיה של אוסטיאוציטים, כגון צפיפות וקוטר של תעלה ועובי לאקונר-קנליקולרי עקב הזדקנות או מחלת עצמות.

1. בחר את האוסטיאוציטים הצעירים כמודל הבסיס ושנה אותו כדי לבנות מודלים אוסטיאוציטים מובחנים אחרים על ידי החלת שינויים מורפולוגיים.
2. צור מודל אוסטיאוציטים עם צפיפויות קנאליקולריות שונות ממודל הבסיס על ידי שינוי סף התמונה בתוכנת עיבוד מבוססת תמונה תלת-ממדית.
   1. בחרו סף נמוך יותר כדי להפחית את עוצמת האור של התמונה ולקבל לאקונה עם פחות קנאליקולי. היתרון של טכניקת הסף הוא שצורת הלקונה וגודלה נשארים זהים, ורק השפעת צפיפות התעלה נלמדת. איור 2 מראה את מודל הגיל המדומה שנוצר מהאוסטיאוציטים הצעירים באמצעות טכניקת שינוי הגיאומטריה.
3. פיתוח מודלים של אוסטיאוציטים עם עובי חלל לאקונרי-קנליקולרי שונה או קוטר דנדריט/תעלה בתוכנת עיבוד מבוססת תמונה תלת-ממדית ובתוכנת אופטימיזציה לנתונים תלת-ממדיים. בנה מודלים גדולים או קטנים יותר של אוסטיאוציטים על-ידי פעולות עטיפה או החלקה , בהתאמה. איור 3 מראה שישה מודלים של אוסטיאוציטים עם שינוי בגיאומטריה שפותחה מהאוסטיאוציטים הצעירים.

5. ניתוח CFD

הערה: לאחר יצירת המודלים של אוסטיאוציטים נפחיים, מתבצעים מספר שלבים, כולל גיאומטריה, רשת והתקנה, במודול CFX של תוכנת הסימולציה.

1. צור זרימה זורמת בתוכנת הסימולציה כדי להכין את המודלים לניתוח CFD.
2. ייבא את הגיאומטריות מבוססות התמונה הקונפוקלית שפותחו לאזור הגיאומטריה של CFX, המכונה ANSYS SpaceClaim (כלי מידול תלת-ממדי). הגדר את מידות היחידה לננומטרים בהגדרה.
3. גאומטריה מופיעה כשני היבטים של תהליך LCN ותהליכים אוסטיאוציטים-דנדריטיים. לחץ על פאה בתפריט העליון והסר את השגיאות הגיאומטריות כגון הצטלבויות, קצוות חדים או מחוברים יתר על המידה, וקודקודים, פתחים או חורים עבור כל פאה.
4. לחץ על חיסור בתפריט פאה כדי להפחית את הפאה הקטנה יותר ואת התהליכים הדנדריטיים של אוסטאוציטים מהפן הגדול יותר, LCN, כדי להשיג גוף יחיד של מרחב לאקונרי-קנליקולרי. לאחר מכן, לחץ לחיצה ימנית על הפאה שנוצרה והמיר אותה מפאות לתחום מוצק מבלי למזג פרצופים. איור 4 מתאר את אזור החתך של מודל האוסטיאוציטים הצעירים, המייצג את החלל הלאקונרי-קנליקולרי.
5. לחץ על רשת שינוי ובחר אלמנטים טטרהדרליים ליניאריים באמצעות גודל אלמנט של 0.06 מיקרומטר. עדכנו את הרשת באמצעות מחקר התכנסות רשת כדי שיהיו מספיק אלמנטים במערכת הדנדריטית הזעירה כדי להבטיח שהתוצאות יהיו בלתי תלויות בגודל הרשת.
6. בחר את פני השטח ובחר את canaliculi בצד העליון של הקובייה הדמיונית כמו פתחי נוזל. בחרו את canaliculi בחמשת הפאות האחרות כשקעי נוזל באמצעות Box select.
7. יצא את רשת השינוי (תבנית קובץ שוטפת) כשהיא נטענת מהר יותר בהגדרה בשלב הבא.
8. צור Fluid Flow נוסף בתוכנת הסימולציה וייבא את הרשת השוטפת לאזור ההתקנה של CFX. הגדר שני תנאי גבול של כניסות ושקעים למשטחים שנבחרו מראש ככניסות/שקעים בעזרת האפשרות 'הוסף גבול '.
9. כדי לחקות תנאים פיזיולוגיים, הפעילו לחץ כניסת נוזל של 300 Pa ו- 0 Pa על הכניסות והשקעים, בהתאמה^19,20. התייחסו למשטחים הנותרים כאל קירות עם מצב ללא החלקה באותו נוזל שיש לו מהירות אפס בממשק של קירות. נוזל זורם מהפתחים סביב הדנדריטים וגוף התא האוסטיאוציטים ויוצא מהקנליקולי האחרים שהוקצו כשקעים.
10. התייחסו לנוזל הלמינרי הבין-תאי כאל מים⁹, שנבחרו מספריית החומרים. הגדר את המקטעים העברת חום, בעירה וקרינה תרמית לללא, מכיוון שלא מוגדרת העברת חום בבעיה. בחר את מצב Turbulence כמאפיין הנוזל ב- LCN, שהוא נוזל למינרי⁹.
11. הפעל את התוכנה באמצעות דיוק כפול והתחלה ישירה כסוג השליחה. עקוב אחר המסה והתנע עד שהשאריות יורדות והופכות קבועות. לאחר התכנסות הפתרון, מדוד נתוני FFSS באמצעות מקטע CFD-post של תוכנת CFD.

6. עיבוד פוסט CFD

1. כדי לתאר FFSS שחוו אוסטיאוציטים והדנדריטים שלהם, הכנס קווי מתאר חדשים בסעיף התוצאות של תוכנת CFD. צור מתאר FFSS על ידי בחירת גזירת הקיר על קרומי אוסטאוציטים-דנדריטים כמשתנה בתחום.
   הערה: כדי להציג טוב יותר FFSS גבוה בממברנות דנדריטיות, טווח ה- FFSS מוגדר כ - User Specified כדי לשנות ערכי מינימום/מקסימום של FFSS.
2. הוספת קו מתאר מייעל של מהירות בתוך התחום הלאקונרי-קנליקולרי החל מהמפרצונים. הגדר את הדגימה למרווח שווה ובחר את מספר הנקודות כ- 2500. קטע אנימציה בתוכנת CFD מציג במדויק בתלת מימד כיצד חלקיקי הנוזל זורמים בתוך המרחבים הלאקונריים-קנאליקולריים באמצעות גרף קו הזרימה של המהירות.
3. השתמש בכלי מחשבון הפונקציות בתוכנת CFD לניתוח גודל FFSS או מהירות בהתבסס על פרמטרים גיאומטריים, במיוחד כאשר ישנם מודלים שונים של אוסטיאוציטים (כלומר, צעירים לעומת זקנים). מדוד את הנפח ואת שטח הפנים של המרחב הלאקונרי-קנליקולרי כפרמטרים גיאומטריים יחד עם ערכי FFSS מרביים, מינימליים או ממוצעים.

תוצאות

פרוטוקול זה מתאר כיצד לפתח מודלים של אוסטיאוציטים שמקורם בקונפוקליים כדי לחקור את כמות זרימת הנוזלים, לחץ הגזירה שאוסטיאוציטים והתהליכים הדנדריטיים שלו נתונים לו עקב עומס מכני. עכבר C57BL6 זקן ועכבר צעיר נבחרו לבנות מודלים אוסטיאוציטים מבוססי תמונה קונפוקלית צעירה ומבוג...

Discussion

פרוטוקול זה מתאר טכניקת הדמיה קונפוקלית להדמיה ומידול חישובי של האוסטיאוציטים. לפני הדמיה קונפוקלית מתבצע תהליך הכנת העצם לחתך והכתמת דגימות עצם. תמונות קונפוקליות בהגדלה של פי 100 מיובאות לתוכנות שונות כדי לפתח מודלים ממוחשבים של אוסטיאוציטים והמרחב הלאקונרי-קנליקולר...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,200 Grit sandpaper	Buehler	30-5170-012-100
3-Matic software	Materialise	https://www.materialise.com/en/industrial/software/3-matic	3D data optimization software
600 grit sandpaper	Buehler	30-5118-600-100
800 Grit sandpaper	Buehler	30-5170-800-100
ANSYS software	ANSYS	https://www.ansys.com/	simulation software
Fluorescein Isothiocyanate (FITC)	Sigma-Aldrich	F7250
ImageJ software		https://imagej.net/ij/
Immersion Oil for Microscopes	Leica Microsystems	195371-10-9
Leica TCS Sp5 II confocal microscope	Leica Microsystems	TCS Sp5 II
Leitz 1600 inner hole diamond saw	Leica
MIMICS Innovation Suite software	Materialise	https://www.materialise.com/en/healthcare/mimics-innovation-suite	3D image-based processing software
Permount mount medium	Fisher scientific	SP15-500
Sampl-Kwick Fast Cure Acrylic Kit	Buehler	20-3560
Single Platform Laboratory Shaker	Reliable scientific INC	Model 55S