JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול זה מספק אסטרטגיה משולבת של שני צמחי מרפא לטיפול בתאי PC12 פגועים. הפרוטוקול מספק סימוכין לאופטימיזציה של מצב היישום הטוב ביותר של הרפואה הסינית המסורתית (TCM).

Abstract

לאור יתרונות השילוב של הרפואה הסינית המסורתית (TCM) בטיפול באיסכמיה מוחית, חקרנו את ההבדלים ביעילות ובמנגנון בין שילוב התכשיר לשילוב הרכיבים על מנת לבחון את אסטרטגיית שילוב שני צמחי המרפא לטיפול בתאי PC12 פגועים. קובלט כלוריד (CoCl2) בשילוב עם מדיום נטול גלוקוז שימש כדי לגרום נזק חמצוני של תאי PC12. לאחר מכן, השילוב האופטימלי של הזרקת Astragalus mongholicus (Ast) והזרקת Erigeron breviscapus (Eri) נבחר ושולב בשיטות עיצוב אחידות לאחר סינון הריכוז הבטוח והיעיל שלהם על תאי PC12. יתר על כן, שילוב הרכיבים שנבדק כולל 10 מיקרומטר אסטרגלוסיד A, 40 מיקרומטר סקוטלרין, ו 75 מיקרומטר חומצה כלורוגנית בשני עשבי תיבול. לאחר מכן, MTT, Annexin V-FITC/PI, immunofluorescence, וניתוח כתמים מערביים שימשו להערכת היעילות והמנגנון של שילוב ההכנה ושילוב הרכיבים על תאי PC12 פגועים. התוצאות הראו כי שילוב ההכנה האופטימלי להישרדות תאים היה הזרקת Ast וקפסולה Eri עם ריכוז של 6:1.8 (μM). שילוב הרכיבים (10 מיקרומטר אסטרגלוסיד A, 40 מיקרומטר סקוטלרין ו-75 מיקרומטר חומצה כלורוגנית) היה יעיל יותר משילוב ההכנה. שני הצירופים הפחיתו במידה ניכרת את קצב האפופטוטי, את עוצמת הפלואורסצנטיות של קספאז-3 ואת רמת החמצן הריאקטיבי התוך-תאי (ROS); בינתיים, הם שיפרו את רמות הביטוי של p-Akt/Akt, Bcl-2/Bax ו-Nrf2. השפעות אלה ניכרו יותר בשילוב הרכיבים. לסיכום, שני השילובים יכולים לעכב את הפגיעה הנגרמת על ידי CoCl2 בשילוב עם תווך ללא גלוקוז על תאי PC12, ובכך לקדם את הישרדות התא. עם זאת, היעילות של שילוב הרכיבים על פני שילוב ההכנה עשויה לנבוע מהוויסות החזק יותר של מסלול האיתות PI3K/Akt/Nrf2 הקשור לעקה חמצונית ואפופטוזיס.

Introduction

איסכמיה מוחית כרונית, הנגרמת על ידי היפופרפוזיה מוחית, היא מחלה שכיחה בקרב אנשים בגיל העמידה וקשישים1. כמחלת איסכמיה סמויה ארוכת טווח, היא עלולה להוביל לתפקוד נוירולוגי מתקדם או מתמשך. המנגנונים הפתולוגיים העיקריים כוללים אפופטוזיס של תאים ונזק חמצוני, המוביל לתפקוד נוירולוגי מתקדם או מתמשך; זהו הבסיס הפתולוגי של מחלת אלצהיימר, דמנציה וסקולרית ומחלות אחרות, ומשפיע קשות על איכות החיים של החולים. עם זאת, עדיין חסרות תרופות אידיאליות ברפואה המודרנית לטיפול באיסכמיה מוחית כרונית2. במקביל, השילוב של Astragalus mongholicus (Ast) ו- Erigeron breviscapus (Eri) נמצא בשימוש נרחב בפרקטיקה הקלינית של הרפואה הסינית המסורתית (TCM)4. האסטרטגיה המשולבת השתפרה להפליא בקידום התאוששות תפקוד העצבים לאחר איסכמיה מוחית, שהיא טובה יותר מזו של תרופה בודדת; עם זאת, ישנם הבדלים גדולים ביחס המינון בשילוב של שתי התרופות4. המרכיבים היעילים ומנגנון הפעולה אינם מוגדרים היטב, וזהו נושא המפתח המגביל את היישום הקליני שלה.

מחקרים קודמים הדגימו את ההשפעה הסינרגיסטית של שילוב ההכנה של הזרקת Ast והזרקת Eri בטיפול באיסכמיה מוחית בחולדות. זה יכול לווסת את הביטוי של חלבון p-Akt ולהפחית את הביטוי של Bcl-2 הקשורים למוות מקדמי מוות (BAD) חלבון5,6, שהוא אחד ממשפחת B-לימפובלסטומה 2 (Bcl-2) חלבונים ויש לו השפעה של קידום אפופטוזיס. עם זאת, הבסיס החומרי והמנגנון של השפעתה הסינרגטית אינם ברורים. יתר על כן, מודל הפציעה של תאי PC12 הוקם עם CoCl2 משולב תווך ללא גלוקוז, ושילוב הרכיבים האופטימלי ב- Ast ו- Eri נבדק והוגדר7.

במחקר זה, המינונים היעילים של Ast ו- Eri נבדקים באמצעות מודל תאי PC12 הפגוע. השילוב האופטימלי של שתי התרופות נבדק באמצעות מודל זה בשילוב עם שיטת התכנון ההומוגנית. מודל התא משמש להערכה נוספת של ההבדל בהשפעות ובמנגנונים של שילוב ההכנה ושילוב הרכיבים בתאי PC12 פגועים. אסטרטגיה זו שואפת לחקור את אפקט ההגנה ואת מנגנון הבקרה של שני סוגי הצירופים על תאי PC12 פגועים באמצעות מסלול האות PI3K/Akt/Nrf2 כדי לקבוע את מצב השילוב הטוב ביותר. מחקר זה מספק התייחסות למיטוב מצב היישום הטוב ביותר של TCM.

Protocol

1. הכנת מגיב

  1. הכן את המדיום המלא על ידי הוספת 90 מ"ל של DMEM מדיום סוכר גבוה, 10 מ"ל של סרום בקר עוברי (FBS), ו 1 מ"ל של תמיסת פניצילין-סטרפטומיצין בבקבוק תרבית סטרילית 125 מ"ל. יש לערבב את המדיום המלא ולאחסן בטמפרטורה של 4°C בתנאים סגורים.
  2. הכן תמיסת CoCl 2 על ידי הוספת 0.02 גרם אבקת CoCl2 (במשקל מדויק) ב-10 מ"ל של DMEM ללא סוכר (מומס לחלוטין) לקבלת תמיסת מלאי של 8.4 מילימול. סנן את התמיסה עם מסנן חיידקים בגודל 0.22 מיקרומטר, אטם אותה ואחסן אותה במרחק של 4°C מאור.
    הערה: CoCl2 אינו יציב ויש לאחסן אותו במיכל אטום, מוגן מפני אור; תקופת התוקף של פתרון CoCl2 היא 7 ימים.
  3. הכינו תמיסת מלח חוצצת Tris-Hcl (TBST).
    1. שקול במדויק 8 גרם נתרן כלורי, 0.2 גרם אשלגן כלורי, ו 3 גרם של בסיס טריס. הוסיפו אותם לכוס של 1 ליטר, ולאחר מכן הוסיפו 1,000 מ"ל של מי RO כדי להמיס את התערובת.
    2. התאם את ה- pH ל- 7.4, הוסף 1 מ"ל של Tween 20, וערבב היטב כדי להשיג את פתרון TBST.
      הערה: Tween 20 פועל כחומר פעילי שטח כדי להפחית את הקישור הלא ספציפי של נוגדנים לאנטיגנים ועובד הכי טוב בריכוז של 0.1%.
  4. הכן תמיסת MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) על ידי שקילת 0.1 גרם אבקת MTT בתמיסת PBS של 20 מ"ל כדי לקבל תמיסת מלאי של 5 מ"ג/מ"ל. סננו את התמיסה באמצעות מסנן חיידקים בגודל 0.22 מיקרומטר, אטמו אותה ואחסנו אותה במרחק של 4°C מאור, כשהיא במצב המתנה.
    הערה: אבקת MTT אינה יציבה וסופגת לחות בקלות, לכן יש לאחסן אותה במקום סגור ויבש, הרחק מאור. פג תוקפו של פתרון MTT לאחר 7 ימים. ל-MTT יש השפעה מסרטנת, לכן יש להימנע ממגע ישיר עם העור.
  5. הכן את תמיסת הקפסולה Eri על ידי הסרת מעטפת הקפסולה ומשקל מדויק של 0.18 גרם מהתוכן ב 10 מ"ל של מדיום DMEM ללא סוכר כדי להכין תמיסת מלאי 100 מיקרומטר (מבוסס על ריכוז scutellarin). סננו את התמיסה עם מסנן חיידקים בגודל 0.2 מיקרומטר, אטמו אותה ואחסנו אותה במיכל אטום בטמפרטורה של 4°C.
    הערה: Scutellarin הוא המרכיב הפעיל העיקרי של Erigeron breviscapus. ריכוז scutellarin בכמוסות נקבע על ידי HPLC-UV להיות 2.56 מ"ג / גרם, כלומר, 5.54 μmol / גרם8. ריכוז התכשיר מחושב על בסיס ריכוז scutellarin. זה נוח להערכת הפעילות הפרמקולוגית של התכשיר והרכיב.
  6. הכן את הפתרון של הזרקת Ast על ידי הוספת 5 מ"ל הזרקה ו 5 מ"ל של מדיה DMEM ללא סוכר בצינור צנטריפוגה סטרילית 15 מ"ל להכנת תמיסת מלאי 60 מיקרומטר (מבוסס על ריכוז אסטרגלוסיד A). סננו את התמיסה דרך מסנן חיידקים בגודל 0.2 מיקרומטר, ואחסנו אותה במיכל אטום בטמפרטורה של 4°C.
    הערה: נפח ההזרקה הוא 10 מ"ל כל אחד, וריכוז אסטרגלוסיד A בזריקה נקבע על ידי HPLC-ELSD להיות 0.094 מ"ג/מ"ל (כלומר, 120 מיקרומטר)9. ההכנה צריכה להתבצע בארון בטיחות ביולוגית ולפעול באופן חסין אור לכל אורכו. יש למדוד במדויק את נפח תמיסת ההזרקה והמדיום ללא סוכר ולערבב היטב.
  7. הכינו תמיסה של אסטרגלוסיד A על ידי שקילה מדויקת של 7.85 מ"ג של אסטרגלוסיד A סטנדרטי והמסתו לחלוטין ב-2 מ"ל של דימתיל סולפוקסיד (DMSO) להכנת תמיסת מלאי של 5,000 מיקרומטר. סנן אותו עם מסנן חיידקים 0.22 מיקרומטר ואחסן אותו אטום ב 4 ° C.
    הערה: אבקת Astragaloside A אינה מסיסה בתווך ללא סוכר. בעת הכנת התמיסה, יש להמיס אותה עם הכמות המתאימה של DMSO כדי לשמור על ריכוז הניסוי הסופי של DMSO מתחת ל-0.1% כדי להבטיח שאין ציטוטוקסיות.
  8. הכינו את תמיסת הסקוטלרין על ידי שקילת 11.56 מ"ג של סקוטלרין סטנדרטי באופן מדויק וממיס אותה לחלוטין עם 5 מ"ל של מדיום DMEM ללא סוכר להכנת תמיסת מלאי של 5,000 מיקרומטר. סנן אותו עם מסנן חיידקים 0.22 מיקרומטר ואחסן אותו אטום ב 4 ° C.
  9. הכן את תמיסת החומצה הכלורוגנית על ידי שקילת 8.86 מ"ג של חומצה כלורוגנית סטנדרטית באופן מדויק וממיס אותה לחלוטין עם 5 מ"ל של מדיום DMEM ללא סוכר כדי להכין תמיסת מלאי של 5,000 מיקרומטר. סנן אותו עם מסנן חיידקים 0.22 מיקרומטר ואחסן אותו אטום ב 4 ° C.
    הערה: אבקת חומצה כלורוגנית אינה יציבה ונספגת מים בקלות. זה צריך להיות אטום ומאוחסן ב 4 °C הרחק מאור; יש למזער את זמן החשיפה במהלך השקילה.

2. בדיקת כדאיות התא

  1. להשיג תאי PC12 ולגדל אותם בתרבית DMEM בתוספת 10% FBS, 100 U / מ"ל של פניצילין, ו 100 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין.
    הערה: במחקר זה, התאים מתקבלים מהאקדמיה הסינית למדעים. תאי PC12 הם תאים דבקים בעלי המאפיינים הכלליים של תאים נוירואנדוקריניים ונמצאים בשימוש נרחב בנוירופיזיולוגיה ובנוירופרמקולוגיה.
  2. תרבית את התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור בתוספת 5%CO2 ותת-תרבית אותם כל 2-3 ימים. השתמש בתאים במעברים 4-8 לכל הניסויים.
  3. תרבית תאים
    1. יש לטפל בתאי PC12 בשלב הגידול הלוגריתמי (70%-80% מפגש תאים) עם 1 מ"ל טריפסין (0.25%) ולהתבונן בתאים תחת מיקרוסקופ. כאשר התאים הופכים עגולים, לעצור את העיכול טריפסין על ידי הוספת 3 מ"ל של המדיום המלא.
    2. מעבירים את התאים לצינור צנטריפוגה סטרילי של 15 מ"ל וצנטריפוגה את התאים ב 840 x גרם למשך 5 דקות. השליכו את הסופרנטנט, השהו מחדש עם המדיום המלא, והעבירו את תרחיף התא לצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל. לאחר מכן ספור את מספר התאים באמצעות ציטומטר זרימה.
      1. הפעל את תוכנת ציטומטריית הזרימה, בחר את מכפילת הדילול המתאימה של תמיסת התא בהגדרת הספירה ולחץ על תרשים צפיפות לאחר טעינת דגימת התא מצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל.
      2. הקף את אוכלוסיית התאים הרחק מציר X ומציר Y, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על טבלת הנתונים מתחת לאיור ובחר X, Y, Count ו- ABS Count. הנתונים תחת Abs Count בטבלת הנתונים מספקים את תוצאת ספירת התאים.
    3. התאימו את ריכוז התאים ל-1 x 10 5 תאים/מ"ל, חסנו 100 μL/well בצלחות של 96 בארות, ותרבו בטמפרטורה של 37°Cו-5 % CO2 באינקובטור למשך 24 שעות.
  4. בדיקת ריכוזים בטוחים של שתי תרופות בתאי PC12 תקינים
    1. תרבית את התאים כמתואר בשלבים 2.1-2.2. השליכו את הסופרנטנט, וטפלו בתאים הנורמליים עם ריכוזים סופיים שונים של הזרקת Ast (4, 8, 12, 16, 20 ו-24 מיקרומטר) וקפסולת Eri (0.625, 1.25, 2.5, 5, 10 ו-20 מיקרומטר). טפל בשש בארות משוכפלות של כל קבוצה במשך 24 שעות.
      הערה: התרופות מתווספות למדיה כדי להשיג את הריכוז הסופי של התרופה (המוזכר בשלב 2.4.1), ולאחר מכן נפח שווה של מדיה מתווסף לכל באר. כאשר שואפים את supernatant, קצה פיפטה צריך להיות ממוקם בעדינות על קיר הבאר כדי למנוע מגע עם התאים בתחתית הבאר. בעת הוספת פתרונות שונים, להוסיף אותם בעדינות ובמהירות לאורך שולי הבארות, ולשים לב בעת שינוי ראש אקדח פיפטה כדי למנוע השפעה על תוצאות הניסוי.
    2. השליכו את הסופרנטנט, הוסיפו 120 מיקרוליטר של תמיסת MTT (1 מ"ג/מ"ל) לכל באר, ודגרו על התאים במשך 4 שעות ב-37°C.
    3. לאחר הדגירה, השליכו שוב את הסופרנאטנט והוסיפו 150 מיקרוליטר DMSO לכל באר. נערו את הצלחת במשך 10 דקות במהירות של 240 פעמים לדקה (מספר תנודות אופקיות לדקה) באמצעות מתנד מערבולת.
    4. מדוד את הספיגה של כל דגימה ב- 490 ננומטר באמצעות קורא מיקרו-לוחות. חישוב כדאיות התא (%), שהיא ספיגת הקבוצה המטופלת/ספיגה של נורמלי הקבוצה (ביקורת) x 100.
      הערה: ודא שפתרון MTT נמצא בתוך תקופת התוקף; אם הצבע השתנה (לירוק כהה), לא ניתן להשתמש בו. בעת בדיקת ספיגת תאים, יש להגדיר באר ריקה (מדיום תרבית ו- MTT, ללא תאים או תרופות) כדי למנוע את ההפרעה של ריאגנטים אחרים. נפח של 150 μL של DMSO מתווסף לכל באר ומנער במשך 10 דקות כדי להמיס את הגבישים הכחולים-סגולים טוב יותר. יש לזהות את הספיגה בהקדם האפשרי כדי להבטיח את דיוק התוצאות.
  5. בדיקת ריכוזים אפקטיביים של שתי תרופות על תאי PC12 פגועים
    1. תרבית את התאים במשך 24 שעות כפי שהוזכר בשלבים 2.1-2.2, להשליך את supernatant, ולאחר מכן לטפל בתאים עם 20 μL / באר של CoCl2 (0.4 mM) בשילוב עם המדיום ללא סוכר.
    2. יש לטפל בו זמנית בתאים עם 100 μL/well של הזרקת Ast (הריכוזים הסופיים הם 2, 6, 8, 10 ו-12 μM) או 100 μL של קפסולת Eri (הריכוזים הסופיים הם 1, 2, 3, 4 ו-5 μM) ב-37°C למשך 24 שעות נוספות. הוסף 120 μL/well של מדיום שלם לקבוצת הביקורת.
      הערה: CoCl2 גורם לתנאים היפוקסיים בתאים.
    3. למדוד את הספיגה של כל דגימה בשיטת MTT ולחשב את כדאיות התא כפי שתואר קודם לכן בשלבים 2.4.2 ו- 2.4.3.
  6. סינון השילוב האופטימלי של שתי תרופות על בסיס שיטת התכנון ההומוגנית
    הערה: לאחר השגת טווח הריכוז האפקטיבי של הזרקת אסטרגלוס וקפסולת breviscapus, שיטת העיצוב האחיד U 7 (7 4) טבלה שימש להשגת שישה שילובים שונים של שתי התרופות. הזרקת Ast:Eri capsule: 1) 2:2.6 μM, 2) 4:5 μM, 3) 6:1.8 μM, 4) 8:4.2 μM, 5) 10:1 μM, ו-6)12:3.4 μM.
    1. תרבית את התאים כמתואר לעיל בשלב 2.3.1, ותטפל בתאי PC12 הפגועים עם שישה ריכוזי פרופורציה של הזרקת Ast:Eri כמוסה כאמור לעיל.
    2. טפל בתאים במשך 24 שעות וחשב את כדאיות התא כפי שתואר קודם לכן בשלבים 2.4.2 ו- 2.4.3.
  7. הערכת ההשפעה המגנה של שני שילובים אופטימליים על תאי PC12 פצועים
    הערה: לאחר קבלת שילוב ההכנה האופטימלי (הזרקת Ast: כמוסה Eri של 6: 1.8 μM) ואת שילוב הרכיבים האופטימלי7 (10 מיקרומטר astragaloside A, 40 μM scutellarin, ו 75 μM חומצה כלורוגנית), הערכה נוספת מבוצעת כדי לבדוק את ההשפעות המגינות שלהם על תאי PC12 פצועים.
    1. תרבית את התאים כמתואר לעיל בשלב 2.3.1, וטפל בתאי PC12 הפגועים בשני סוגי שילובי התרופות כפי שנדון בהערה לעיל.
    2. טפל בתאים במשך 24 שעות וחשב את כדאיות התא כפי שתואר קודם לכן בשלבים 2.4.2 ו- 2.4.3.

3. בדיקת Annexin V-FITC/PI לשיעור אפופטוזיס

  1. זרעו את תאי PC12 בצלחת של 12 בארות בריכוז של 1.3 x 105 תאים / באר ותרביתו אותם ב 37 ° C במשך 24 שעות.
  2. קבץ את התאים: קבוצת ביקורת, קבוצת מודל ושני שילובים של תרופות. הוסף 1.2 מ"ל/באר של מדיום שלם לקבוצת הביקורת, הוסף 1.2 מ"ל/באר של מדיה המכילה 0.4 mM CoCl 2 לקבוצת הדגמים, והוסף 1.2 מ"ל/באר מכל אחד משני הצירופים המכילים 0.4 mM CoCl2. לדגור על התאים ב 37 ° C במשך 24 שעות נוספות.
  3. לאחר הטיפול התרופתי, יש לטפל בתאים עם 250 מיקרוליטר/באר טריפסין, להעביר את התאים בצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל, ובצנטריפוגה ב-840 xg למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT). השליכו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את הגלולה ב-500 מיקרוליטר של חיץ הקשירה.
    1. לדגור על התאים בחושך עם 5 μL של Annexin V-FITC ו 10 μL של יודיד פרופידיום (PI) במשך 15 דקות ב RT, ולאחר מכן לבדוק אפופטוזיס על ידי ציטומטריית זרימה. הגדר שלוש בארות משוכפלות בכל קבוצה.
      הערה: הטריפסין המשמש בבדיקה זו אינו יכול להכיל EDTA מכיוון ש- EDTA הוא חומר כלאט יונים מתכתי המתחרה עם נספחין V לקשירת יוני סידן ומשפיע על הזיקה של אנקסין ל- PI. כאשר אפופטוזיס מתרחש, פוספוסרין, במקור בצד הפנימי של קרום התא, פונה החוצה אל פני התא, ו Annexin V-FITC נקשר באופן סלקטיבי פוספוסרין מחוץ לממברנה כדי להראות פלואורסצנטיות ירוקה.
    2. לחץ על פיצוי אוטומטי בתפריט התחלה, בחר FITC , PE , PerCP ו- APC בערוץ בחר ובחר פיצוי ב: גובה. לחץ על אישור בפריט סטטיסטי: חציון. עם אותה שיטת ספירת תאים המוזכרת בשלב 2.3.2, אסוף את דגימות התא, לחץ על מפת הצפיפות והקף בעיגול את אוכלוסיית התאים האפקטיבית.
    3. עם פלואורסצנטיות FITC כפרמטר ציר X, ופרמטרים פלואורסצנטיים אחרים כפרמטר ציר Y, צור מפת צפיפות. לחץ על מטריצת פיצוי בתפריט התחלה ומקדם במטריצת הגלישה. מידע מפת הצפיפות מוצג לניתוח קצב האפופטוזיס.

4. זיהוי אימונופלואורסנציה של דור קספאז-3

  1. זרעו את תאי PC12 על כיסויים בצפיפות של 8 x 104 תאים/כיסויים והניחו אותם בצלחות של 24 בארות בטמפרטורה של 37°C למשך 24 שעות. קבץ את התאים כפי שהוזכר לעיל בשלב 3.2; הגדר שלוש כיסויים משוכפלים עבור כל קבוצה.
  2. לאחר טיפול תרופתי, שטפו את הכיסויים פעמיים עם PBS (37°C) במשך 5 דקות כל אחד, תקנו אותם עם 4% פרפורמאלדהיד למשך 15 דקות, וחדרו עם 0.5% Triton X-100 למשך 20 דקות ב-RT.
  3. שטפו שוב את התאים וחסמו אותם עם 10% סרום עיזים למשך שעה אחת ב-RT.
  4. יש לדגור על כל מכסה ב-200 מיקרוליטר של נוגדן ראשוני קספאז-3 (חלבון מפתח של אפופטוזיס) מדולל בריכוז של 1:250 ב-1x TBST, למשך הלילה ב-4°C. יש לשטוף עם 1x TBST (שלוש פעמים למשך 3 דקות כל אחת), ולדגור עם 200 μL של נוגדן משני (דילול 1:300 ב-1x TBST) למשך שעה אחת ב-RT בחושך.
    הערה: הפלואורסצנטיות מרוותה בקלות; לכן, לאחר הדגירה של הנוגדן המשני, שקופיות צריך להיות נשמר הרחק אור. הנוגדנים הראשוניים והמשניים צריכים להיות מאוחסנים במרחק של 4 מעלות צלזיוס מהאור.
  5. הוסף 300 μL של DAPI (0.5 מיקרוגרם / מ"ל) לכיסויים (כדי לזהות את הגרעינים) למשך 10 דקות ושטוף את התאים שלוש פעמים עם 1x TBST במשך 5 דקות כל אחד.
  6. התבוננו בכיסויים מתחת למיקרוסקופ הפלואורסצנטי וצלמו תמונות10. ביצוע ניתוח סטטיסטי של עוצמת הפלואורסצנטיות באמצעות תוכנת ההדמיה.
    הערה: המגלשות והכיסויים שבהם נעשה שימוש צריכים להיות נקיים וסטריליים. בעת הצביעה, שימו לב לרמת החומציות, הריכוז והטמפרטורה של תמיסת הצביעה, והימנעו מרוות פלואורסצנטית. יש להפעיל את המיקרוסקופ הפלואורסצנטי לפחות 15 דקות מראש כדי לחמם מראש את מנורת הכספית ולכבות אותו למשך 30 דקות לפני שהוא מופעל שוב. בעת רכישת תמונות, פרמטרי החשיפה של אותו צבע באותה אצווה של ניסויים צריכים להיות עקביים כדי להבטיח את דיוק התוצאות.

5. בדיקת אימונופלואורסנציה של רמת ROS

  1. תרבית וטיפול בתאים כפי שנדון בשלב 4.1.
  2. לאחר הטיפול התרופתי, יש לשטוף כל כיסוי שלוש פעמים עם PBS למשך 3 דקות, ולדגור עם 400 μL של DCFH-DA (10 μM) בטמפרטורה של 37°C למשך 20 דקות.
    הערה: DCFH-DA הוא אינדיקטור אוניברסלי לעקה חמצונית. יש לו חדירות קרום התא ולא פלואורסצנטיות. ברגע שהוא נכנס לתא, הוא עובר הידרוליזה על ידי אסטראז כדי לייצר 2',7'-dichlorodihydrofluorescein (DCFH) ולאחר מכן מחומצן במהירות כדי לייצר מוצר פלואורסצנטי חזק.
  3. שטפו שוב את התאים עם DMEM ללא סרום (פעמיים למשך 3 דקות כל אחד) ומיד התבוננו בכיסוי לאחר הוספת חומר מרווה פלואורסצנטי מתחת למיקרוסקופ הפלואורסצנטי. חשב את עוצמת הפלואורסצנטיות היחסית על ידי תוכנת ההדמיה.
    הערה: לאחר טעינת הבדיקה DCFH-DA, הקפד לנקות את הבדיקה השיורית שאינה נכנסת לתא, אחרת הרקע יהפוך גבוה.

6. זיהוי כתם מערבי של ביטוי חלבונים של Nrf2, p-Akt, Akt, Bcl-2 ו-Bax11,12

  1. חסן תאי PC12 בצלחות 6 בארות בריכוז של 1 x 106 תאים / באר ותרבית ב 37 ° C במשך 24 שעות. קבץ וטפל בתאים כאמור בשלב 4.1, והגדר שלוש בארות משוכפלות בכל קבוצה.
  2. לאחר טיפול תרופתי במשך 24 שעות, שטפו את התאים שלוש פעמים עם PBS במשך 5 דקות כל אחד ודגרו על קרח במשך 30 דקות במאגר ליזיס מוכן. לאחר הליזה, צנטריפוגו את התאים למשך 20 דקות בטמפרטורה של 16,000 x גרם ו-4 מעלות צלזיוס ואספו את הסופרנאטנטים.
  3. זהה את ריכוז החלבון והתאם בהתאם להוראות באמצעות בדיקת ברדפורד. לדלל את הדגימות ו denature ב 100 ° C במשך 10 דקות.
    הערה: מאגר הליזה מורכב ממעכב פוספטאז, מעכב פרוטאז ו-RIPA lysate ביחס נפח של 1:1:50. בקבוצת הביקורת, נדרשים 200 μL/well של חיץ ליזיס, ו-100 μL/well של חיץ ליזיס נדרשים בקבוצות האחרות. באופן כללי, ריכוזי החלבונים של קבוצת הבקרה, המודל ושני סוגים של שילובים הם 0.45 מ"ג/מ"ל, 0.25 מ"ג/מ"ל ו-0.32-0.39 מ"ג/מ"ל בהתאמה; ריכוזי החלבון שלהם לאחר דילול עם מאגר ההעמסה הם 0.36, 0.2 ו-0.256-0.312 מ"ג/מ"ל, בהתאמה.
  4. כדי לזהות חלבונים בעלי משקלים מולקולריים שונים, יש לטעון 25 מיקרוגרם חלבון בכל נתיב, להריץ אלקטרופורזה SDS-PAGE של 12% ולהעביר את הג'ל לממברנות PVDF.
    הערה: במהלך הכנת ג'ל SDS, יש לערבב אותו באופן מלא ללא בועות או חלקיקים בלתי מסיסים; אחרת, עלולים להתרחש פסים לא אחידים או לא סדירים. בעת העברת הממברנות, ודא שאין בועות בין קרום PVDF לבין הג'ל; אחרת, יופיעו כתמים לבנים ברצועה. בנוסף, שלב זה חייב להתבצע בטמפרטורות נמוכות, ואת שקית הקרח צריך להיות שונה כל 30 דקות.
  5. חסום את הממברנות עם חלב 5% ללא שומן למשך 1.5 שעות ב- RT ודגור עם 5 מ"ל של הנוגדנים הראשוניים המתאימים (Nrf2 1:1,000, Akt 1:2,000, p-Akt 1:2,000, Bcl-2 1:5,000 ו- Bax 1:1,000) למשך 24 שעות ב- 4 ° C. השתמש בנוגדן β-אקטין (1:5,000) כבקרה פנימית.
  6. שטפו את הממברנות עם TBST (שלוש פעמים במשך 10 דקות כל אחת), ואז דגרו עם 5 מ"ל של נוגדנים מצומדים משניים מסוג HPR (1:5,000) ב-RT למשך שעתיים.
    הערה: אין לשנות באופן שרירותי את יחס הדילול של הנוגדנים, ויש לשטוף את הממברנות ב-TBST במידה מספקת בהתאם לדרישות כדי למנוע שצבע הרקע של הרצועה יהיה שחור מדי.
  7. לבסוף, שטפו שוב את הממברנה עם TBST, וטפלו בה עם מצע HRP כימילומינסנטי (בהתאם להוראות היצרן) לזיהוי רצועת החלבון. צלם את התמונות באמצעות מערכת הדמיה כימילומינסנציה וכמת את ערכי האפור של החלבונים באמצעות תוכנת ההדמיה, עם β-אקטין כבקרה פנימית השוואתית.

תוצאות

בדיקת השילוב האופטימלי של הזרקת Ast וקפסולת Eri מוצגת באיור 1. שיעור הישרדות התאים של הזרקת Ast וכמוסת Eri על תאי PC12 רגילים מוצג באיור 1A. כדאיות התא הייתה נמוכה מ-95% עם הזרקת Ast בריכוזים גדולים מ-12 מיקרומטר (איור 1A) וקפסולת Eri בריכוזים גדולים מ-5 מיקרומטר (?...

Discussion

עדיין חסרות תרופות אידיאליות לטיפול באיסכמיה מוחית בפרקטיקה הקלינית המודרנית2. בהנחיית תוספת צ'י והפעלת שיטת זרימת הדם, אסט, ארי ותכשירים אחרים שימשו בשילוב בפרקטיקה הקלינית של TCM והשיגו יתרונות מקיפים טובים13,14,15. מספר רב של ?...

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.

Acknowledgements

מחקר זה מומן על ידי פרויקטי מו"פ מרכזיים של המחלקה למדע וטכנולוגיה של מחוז סצ'ואן (2020YFS0325).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1300 series class II biosafety cabinetThermo Fisher Scientific Instruments Company1374
3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromideGuangzhou saiguo biotech Company1334GR001MTT
ACEA NovoExpress 1.4.0ACEA Biosciences, Inc-
AktWuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc10176-2-AP
Analytical flow cytometryThermo Fisher Scientific Instruments Company62-2-1810-1027-0
Annexin V-FITC apoptosis detection kitBeyotime Biotechnology CompanyC1062L
Astragalus injectionHeilongjiang Zhenbao Island Pharmaceutical CompanyA03190612144Ast injection
Astragaloside AChongqing Gao Ren Biotechnology Company84687-43-4
BaxWuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc60267-1-Ig
BCA protein quantification kitBeyotime Biotechnology CompanyP0012
Bcl-2Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc26593-1-AP
Carbon dioxide incubatorsThermo Fisher Scientific Instruments Company0816-2014
Caspase-3Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc19677-1-AP
Chlorogenic acidChongqing Gao Ren Biotechnology Company327-97-9
Cobalt chloride hexahydrateMerck Biotechnology, Inc.7791-13-1CoCl2
Dimethyl sulfoxideGuangzhou saiguo biotech Company2020112701DMSO
Disodium hydrogen phosphate dodecahydrateChengdu Kolon Chemical Company2020090101
DMEM high sugar mediumThermo scientific Hyclone2110050
DMEM sugar free mediumBeijing Solarbio life sciences Company2029548
ECL luminous fluidLianshuo Biological CompanyWBKLS0500
Electronic balanceHaozhuang Hengping Scientific Instrument Co., Ltd., Shanghai, ChinaFA1204
Electrophoresis instrumentBio-Rad Laboratories (Shanghai) Co., Ltd1658026
Erigeron breviscapus capsuleYunnan Biogu Pharmaceutical CompanyZ53021671Eri capsule
Fetal bovine serumFour Seasons Institute of Biological Engineering20210402FBS
Fluorescent microscopeOlympms CorporationIX71-F32PH
Gel imagerBio-Rad Laboratories (Shanghai) Co., Ltd1708265
Goat anti-mouse secondary antibodyWuhan Three Eagles Proteintech Group, IncSA00001-1
Goat anti-rabbit secondary antibodyWuhan Three Eagles Proteintech Group, IncSA00001- 2
IBM SPSS Statistics version 26.0International Business Machines Corporation, USA-
ImageJ 1.8.0National Institutes of Health, USA-imaging software
Immunol fluorescence staining kitBeyotime Biotechnology CompanyP0196
KClChengdu Kolon Chemical Company2021070901
MarkerThermo Fisher Scientific Instruments Company26616
Microplate readerPerkin Elmer Corporate Management (Shanghai) Co.HH35L2018296
Motic Inverted microscopeNanda Scientific Instruments Co.AE2000LED
NaClChengdu Kolon Chemical Company2014081301
Nonfat milkBeyotime Biotechnology CompanyP0216
Nrf2Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc16396-1-AP
P-AktWuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc66444-1-Ig
PC12 cellsChinese Academy of SciencesCBP60430
Penicillin-Streptomycin solutionThermo scientific HycloneSV30010
Phosphatase protease inhibitor mixtureBeyotime Biotechnology CompanyP1045
Potassium dihydrogen phosphateChengdu Kolon Chemical Company2015082901
Reactive oxygen species assay kitBeyotime Biotechnology CompanyS0033S
RI-PA lysis solutionBeyotime Biotechnology CompanyP0013B
ScutellarinChongqing Gao Ren Biotechnology Company27740-01-8
SDS-PAGE sample loading buffer, 5xBeyotime Biotechnology CompanyP0015L
Sterile filter tips (0.22 µm)Merck Biotechnology, Inc.SLGP033RB
Tris-baseGuangzhou saiguo biotech Company1115GR500 TBS
TrypsinThermo scientific HycloneJ190013
Tween-20Chengdu Kolon Chemical Company2021051301
Vortex oscillatorOHAUS International Co., Ltd., Shanghai, ChinaVXMNAL
β-actinWuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc66009-1-Ig

References

  1. Mendelevich, E. G. Chronic cerebral ischemia, and dizziness. Zhurnal Nevrologii i Psikhiatrii Imeni SS Korsakova. 122 (3), 22-26 (2022).
  2. Gao, L. Expert consensus on the diagnosis and treatment of chronic cerebral ischemia with integrated traditional Chinese and western medicine. Chinese Journal of Integrated Traditional and Western Medicine. 38 (10), 1161-1167 (2018).
  3. Luyu, S., Heng, L., Dengke, L. Combined treatment of 45 cases of cerebral infarction with Astragalus and Dengzhan Xixin injection. Jilin Journal of Traditional Chinese Medicine. 27 (4), 23-24 (2007).
  4. Bei, N., et al. Clinical study of Dengzhanxixin injection combined with Astragalus injection in the treatment of acute ischemic stroke. Journal of Basic Chinese Medicine. 21 (9), 1123-1127 (2015).
  5. Tian, F., et al. Optimal ratio of Astragalus injection combined with Dengzhan Xixin injection against cerebral ischemia-reperfusion injury in rats by baseline equal-ratio increase-decrease design method. China Pharmacy. 30 (14), 1885-1889 (2019).
  6. Li, J., et al. Protective effect and mechanism of Astragalus combined with Erigeron breviscapusin the best proportion on cerebral ischemia rats. Pharmacology and Clinics of Chinese Materia Medica. 35 (2), 104-108 (2019).
  7. Yan, Y., et al. Study on the oxidative damage of PC12 cells with hypoxia and hypoglycemia based on the combination of Astragalus and Dengzhan Asarum based on the Nrf2/HO-1 pathway. Pharmacology and Clinics of Chinese Materia Medica. 38 (2), 159-164 (2022).
  8. . Chinese Pharmacopoeia, Dengzhan Asarum Granules. Volume I Available from: https://db.ouryao.com/yd2020/view.php?id=f27dcefa69 (2020)
  9. . Chinese Pharmacopoeia, Astragalus granules. Volume I Available from: https://db.ouryao.com/yd2020/view.php?id=fbcd0a8bf8 (2020)
  10. Liu, X., et al. N-linoleyltyrosine protects PC12 cells against oxidative damage via autophagy: Possible involvement of CB1 receptor regulation. International Journal of Molecular Medicine. 46 (5), 1827-1837 (2020).
  11. Fan, Y., et al. Gab1 regulates SDF-1-induced progression via inhibition of apoptosis pathway induced by PI3K/AKT/Bcl-2/BAX pathway in human chondrosarcoma. Tumor Biology. 37 (1), 1141-1149 (2016).
  12. Meng, M., Zhang, L., Ai, D., Wu, H., Peng, W. β-Asarone ameliorates β-Amyloid-induced neurotoxicity in PC12 cells by activating P13K/Akt/Nrf2 signaling pathway. Frontiers in Pharmacology. 12, 659955 (2021).
  13. Li, J., Chen, H. Advances in the treatment of chronic cerebral ischemia with traditional Chinese and western medicine. Xinjiang Journal of Traditional Chinese Medicine. 39 (3), 115-118 (2021).
  14. Yu, M., Zhan, Q., Xu, X. Discussion on the therapeutic value of traditional Chinese medicine on cognitive dysfunction caused by chronic cerebral ischemia. Chinese Medicine Modern Distance Education of China. 11 (19), 155-157 (2013).
  15. Wang, M., Liu, J., Yao, M., Ren, J. Advances in research on pharmacological and neuroprotective effects of traditional Chinese medicine after cerebral ischemia. China Journal of Chinese Materia Medica. 45 (3), 513-517 (2020).
  16. Wang, N., Sun, H., Ma, X. Effects of different doses of astragalus injection on neurological rehabilitation of stroke patients. Chinese Journal of Clinical Rational Drug Use. 9 (13), 67-69 (2016).
  17. Sun, Y. Q. Effects of astragalus injection on apoptosis after cerebral ischemia-reperfusion in rats. Hebei Medicine. 22 (7), 1147-1149 (2016).
  18. Yang, L., et al. Dengzhan Xixin injection derived from a traditional Chinese herb Erigeron breviscapusameliorates cerebral ischemia/reperfusion injury in rats via modulation of mitophagy and mitochondrial apoptosis. Journal of Ethnopharmacology. 288, 114988 (2022).
  19. Liao, Y., Ni, X., Zhan, C., Cai, Y. Clinical research progress of Dengzhanhua preparation in prevention and treatment of ischemic stroke and transient ischemic attack. Guangdong Medical Journal. 41 (9), 963-967 (2020).
  20. Li, C., Li, J., Xu, G., Sun, H. Influence of chronic ethanol consumption on apoptosis and autophagy following transient focal cerebral ischemia in male mice. Scientific Reports. 10 (1), 6164 (2020).
  21. El Khashab, I. H., Abdelsalam, R. M., Elbrairy, A. I., Attia, A. S. Chrysin attenuates global cerebral ischemic reperfusion injury via suppression of oxidative stress, inflammation and apoptosis. Biomedicine Pharmacotherapy. 112, 108619 (2019).
  22. Su, X., He, S., Chen, Z., Xie, X. Effect of breviscapine aglycone on PI 3 K/Akt conduction pathway in neonatal rats with hypoxic-ischemic brain injury. Journal of Armed Police Logistics College (Medical Edition). 27 (2), 93-96 (2018).
  23. Wang, X., Shi, C., Pan, H., Meng, X., Ji, F. MicroRNA-22 exerts its neuroprotective and angiogenic functions via regulating PI3K/Akt signaling pathway in cerebral ischemia-reperfusion rats). Journal of Neural Transmission. 127 (1), 35-44 (2020).
  24. Luca, M., Luca, A., Calandra, C. The role of oxidative damage in the pathogenesis and progression of alzheimer's disease and vascular dementia. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2015, 504678 (2015).
  25. Wang, Z., et al. Lupeol alleviates cerebral ischemia-reperfusion injury in correlation with modulation of PI3K/Akt pathway. Neuropsychiatric Disease and Treatment. 16 (8), 1381-1390 (2020).
  26. Li, H., et al. Neuroprotective effect of phosphocreatine on oxidative stress and mitochondrial dysfunction induced apoptosis in vitro and in vivo: Involvement of dual PI3K/Akt and Nrf2/HO-1 pathways. Free Radical Biology and Medicine. 120, 228-238 (2018).
  27. Muñoz-Sánchez, J., Chánez-Cárdenas, M. E. The use of cobalt chloride as a chemical hypoxia model. Journal of Applied Toxicology. 39 (4), 556-570 (2019).
  28. Tang, Y., et al. Salidroside attenuates CoCl2-simulated hypoxia injury in PC12 cells partly by mitochondrial protection. European Journal of Pharmacology. 912 (10), 174617 (2021).
  29. Yin, L., et al. Neuroprotective potency of Tofu bio-processed using Actinomucor elegans against hypoxic injury induced by cobalt chloride in PC12 cells. Molecules. 26 (10), 2983 (2021).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

189Erigeron breviscapusPC12PI3K Akt Nrf2

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved