JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול זה חוקר את ההשפעות המגינות של platycodin D על מחלת כבד שומני לא אלכוהולי במודל המושרה על ידי חומצה פלמיטית במבחנה .

Abstract

ההופעה של מחלת כבד שומני לא אלכוהולי (NAFLD) עולה בקצב מדאיג ברחבי העולם. Platycodon grandiflorum נמצא בשימוש נרחב כתרופה אתנו-רפואית מסורתית לטיפול במחלות שונות והוא מזון פונקציונלי טיפוסי שניתן לשלב בתזונה היומיומית. מחקרים הראו כי platycodin D (PD), אחד המרכיבים הפעילים העיקריים של Platycodon grandiflorum, יש זמינות ביולוגית גבוהה וממתן באופן משמעותי את ההתקדמות של NAFLD, אבל המנגנון הבסיסי של זה עדיין לא ברור. מחקר זה נועד לחקור את ההשפעה הטיפולית של פרקינסון נגד NAFLD במבחנה. תאי AML-12 טופלו בחומצה פלמיטית (PA) של 300 מיקרומטר במשך 24 שעות כדי למדל NAFLD במבחנה. לאחר מכן, התאים טופלו בפרקינסון או שלא קיבלו טיפול בפרקינסון במשך 24 שעות. רמות מיני החמצן הריאקטיבי (ROS) נותחו באמצעות צביעה של 2′,7′-dichloro-dihydro-fluorescein diacetate (DCFH-DA), ופוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית נקבע על ידי שיטת הצביעה JC-1. יתר על כן, רמות ביטוי החלבונים של LC3-II/LC3-I ו- p62/SQSTM1 בליזטים של התא נותחו על ידי כתם מערבי. נמצא כי PD מפחית באופן משמעותי את רמות הפוטנציאל של ROS וקרום המיטוכונדריה בקבוצה שטופלה ב-PA בהשוואה לקבוצת הביקורת. בינתיים, PD העלה את רמות LC3-II/LC3-I והוריד את רמות p62/SQSTM1 בקבוצה שטופלה ב-PA בהשוואה לקבוצת הביקורת. התוצאות הצביעו על כך שמחלת פרקינסון שיפרה את NAFLD במבחנה על-ידי הפחתת עקה חמצונית וגירוי אוטופגיה. מודל זה במבחנה הוא כלי שימושי לחקר התפקיד של PD ב- NAFLD.

Introduction

Platycodon grandiflorus (PG), שהוא השורש המיובש של Platycodon grandiflorus (Jacq.) A.DC., משמש ברפואה סינית מסורתית (TCM). הוא מיוצר בעיקר באזורים הצפון-מזרחיים, הצפוניים, המזרחיים, המרכזיים והדרום-מערביים של סין1. רכיבי PG כוללים ספונינים טריטרפנואידים, רב-סוכרים, פלבנואידים, פוליפנולים, פוליאתילן גליקול, שמנים נדיפים ומינרלים2. ל-PG יש היסטוריה ארוכה של שימוש כמזון וכצמחי מרפא באסיה. באופן מסורתי, צמח זה שימש לייצור תרופות נגד מחלות ריאה. פרמקולוגיה מודרנית מספקת גם ראיות ליעילות של PG לטיפול במחלות אחרות. מחקרים הראו כי ל-PG יש השפעה טיפולית על מגוון מודלים של פגיעה בכבד הנגרמת על ידי תרופות. תוספי תזונה של תמציות PG או platycodin יכולים להקל על השמנת יתר עתירת שומן הנגרמת על ידי דיאטה ומחלות מטבוליות הקשורות אליה 3,4,5. פוליסכרידים מ-PG יכולים לשמש לטיפול בפגיעה חריפה בכבד הנגרמת על ידי LPS/D-GalN בעכברים6. יתר על כן, ספונינים משורשי PG משפרים סטיאטוהפטיטיס לא אלכוהולית הנגרמת על ידי דיאטה עתירת שומן (NASH)7. יתר על כן, platycodin D (PD), אחד המרכיבים הטיפוליים החשובים ביותר של PG, יכול לשפר ביטוי קולטן ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה וספיגת ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה בתאי קרצינומה הפטוצלולרית אנושית (HepG2)8. יתר על כן, פרקינסון יכול גם לגרום לאפופטוזיס ולעכב הידבקות, נדידה ופלישה בתאי HepG2 9,10. לפיכך, במחקר זה, תאי הפטומה AML-12 של עכברים משמשים לבניית מודל במבחנה וכדי להמשיך לחקור את ההשפעות הפרמקולוגיות ואת המנגנונים הבסיסיים של PD במודל זה.

המונח מחלת כבד שומני לא אלכוהולי (NAFLD) מתייחס לקבוצה של מחלות כבד הכוללת סטאטוזיס פשוט, NASH, שחמת הכבד וקרצינומה הפטוצלולרית11. למרות שהפתוגנזה של NAFLD אינה מובנת לחלוטין, מהתיאוריה הקלאסית של "שתי מכות" ועד לתיאוריית "ריבוי המכות" הנוכחית, עמידות לאינסולין נחשבת מרכזית בפתוגנזה של NAFLD12,13,14. מחקרים הראו כי עמידות לאינסולין בהפטוציטים עלולה להוביל לעלייה בחומצות שומן חופשיות, היוצרות טריגליצרידים המופקדים בכבד וגורמים לכבד להיות שומני15,16. הצטברות שומן עלולה להוביל לרעילות ליפוטוקסית, תפקוד לקוי של המיטוכונדריה כתוצאה מעקה חמצונית, עקה אנדופלסמית ברשתית ושחרור ציטוקינים דלקתיים, וכתוצאה מכך פתוגנזה והתקדמות של NAFLD17,18. בנוסף, אוטופגיה גם ממלאת תפקיד בפתוגנזה של NAFLD, שכן היא מעורבת בוויסות רגישות לאינסולין תאי, מטבוליזם שומנים בתאים, פגיעה בהפטוציטים וחסינות מולדת 19,20,21.

מגוון מודלים של בעלי חיים ומודלים תאיים הוקמו כדי לספק בסיס לחקר הפתוגנזה והמטרות הטיפוליות האפשריות של NAFLD22,23. עם זאת, מודלים של בעלי חיים בודדים אינם יכולים לחקות באופן מלא את כל התהליכים הפתולוגיים של NAFLD24. הבדלים אינדיבידואליים בין בעלי חיים מובילים לתכונות פתולוגיות שונות. שימוש בקווי תאי כבד או בהפטוציטים ראשוניים במחקרי מבחנה של NAFLD מבטיח עקביות מרבית בתנאי הניסוי. חוסר ויסות מטבוליזם של שומנים בכבד יכול להוביל לרמות גבוהות יותר של הצטברות טיפות שומנים בכבד ב- NAFLD25. חומצות שומן חופשיות כגון חומצה אולאית ושמן דקלים שימשו במודל in vitro כדי לחקות NAFLD הנגרמת על ידי דיאטה עתירת שומן26,27. קו תאי הפטובלסטומה האנושי HepG2 משמש לעתים קרובות לבניית מודלים של NAFLD במבחנה, אבל, בתור קו תאי גידול, חילוף החומרים של תאי HepG2 שונה באופן משמעותי מזה של תאי כבד בתנאים פיזיולוגיים רגילים28. לכן, שימוש בהפטוציטים ראשוניים או בהפטוציטים ראשוניים של עכברים לבניית מודל NAFLD במבחנה לבדיקת תרופות הוא יתרון גדול יותר מאשר שימוש בקווי תאים סרטניים. בהשוואה לבחינה סינרגטית של השפעות תרופתיות ומטרות טיפוליות הן במודלים של בעלי חיים והן במודלים של הפטוציטים במבחנה, נראה כי לשימוש בהפטוציטים של עכברים לבניית מודל NAFLD במבחנה יש פוטנציאל יישום טוב יותר.

חומצות שומן חופשיות הנכנסות לכבד מחומצנות כדי לייצר אנרגיה או מאוחסנות כטריגליצרידים. באופן משמעותי, חומצות שומן חופשיות יש lipotoxicity מסוים עלול לגרום תפקוד לקוי של התאים אפופטוזיס12. חומצה פלמיטית (PA) היא חומצת השומן הרוויה הנפוצה ביותר בפלזמה האנושית29. כאשר תאים ברקמה שאינה שומן נחשפים לריכוזים גבוהים של PA במשך זמן רב, הדבר ממריץ את הייצור של מיני חמצן תגובתי (ROS) וגורם לעקה חמצונית, הצטברות שומנים ואפילו אפופטוזיס30. לכן, חוקרים רבים משתמשים ב-PA כגורם מעורר תאי כבד לייצר ROS, ובכך בונים את מודל מחלת הכבד השומני במבחנה ומעריכים את ההשפעות המגינות של חומרים פעילים מסוימים על תאים31,32,33,34. מחקר זה מציג פרוטוקול לחקירת ההשפעות המגינות של פרקינסון על מודל תאי של NAFLD המושרה על ידי הרשות הפלסטינית.

Protocol

תאי AML-12 (קו תאי הפטוציטים רגיל של עכבר) משמשים למחקרים מבוססי תאים. התאים מתקבלים ממקור מסחרי (ראה טבלת חומרים).

1. טיפול מקדים בתאי AML-12 כדי למדל NAFLD במבחנה

  1. שמור על התאים במדיה רגילה של תרבית תאים (DMEM בתוספת Ham's F12 [1:1] המכילים 0.005 מ"ג/מ"ל אינסולין, 5 נ"ג/מ"ל סלניום, 0.005 מ"ג/מ"ל טרנספרין, 40 נ"ג/מ"ל דקסמתזון ו-10% נסיוב בקר עוברי [FBS], ראו טבלת חומרים) בטמפרטורה של 37°C באווירה לחה עם 5% CO2.
  2. זרעו את התאים בצלחות 12 בארות (1 מ"ל / באר) עם צפיפות של 2.8 x 105 תאים / באר.
    הערה: כל פעולות עיכול התאים וההחלפה הבינונית מבוצעות בארון בטיחות ביולוגית כדי למנוע זיהום התאים.
  3. הסר את מדיום התרבית של התאים לאחר הדגירה לילה (~ 10 שעות), ולאחר מכן לשטוף את התאים פעמיים עם 1 מ"ל של מדיה ללא סרום (לכל באר).
  4. חלק את צלחת התא בת 12 הקידוחים לארבע קבוצות טיפול שונות משמאל לימין, כולל (1) קבוצת הביקורת, (2) הקבוצה שטופלה ב- PD, (3) הקבוצה שטופלה ב- PA, ו- (4) הקבוצה שטופלה ב- PA + PD.
    הערה: שלושה עותקים משוכפלים של כל קבוצת טיפול ניסיונית מסודרים מלמעלה למטה על אותה צלחת תא בת 12 בארות.
  5. הוסף את מדיית תרבית התאים הרגילה (1 מ"ל/באר) לקבוצת הביקורת ולקבוצה שטופלה בפרקינסון, והוסף את מדיית תרבית התאים הרגילה (1 מ"ל/באר) בתוספת 300 מיקרומטר של PA לקבוצה שטופלה ב-PA ו-PA + PD.
  6. הסר את מדיום התרבית של התאים לאחר 24 שעות של הדגירה, ולאחר מכן לשטוף את התאים עם 1 מ"ל של מדיה ללא סרום (לכל באר) פעמיים.
  7. הוסף מדיה רגילה של תרבית תאים (1 מ"ל / באר) בתוספת רכב (דימתיל סולפוקסיד, DMSO, 0.1% v/v) לקבוצת הביקורת; להוסיף מדיה רגילה של תרביות תאים (1 מ"ל/באר) בתוספת 1 מיקרומטר PD לקבוצה שטופלה ב-PD; להוסיף מדיה רגילה של תרביות תאים (1 מ"ל/באר) בתוספת PA של 300 מיקרומטר לקבוצה שטופלה ברשות הפלסטינית; הוסף מדיה רגילה של תרבית תאים (1 מ"ל/באר) בתוספת 300 מיקרומטר PA ו-1 מיקרומטר PD לקבוצה שטופלה ב-PA + PD.
  8. לאחר הדגירה במשך 24 שעות נוספות, חקרו את ההשפעות המגינות של מחלת פרקינסון על תאים באמצעות צביעה של 2′,7′-dichloro-dihydro-fluorescein diacetate (DCFH-DA) (שלב 2), צביעת JC-1 (שלב 3) וכתמים מערביים (שלב 4).
    הערה: כל פעולות הדגירה נעשות ב 37 ° C באטמוספירה לחה עם 5% CO2.

2. מדידת השינוי בייצור ROS

הערה: רמות ה-ROS התוך-תאיות בתאים מוערכות בהתבסס על בדיקת הצביעה DCFH-DA.

  1. בסוף תקופת הטיפול (שלב 1.8), לשטוף את התאים עם 1 מ"ל של מלוחים חוצצים פוספט לכל באר (1x PBS, pH 7.4) שלוש פעמים, ולאחר מכן להכתים את התאים עם 100 μL של 10 μM DCFH-DA לכל באר (ראה טבלה של חומרים). לדגור על התאים בחושך במשך 30 דקות.
    הערה: אם לא נצפתה פלואורסצנטיות ירוקה ברורה לאחר 30 דקות של דגירה, זמן הדגירה של הבדיקה והתאים יכול להיות מוגבר כראוי (30-60 דקות). אם חשיפת יתר של ערך הפלואורסצנטיות הירוק נצפתה לאחר 30 דקות של דגירה, זמן הדגירה של הבדיקה והתאים יכול להיות מופחת כראוי (15-30 דקות).
  2. שטפו את התאים עם 1x PBS (1 מ"ל/באר) שלוש פעמים. הוסף 1 מ"ל של 1x PBS לכל באר.
  3. הניחו את לוח 12 הבארות על במת המיקרוסקופ (ראו טבלת חומרים), ולאחר מכן השתמשו במטרה של פי 20 כדי לצפות במורפולוגיה של התאים (הגדלה: 200x).
  4. צלם שלוש תמונות פלואורסצנטיות מייצגות (הגדלה: 200x) עבור כל באר במיקרוסקופ הפלואורסצנטי באמצעות ערוץ פלואורסצנטי ירוק עם אורך גל עירור של 480 ננומטר ואורך גל פליטה של 530 ננומטר.
    הערה: התעלה הפלואורסצנטית הירוקה עם אורך גל עירור של 480 ננומטר ואורך גל פליטה של 530 ננומטר מומלצת כדי לזהות את DCFH-DA. בנוסף, DCFH-DA ניתן לזהות עם הגדרות הפרמטרים עבור GFP ו- FITC במיקרוסקופ פלואורסצנטי35,36.
  5. לבסוף, עבד את התמונות באמצעות תוכנה לרכישת תמונות (ראה טבלת חומרים), ולאחר מכן השתמש בתוכנת ImageJ כדי לחשב את עוצמת הפלואורסצנטיות הממוצעת של כל קבוצה או את היחסים בין הקבוצות השונות.
    הערה: הפרטים הטכניים של המיקרוסקופ הפלואורסצנטי ותוכנת Image J ששימשו לעבודת ההדמיה תוארו בעבר37,38.

3. מדידת השינוי בפוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית

הערה: השינויים בפוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית מנוטרים על ידי בדיקת הצביעה JC-1.

  1. בסוף תקופת הטיפול (שלב 1.8), לשטוף את התאים עם 1 מ"ל של 1x PBS לכל באר שלוש פעמים, ולאחר מכן לצבוע את התאים עם 100 μL של 5 מיקרוגרם / מ"ל JC-1 פתרון עבודה (ראה טבלה של חומרים) במשך 30 דקות ב 37 ° C בחושך.
    הערה: אם לא נצפתה פלואורסצנטיות ירוקה ברורה לאחר 30 דקות של דגירה, זמן הדגירה של הבדיקה והתאים יכול להיות מוגבר כראוי (30-60 דקות). אם חשיפת יתר של ערך הפלואורסצנטיות הירוק נצפתה לאחר 30 דקות של דגירה, זמן הדגירה של הבדיקה והתאים יכול להיות מופחת כראוי (15-30 דקות).
  2. שטפו את התאים עם 1x PBS (1 מ"ל/באר) שלוש פעמים. הוסף 1 מ"ל של 1x PBS לכל באר.
  3. הניחו את לוח 12 הבארות על במת המיקרוסקופ, ולאחר מכן השתמשו במטרה של פי 20 כדי לבחון את המורפולוגיה של התאים (הגדלה: 200x).
  4. צלם שלוש תמונות פלואורסצנטיות מייצגות (הגדלה: 200x) עבור כל באר במיקרוסקופ הפלואורסצנטי באמצעות התעלה הפלואורסצנטית הירוקה עם אורכי גל עירור ופליטה של 485 ננומטר ו- 535 ננומטר, בהתאמה, והתעלה הפלואורסצנטית האדומה עם אורכי גל עירור ופליטה של 550 ננומטר ו- 600 ננומטר, בהתאמה.
    הערה: התעלה הפלואורסצנטית הירוקה עם אורך גל עירור של 485 ננומטר ואורך גל פליטה של 535 ננומטר משמשת לגילוי מונומר JC-1, אשר מטופל כמיטוכונדריה דה-פולריזציה 39,40,41, והתעלה הפלואורסצנטית האדומה עם אורך גל עירור של 550 ננומטר ואורך גל פליטה של 600 ננומטר משמשת לגילוי דימר JC-1, אשר מטופל כמו מיטוכונדריה מקוטבת 39,40,41.
  5. לבסוף, עבד את התמונות באמצעות תוכנה לרכישת תמונות, ולאחר מכן השתמש בתוכנת Image J כדי לחשב את עוצמת הפלואורסצנטיות הממוצעת של כל קבוצה או את היחסים בין הקבוצות השונות.
    הערה: הפרטים הטכניים של המיקרוסקופ הפלואורסצנטי ותוכנת Image J ששימשו לעבודת ההדמיה תוארו בעבר37,38.

4. מדידת רמות ביטוי החלבונים של LC3-II/LC3-I ו-p62/SQSTM1

  1. לאחר הטיפול (שלב 1.8), לשטוף את התאים שלוש פעמים עם 1x PBS (1 מ"ל / באר) כי כבר precooled ב 4 ° C.
  2. הוסיפו לצלחת 12 הקידוחים RIPA lysis buffer (100 μL/well) בתוספת פרוטאז וקוקטייל מעכב פוספטאז (1x) (ראו טבלת חומרים) ולליז על קרח למשך 5 דקות.
  3. אסוף את התא ליזט לתוך צינורות מיקרוצנטריפוגות 1.5 מ"ל, וצנטריפוגה ב 12,000 x גרם במשך 20 דקות ב 4 ° C. לקבוע את ריכוז החלבון של supernatants על ידי שיטת BCA בעקבות נהלים סטנדרטיים42.
  4. הוסף מאגר טעינה לדוגמה של SDS-PAGE (5x, ראה טבלת חומרים) לסופרנאטנטים של התא ליזט (יחס נפח = 1:4).
  5. מערבבים על ידי מערבולות (במהירות גבוהה עבור ~ 15 שניות), ומחממים את הדגימות המעורבות ב 100 ° C במשך 5 דקות כדי לנטרל את החלבון.
  6. הכנס את ג'ל 12% SDS-PAGE 12% מוכן היטב למיכל האלקטרופורזה, ולאחר מכן הוסף את מאגר הדגימה של SDS (1x) מהולל במים טהורים במיוחד למיקום מגבלת הגובה.
    הערה: ג'ל SDS-PAGE מוכן באמצעות ערכה מסחרית (ראה טבלת חומרים) בהתאם להוראות היצרן.
  7. הוסף את סמן החלבון (5 מיקרוליטר / באר) ודגימות (20 מיקרוגרם / באר) לבארות שונות של ג'ל SDS-PAGE.
  8. הגדר את מצב המתח היציב על 100 V, ובצע את האלקטרופורזה במשך 80 דקות.
  9. לאחר אלקטרופורזה SDS-PAGE, בצע את האלקטרו-העברה של החלבונים לקרום פוליווינילידן פלואוריד (PVDF) (0.45 מיקרומטר, ראה טבלת חומרים) בעקבות דוחות שפורסמו בעבר43,44.
  10. לאחר האלקטרוטרנספר של החלבונים, שטפו את קרום PVDF עם 10 מ"ל TBST (1x TBS, 0.1% Tween 20) פעמיים (5 דקות לזמן) בשייקר בטמפרטורת החדר.
  11. חסום את קרום PVDF עם 5 מ"ל אלבומין בסרום בקר (BSA, 5%) בשייקר בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת.
  12. שטפו את קרום PVDF עם 10 מ"ל TBST שלוש פעמים (10 דקות לזמן). לאחר מכן, יש לדגור על קרום PVDF ב-5 מ"ל של הנוגדנים הראשוניים הספציפיים המדוללים בחיץ חוסם עבור LC3 (mAb עכבר, 1:2,000), p62/SQSTM1 (להלן p62, mAb עכבר, 1:2,000) ו-β-actin (mAb עכבר, 1:2,000) (ראה טבלת חומרים) למשך הלילה ב-4°C.
  13. שטפו את קרום PVDF עם 10 מ"ל TBST שלוש פעמים (10 דקות לזמן) בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, דגרו על קרום PVDF עם נוגדן משני מסוג IgG נגד עכבר (HRP) המדולל במאגר חוסם (1:10,000) (ראו טבלת חומרים) בטמפרטורת החדר ומוגן מאור למשך שעתיים.
  14. שטפו את קרום PVDF עם 10 מ"ל TBST שלוש פעמים (10 דקות לזמן) בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הניחו את קרום ה-PVDF על הניילון הנצמד, הוסיפו כמות מתאימה של תמיסת עבודה ECL (200 מיקרוליטר/ממברנה) (ראו טבלת חומרים) ודגרו במשך 2 דקות.
  15. לאחר הדגירה, הסר את פתרון העבודה ECL, וחשף את קרום PVDF במערכת ההדמיה לפיתוח תמונה. לבסוף, השתמש בתוכנת Image J כדי לנתח את הערכים האפורים של כל להקה.
    הערה: הפרטים הטכניים של הכתם המערבי ותוכנת Image J ששימשו לעבודת ההדמיה תוארו בעבר45,46.

5. ניתוח סטטיסטי

  1. הצג את הנתונים מהניסויים כממוצע ± סטיית תקן (SD).
  2. בצע את ניתוח המובהקות באמצעות כלי התוכנה הסטטיסטית שתואר קודם לכן47.
  3. חשב את ההבדלים הסטטיסטיים בין שתי הקבוצות באמצעות מבחן t. ערך P מתחת ל-0.05 נחשב מובהק סטטיסטית: *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.005.

תוצאות

ROS תוך-תאי בתאים
תאי AML-12 הושרו עם PA של 300 מיקרומטר למשך 24 שעות, ומודל תאי NAFLD הוקם. לאחר מכן, התאים טופלו במחלת פרקינסון במשך 24 שעות. התאים סומנו בבדיקה פלואורסצנטית DCFH-DA, וייצור ROS נצפה תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. התוצאות של צביעת DCFH-DA של ROS תוך-תאי בתאים מוצגות באיור 1...

Discussion

מחקרים הדגישו את העובדה כי NAFLD היא תסמונת קליניתפתולוגית, החל כבד שומני NASH, שיכול להתקדם שחמת הכבד וסרטן הכבד51. תזונה עתירת שומן ואורח חיים לא פעיל הם גורמי סיכון אופייניים ל-NAFLD. הן טיפולים שאינם תרופתיים והן טיפולים תרופתיים לטיפול ב- NAFLD נחקרו51,52,53

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכת על ידי מענקים מהוועדה למדע וטכנולוגיה של צ'ונגצ'ינג (cstc2020jxjl-jbky10002, jbky20200026, cstc2021jscx-dxwtBX0013 ו- jbky20210029) והקרן למדע פוסט-דוקטורט בסין (מס '2021MD703919).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
5% BSA Blocking BufferSolarbio, Beijing, ChinaSW3015
AML12 (alpha mouse liver 12) cell lineProcell Life Science&Technology Co., Ltd, ChinaAML12
Beyo ECL PlusBeyotime, Shanghai, ChinaP0018S
Bio-safety cabinetEsco Micro Pte Ltd, SingaporeAC2-5S1 A2 
cellSensOlympus, Tokyo, Japan1.8
Culture CO2 IncubatorEsco Micro Pte Ltd, SingaporeCCL-170B-8
DexamethasoneBeyotime, Shanghai, ChinaST125
Dimethyl sulfoxideSolarbio, Beijing, ChinaD8371
DMEM/F12Hyclone, Logan, UT, USASH30023.01
Foetal Bovine SerumHyclone, Tauranga, New ZealandSH30406.05
Graphpad softwareGraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA8.0
HRP Goat Anti-Mouse IgG (H+L)ABclonal, Wuhan, ChinaAS003
Hydrophobic PVDF Transfer MembraneMerck, Darmstadt, GermanyIPFL00010
Insulin, Transferrin, Selenium Solution, 100×Beyotime, Shanghai, ChinaC0341
MAP LC3β AntibodySanta Cruz Biotechnology (Shanghai) Co., LtdSC-376404
Mitochondrial Membrane Potential Assay Kit with JC-1Solarbio, Beijing, ChinaM8650
Olympus Inverted Microscope IX53Olympus, Tokyo, JapanIX53
Palmitic AcidSigma, GermanyP0500
Penicillin-Streptomycin Solution (100x)Hyclone, Logan, UT, USASV30010
Phenylmethanesulfonyl fluorideBeyotime, Shanghai, ChinaST506
Phosphate Buffered SolutionHyclone, Logan, UT, USABL302A
Platycodin DChengdu Must Bio-Technology Co., Ltd, ChinaCSA: 58479-68-8
Protease inhibitor cocktail for general use, 100xBeyotime, Shanghai, ChinaP1005
Protein MarkerSolarbio, Beijing, ChinaPR1910
Reactive Oxygen Species Assay KitSolarbio, Beijing, ChinaCA1410
RIPA Lysis BufferBeyotime, Shanghai, ChinaP0013E
SDS-PAGE Gel Quick Preparation KitBeyotime, Shanghai, ChinaP0012AC
SDS-PAGE Sample Loading Buffer, 5xBeyotime, Shanghai, ChinaP0015
Sigma CentrifugeSigma, Germany3K15
SQSTM1/p62 AntibodySanta Cruz Biotechnology (Shanghai) Co., LtdSC-28359
Tecan Infinite 200 PRO  Tecan Austria GmbH, Austria1510002987
WB Transfer Buffer,10xSolarbio, Beijing, ChinaD1060
β-Actin Mouse mAbABclonal, Wuhan, ChinaAC004

References

  1. Xunyan, X. Y., Fang, X. M. The effect of Platycodon grandiflorum and its historical change in the clinical application of Platycodonis radix. Zhonghua Yi Shi Za Shi. 51 (3), 167-176 (2021).
  2. Ma, X., et al. Platycodon grandiflorum extract: Chemical composition and whitening, antioxidant, and anti-inflammatory effects. RSC Advances. 11 (18), 10814-10826 (2021).
  3. Ke, W., et al. Dietary Platycodon grandiflorus attenuates hepatic insulin resistance and oxidative stress in high-fat-diet induced non-alcoholic fatty liver disease. Nutrients. 12 (2), 480 (2020).
  4. Kim, Y. J., et al. Platycodon grandiflorus root extract attenuates body fat mass, hepatic steatosis and insulin resistance through the interplay between the liver and adipose tissue. Nutrients. 8 (9), 532 (2016).
  5. Park, H. M., et al. Mass spectrometry-based metabolomic and lipidomic analyses of the effects of dietary Platycodon grandiflorum on liver and serum of obese mice under a high-fat diet. Nutrients. 9 (1), 71 (2017).
  6. Qi, C., et al. Platycodon grandiflorus polysaccharide with anti-apoptosis, anti-oxidant and anti-inflammatory activity against LPS/D-GalN induced acute liver injury in mice. Journal of Polymers and the Environment. 29 (12), 4088-4097 (2021).
  7. Choi, J. H., et al. Saponins from the roots of Platycodon grandiflorum ameliorate high fat diet-induced non-alcoholic steatohepatitis. Biomedicine & Pharmacotherapy. 86, 205-212 (2017).
  8. Choi, Y. J., et al. Platycodin D enhances LDLR expression and LDL uptake via down-regulation of IDOL mRNA in hepatic cells. Scientific Reports. 10, 19834 (2020).
  9. Li, T., et al. Platycodin D triggers autophagy through activation of extracellular signal-regulated kinase in hepatocellular carcinoma HepG2 cells. European Journal of Pharmacology. 749, 81-88 (2015).
  10. Lu, J. -. J., et al. Proteomic analysis of hepatocellular carcinoma HepG2 cells treated with platycodin D. Chinese Journal of Natural Medicines. 13 (9), 673-679 (2015).
  11. Neuschwander-Tetri, B. A. Therapeutic landscape for NAFLD in 2020. Gastroenterology. 158 (7), 1984-1998 (2020).
  12. Friedman, S. L., Neuschwander-Tetri, B. A., Rinella, M., Sanyal, A. J. Mechanisms of NAFLD development and therapeutic strategies. Nature Medicine. 24 (7), 908-922 (2018).
  13. Bessone, F., Razori, M. V., Roma, M. G. Molecular pathways of nonalcoholic fatty liver disease development and progression. Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (1), 99-128 (2019).
  14. Buzzetti, E., Pinzani, M., Tsochatzis, E. A. The multiple-hit pathogenesis of non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD). Metabolism. 65 (8), 1038-1048 (2016).
  15. Watt, M. J., Miotto, P. M., De Nardo, W., Montgomery, M. K. The liver as an endocrine organ-Linking NAFLD and insulin resistance. Endocrine Reviews. 40 (5), 1367-1393 (2019).
  16. Khan, R. S., Bril, F., Cusi, K., Newsome, P. N. Modulation of insulin resistance in nonalcoholic fatty liver disease. Hepatology. 70 (2), 711-724 (2019).
  17. Karkucinska-Wieckowska, A., et al. Mitochondria, oxidative stress and nonalcoholic fatty liver disease: A complex relationship. European Journal of Clinical Investigation. 52 (3), 13622 (2022).
  18. Tilg, H., Adolph, T. E., Dudek, M., Knolle, P. Non-alcoholic fatty liver disease: The interplay between metabolism, microbes and immunity. Nature Metabolism. 3 (12), 1596-1607 (2021).
  19. Qian, H., et al. Autophagy in liver diseases: A review. Molecular Aspects of Medicine. 82, 100973 (2021).
  20. Du, J., Ji, Y., Qiao, L., Liu, Y., Lin, J. Cellular endo-lysosomal dysfunction in the pathogenesis of non-alcoholic fatty liver disease. Liver International. 40 (2), 271-280 (2020).
  21. Allaire, M., Rautou, P. E., Codogno, P., Lotersztajn, S. Autophagy in liver diseases: Time for translation. Journal of Hepatology. 70 (5), 985-998 (2019).
  22. Kanuri, G., Bergheim, I. In vitro and in vivo models of non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD). International Journal of Molecular Sciences. 14 (6), 11963-11980 (2013).
  23. Lau, J. K., Zhang, X., Yu, J. Animal models of non-alcoholic fatty liver disease: Current perspectives and recent advances. The Journal of Pathology. 241 (1), 36-44 (2017).
  24. Reimer, K. C., Wree, A., Roderburg, C., Tacke, F. New drugs for NAFLD: Lessons from basic models to the clinic. Hepatology International. 14 (1), 8-23 (2020).
  25. Carpino, G., et al. Increased liver localization of lipopolysaccharides in human and experimental NAFLD. Hepatology. 72 (2), 470-485 (2020).
  26. Vergani, L. Fatty acids and effects on in vitro and in vivo models of liver steatosis. Current Medicinal Chemistry. 26 (19), 3439-3456 (2019).
  27. Scorletti, E., Carr, R. M. A new perspective on NAFLD: Focusing on lipid droplets. Journal of Hepatology. 76 (4), 934-945 (2022).
  28. Green, C. J., Pramfalk, C., Morten, K. J., Hodson, L. From whole body to cellular models of hepatic triglyceride metabolism: Man has got to know his limitations. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 308 (1), 1-20 (2015).
  29. Gambino, R., et al. Different serum free fatty acid profiles in NAFLD subjects and healthy controls after oral fat load. International Journal of Molecular Sciences. 17 (4), 479 (2016).
  30. Marra, F., Svegliati-Baroni, G. Lipotoxicity and the gut-liver axis in NASH pathogenesis. Journal of Hepatology. 68 (2), 280-295 (2018).
  31. Zhang, J., Zhang, H., Deng, X., Zhang, Y., Xu, K. Baicalin protects AML-12 cells from lipotoxicity via the suppression of ER stress and TXNIP/NLRP3 inflammasome activation. Chemico-Biological Interactions. 278, 189-196 (2017).
  32. Liang, Y., et al. γ-Linolenic acid prevents lipid metabolism disorder in palmitic acid-treated alpha mouse liver-12 cells by balancing autophagy and apoptosis via the LKB1-AMPK-mTOR pathway. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 69 (29), 8257-8267 (2021).
  33. Peng, Z., et al. Nobiletin alleviates palmitic acid-induced NLRP3 inflammasome activation in a sirtuin 1dependent manner in AML12 cells. Molecular Medicine Reports. 18 (6), 5815-5822 (2018).
  34. Xu, T., et al. Ferulic acid alleviates lipotoxicity-induced hepatocellular death through the SIRT1-regulated autophagy pathway and independently of AMPK and Akt in AML-12 hepatocytes. Nutrition & Metabolism. 18 (1), 13 (2021).
  35. Aranda, A., et al. Dichloro-dihydro-fluorescein diacetate (DCFH-DA) assay: A quantitative method for oxidative stress assessment of nanoparticle-treated cells. Toxicology in Vitro. 27 (2), 954-963 (2013).
  36. Eruslanov, E., Kusmartsev, S. Identification of ROS using oxidized DCFDA and flow-cytometry. Methods in Molecular Biology. 594, 57-72 (2010).
  37. Bankhead, P. . Analyzing Fluorescence Microscopy Images with ImageJ. , (2014).
  38. Wiesmann, V., et al. Review of free software tools for image analysis of fluorescence cell micrographs. Journal of Microscopy. 257 (1), 39-53 (2015).
  39. Lugli, E., Troiano, L., Cossarizza, A. Polychromatic analysis of mitochondrial membrane potential using JC-1. Current Protocols in Cytometry. , (2007).
  40. Sivandzade, F., Bhalerao, A., Cucullo, L. Analysis of the mitochondrial membrane potential using the cationic JC-1 dye as a sensitive fluorescent probe. Bio-protocol. 9 (1), 3128 (2019).
  41. Chazotte, B. Labeling mitochondria with JC-1. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (9), (2011).
  42. Walker, J. M. The bicinchoninic acid (BCA) assay for protein quantitation. The Protein Protocols Handbook. , 11-15 (2009).
  43. Goldman, A., Ursitti, J. A., Mozdzanowski, J., Speicher, D. W. Electroblotting from polyacrylamide gels. Current Protocols in Protein Science. 82, 1-16 (2015).
  44. Mozdzanowski, J., Speicher, D. W. Proteins from polyacrylamide gels onto PVDF membranes. Current Research in Protein Chemistry. , 87 (2012).
  45. Taylor, S. C., Posch, A. The design of a quantitative western blot experiment. Biomed Research International. 2014, 361590 (2014).
  46. Motulsky, H. J. Graphpad Statistics Guide. Options for multiple t tests. Graphpad. , (2020).
  47. Poltorak, A. Cell death: All roads lead to mitochondria. Current Biology. 32 (16), 891-894 (2022).
  48. Dadsena, S., Jenner, A., García-Sáez, A. J. Mitochondrial outer membrane permeabilization at the single molecule level. Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (8), 3777-3790 (2021).
  49. Green, D. R., Kroemer, G. The pathophysiology of mitochondrial cell death. Science. 305 (5684), 626-629 (2004).
  50. Lange, N. F., Radu, P., Dufour, J. F. Prevention of NAFLD-associated HCC: Role of lifestyle and chemoprevention. Journal of Hepatology. 75 (5), 1217-1227 (2021).
  51. Liu, X., Zhang, Y., Ma, C., Lin, J., Du, J. Alternate-day fasting alleviates high fat diet induced non-alcoholic fatty liver disease through controlling PPARalpha/Fgf21 signaling. Molecular Biology Reports. 49 (4), 3113-3122 (2022).
  52. Romero-Gomez, M., Zelber-Sagi, S., Trenell, M. Treatment of NAFLD with diet, physical activity and exercise. Journal of Hepatology. 67 (4), 829-846 (2017).
  53. Mizushima, N., Levine, B. Autophagy in human diseases. New England Journal of Medicine. 383 (16), 1564-1576 (2020).
  54. Cui, B., Yu, J. M. Autophagy: A new pathway for traditional Chinese medicine. Journal of Asian Natural Products Research. 20 (1), 14-26 (2018).
  55. Law, B. Y., et al. New potential pharmacological functions of Chinese herbal medicines via regulation of autophagy. Molecules. 21 (3), 359 (2016).
  56. Zhou, H., et al. Research progress in use of traditional Chinese medicine monomer for treatment of non-alcoholic fatty liver disease. European Journal of Pharmacology. 898, 173976 (2021).
  57. Zhang, L., Yao, Z., Ji, G. Herbal extracts and natural products in alleviating non-alcoholic fatty liver disease via activating autophagy. Frontiers in Pharmacology. 9, 1459 (2018).
  58. Zhang, X., et al. C-X-C motif chemokine 10 impairs autophagy and autolysosome formation in non-alcoholic steatohepatitis. Theranostics. 7 (11), 2822-2836 (2017).
  59. Li, C. X., et al. Allyl isothiocyanate ameliorates lipid accumulation and inflammation in nonalcoholic fatty liver disease via the Sirt1/AMPK and NF-kappaB signaling pathways. World Journal of Gastroenterology. 25 (34), 5120-5133 (2019).
  60. Li, S., et al. Sirtuin 3 acts as a negative regulator of autophagy dictating hepatocyte susceptibility to lipotoxicity. Hepatology. 66 (3), 936-952 (2017).
  61. Farrell, G. C., Teoh, N. C., McCuskey, R. S. Hepatic microcirculation in fatty liver disease. The Anatomical Record. 291 (6), 684-692 (2008).
  62. Milner, E., et al. Emerging three-dimensional hepatic models in relation to traditional two-dimensional in vitro assays for evaluating drug metabolism and hepatoxicity. Medicine in Drug Discovery. 8, 100060 (2020).
  63. Zhang, X., Jiang, T., Chen, D., Wang, Q., Zhang, L. W. Three-dimensional liver models: State of the art and their application for hepatotoxicity evaluation. Critical Reviews in Toxicology. 50 (4), 279-309 (2020).
  64. Bilson, J., Sethi, J. K., Byrne, C. D. Non-alcoholic fatty liver disease: A multi-system disease influenced by ageing and sex, and affected by adipose tissue and intestinal function. Proceedings of the Nutrition Society. 81 (2), 146-161 (2022).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE190Platycodin D

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved