JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

מחקר זה חושף את המנגנון של Trichosanthes-Fritillaria thunbergii בטיפול באדנוקרצינומה של הריאות בהתבסס על פרמקולוגיה של הרשת ואימות ניסיוני. המחקר גם מדגים כי מסלול האיתות PI3K/AKT ממלא תפקיד חיוני בפעולתו של Trichosanthes-Fritillaria thunbergii בטיפול באדנוקרצינומה של הריאות.

Abstract

מטרתנו הייתה לחקור את המנגנון של Trichosanthes-Fritillaria thunbergii בטיפול באדנוקרצינומה של הריאות (LUAD) בהתבסס על פרמקולוגיה של הרשת ואימות ניסיוני. המרכיבים האפקטיביים והמטרות הפוטנציאליות של Trichosanthis ו- Fritillaria thunbergii נאספו על ידי מסד נתונים של ניסוי בתפוקה גבוהה ומונחה ייחוס (HERB) של הרפואה הסינית המסורתית ומסד נתונים של גישת אנסמבל דמיון (SEA), והיעדים הקשורים ל- LUAD נשאלו על ידי מאגרי המידע GeneCards ו- Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM). רשת תרופות-רכיבים-מחלות-מטרה נבנתה על ידי תוכנת Cytoscape. רשת אינטראקציית חלבון-חלבון (PPI), פונקציית אונטולוגיה גנטית (GO) ואנציקלופדיית קיוטו של גנים וגנומים (KEGG) ניתוחי העשרת מסלולים נערכו כדי להשיג יעדי ליבה ומסלולי מפתח. תמצית מימית של Trichosanthes-Fritillaria thunbergii ותאי A549 שימשו לאימות הניסוי הבא. באמצעות מסד הנתונים של HERB וחיפוש ספרותי, נבדקו 31 תרכובות יעילות ו-157 גני מטרה פוטנציאליים של Trichosanthes-Fritillaria thunbergii, מתוכם 144 היו מטרות רגולטוריות של Trichosanthes-Fritillaria thunbergii בטיפול באדנוקרצינומה של הריאות. ניתוח ההעשרה התפקודית של GO הראה כי מנגנון הפעולה של Trichosanthes-Fritillaria thunbergii נגד אדנוקרצינומה של הריאות הוא בעיקר זרחן חלבון. ניתוח העשרת מסלול KEGG הציע כי הטיפול באדנוקרצינומה של הריאות על ידי Trichosanthes-Fritillaria thunbergii מערב בעיקר את מסלול האיתות PI3K/AKT. האימות הניסיוני הראה כי תמצית מימית של Trichosanthes-Fritillaria thunbergii יכולה לעכב את התפשטות תאי A549 ואת הזרחן של AKT. באמצעות פרמקולוגיה של הרשת ותיקוף ניסיוני, אומת כי מסלול האיתות PI3K/AKT ממלא תפקיד חיוני בפעולה של Trichosanthes-Fritillaria thunbergii בטיפול באדנוקרצינומה של הריאות.

Introduction

סרטן ריאות מתייחס לגידולים ממאירים שמקורם ברירית הסימפונות של הריאה, כולל קרצינומה של תאי קשקש, אדנוקרצינומה, קרצינומה של תאים גדולים וקרצינומה של תאים קטנים1. אדנוקרצינומה של הריאות (LUAD) היא הסוג הנפוץ ביותר של סרטן ריאות, המהווה כ -40% מכלל מקרי סרטן הריאה2. רוב החולים מאובחנים בשלב מתקדם או שיש להם גרורות מרוחקות, ובכך מאבדים את ההזדמנות של ניתוח3. בטיפול הקליני הנוכחי, כימותרפיה במקביל היא האסטרטגיה הנפוצה ביותר לטיפול LUAD, אך היישום שלה מוגבל עקב תופעות לוואי חמורות4.

הרפואה הסינית המסורתית (TCM) יכולה להקל ביעילות על הסימפטומים הקליניים של חולי LUAD ולהפחית את התגובות השליליות הנגרמות על ידי הקרנות וכימותרפיה ובכך הפכה לנקודה חמה במחקר 5,6,7. ברפואה הסינית המסורתית, סרטן הריאה שייך לקטגוריה של "הצטברות ריאות" ו"פטרוס ריאתי". מחסור בצ'י והאינטראקציה של ליחה, קיפאון ורעל חשובים בפתוגנזה של סרטן ריאות. לכן, חיטוב הצ'י וסילוק ליחה וקיפאון הדם הם הטיפול הקליני העיקרי8 שיטות לסרטן ריאות על פי תיאוריית TCM9. Trichosanthes kirilowii מקסים (גואלו) ופריטילריה תונברגי מיק (Zhebeimu) מייצגים צמד תרופות נפוץ בטיפול בסרטן ריאות, ולשילוב זה יש השפעות של פינוי חום והפחתת ליחה10,11,12. עם זאת, מנגנון הפעולה שלה עדיין לא ברור, ויש צורך במחקר נוסף.

פרמקולוגיה רשתית היא שיטה מקיפה המבוססת על תורת הביולוגיה של מערכות ופרמקולוגיה רב-כיוונית שמטרתה לחשוף קשרי רשת מורכבים בין תרופות ומחלות מרובות13. מרשמים סיניים מסורתיים יש את המאפיינים של להיות multi-component ו multi-target, כלומר הם מתאימים מאוד לחקר פרמקולוגיה רשת14,15. לאחרונה, פרמקולוגיה ברשת התפתחה כגישה רבת עוצמה במחקר של נוסחאות TCM והפכה לנקודה חמה במחקר16,17.

עם זאת, למיטב ידיעתנו, כל המחקרים על פרמקולוגיה ברשת מוצגים כטקסט. הצגת טכנולוגיה זו באמצעות וידאו תפחית מאוד את סף הלמידה ותקל על קידום טכנולוגיה זו, שהיא אחד היתרונות של מאמר זה. במחקר זה, לקחנו Trichosanthes-Fritillaria thunbergii נגד אדנוקרצינומה ריאות כדוגמה לביצוע חיזוי פרמקולוגיה ברשת ותיקוף ניסיוני.

Protocol

כל ההליכים הפרמקולוגיים ברשת בוצעו בהתאם להנחיות לשיטות הערכה פרמקולוגיות רשת18. כל הליכי הניסוי בוצעו בהתאם לתקנות ניהול המעבדה של אוניברסיטת בייג'ינג לרפואה סינית.

1. חיזוי פרמקולוגי ברשת

  1. בחירת רכיבים פעילים
    1. פתח את מסד הנתונים של HERB (http://herb.ac.cn)19, והשתמש ב- "Gualou" (השם הסיני של Trichosanthes kirilowii Maxim) וב- "Zhebeimu" (השם הסיני של Bulbus Fritillariae thunbergii) כמילות מפתח להשגת המרכיבים של שתי התרופות. הורד את הרשימה ואת מבני החיוכים הקנוניים של המרכיבים הקשורים של שתי התרופות.
    2. קבע אם הרכיב המתקבל הוא הרכיב הפעיל.
      1. כלול כרכיבים פעילים את אלה שיש להם ערכים של זמינות ביולוגית פומית (OB) ודמויי תרופות (DL) במסד הנתונים של קבוצת HERB (כלומר, רכיבים עם OB ≥ 30% ו- DL ≥ 0.18)20,21.
      2. אם לרכיב אין ערכי OB ו- DL, הזן את הרכיב במסד הנתונים של ADME השוויצרי (http://www.swissadme.ch/index.php)22 כדי לקבל את המידע על כל רכיב. כלול רכיבים עם ספיגת GI "גבוהה" ולפחות שני ערכי DL "כן" כרכיבים פעילים.
  2. חיזוי יעד של הרכיבים הפעילים
    1. פתח את מסד הנתונים של HERB (http://herb.ac.cn). חפש והעתק את מבני החיוכים הקנוניים של הרכיבים הפעילים.
    2. פתח את מסד הנתונים SEA (Similarity ensemble approach, http://sea.bkslab.org)23. הדבק את מבני החיוכים הקנוניים של הרכיבים הפעילים בתיבת החיפוש, ולחץ על נסה SEA כדי להשיג את מפתח היעד, שם היעד, P-Value ו- MaxTC של כל רכיב פעיל.
    3. העתק את הנתונים לגיליון אלקטרוני והשתמש בפונקציית הסינון של קובץ הגיליון האלקטרוני כדי לסנן את יעדי הרכיבים הפעילים לפי מפתח יעד (Human, P < 0.05 ו- MaxTC > 0.5).
    4. העתק את כל המטרות לגיליון אלקטרוני, והסר את הכפילויות כדי להשיג את יעדי הסמים.
  3. חיזוי מטרות המחלה
    1. פתח את מסד הנתונים GeneCards (https://www.genecards.org)24 ואת מסד הנתונים המקוון של תורשה מנדליאנית באדם (OMIM, https://www.omim.org)25 והשתמש באדנוקרצינומה של הריאות כמילת המפתח להשגת יעדי המחלה של אדנוקרצינומה ריאתית.
    2. הורד את הגיליונות האלקטרוניים של יעדי המחלה. מחק את המטרות החוזרות כדי להשיג את יעדי LUAD.
  4. בניית רשת תרופות-רכיבים-מחלות-מטרה
    1. העתק את המטרות הקשורות ל- LUAD ואת יעדי התרופות לאותה עמודה בגיליון אלקטרוני חדש. השתמש בפונקציה Data - Identify Duplicates בסרגל הכלים כדי להשיג יעדי הצטלבות של יעדים הקשורים ל- LUAD ויעדים הקשורים לרכיבים פעילים Trichosanthes-Fritillaria thunbergii .
    2. פתח את Cytoscape 3.8.0. לחץ על קובץ בשורת התפריטים ולאחר מכן בחר ייבוא רשת > מקובץ כדי לייבא את קובץ הגיליון האלקטרוני. מטב את הגודל והצבע של צמתי הרשת דרך סרגל הסגנון בלוח הבקרה השמאלי.
    3. השתמש בפונקציה Analyze Network לניתוח טופולוגיית הרשת. לחץ על כלים בשורת התפריטים ולאחר מכן בחר נתח רשת. בחלונית טבלה , לחץ על תואר בפס הכותרת כדי לסדר את הרכיבים לפי מעלה בסדר יורד. קח את עשרת המרכיבים והיעדים המובילים כרכיבים הפעילים העיקריים ויעדי הליבה.
  5. בניית רשת PPI וסינון חלבוני הליבה
    1. פתח את מסד הנתונים STRING (https://cn.string-db.org/)26. הדבק את רשימת תבנית הטקסט של המטרות הפוטנציאליות של Trichosanthes-Fritillaria thunbergii כנגד LUAD בתיבת הדו-שיח רשימת שמות . בחר הומו ספיינס באורגניזמים, ולחץ על הלחצנים SEARCH > CONTINUE .
    2. כאשר התוצאות זמינות, לחץ על הגדרות וסמן ביטחון גבוה (0.700) בהגדרות בסיסיות > ציון האינטראקציה המינימלי הנדרש. סמן את הסתר צמתים מנותקים ברשת בהגדרות מתקדמות ולאחר מכן לחץ על הלחצן עדכן .
    3. לחץ על יצוא בשורת הכותרת והורד את הטקסט הטבלאי הקצר של קשר הגומלין PPI בפורמט TSV.
    4. פתח את Cytoscape 3.8.0. לחץ על קובץ > ייבוא רשת > מקובץ כדי לייבא את הקובץ בפורמט TSV לניתוח חזותי.
    5. השתמש בפונקציה Network Analyzer כדי לבצע את הניתוח הטופולוגי. מטב את הגודל והצבע של צמתי הרשת דרך סרגל הסגנון בלוח הבקרה השמאלי.
  6. ניתוח העשרה של KEGG
    1. פתח את פלטפורמת Metascape (https://metascape.org/)27. הדבק את רשימת פורמט הטקסט של המטרות הטיפוליות הפוטנציאליות בתיבת הדו-שיח ולאחר מכן לחץ על הלחצן שלח. סמן את H. sapiens הן בקלט כמינים והן בניתוח כמינים, ולאחר מכן לחץ על הלחצן ניתוח מותאם אישית. בחר העשרה, סמן רק את מסלול KEGG ולאחר מכן לחץ על ניתוח העשרה. לאחר שמד ההתקדמות מגיע ל-100%, לחץ על הכפתור הכתום של דף דוח הניתוח לקבלת תוצאות ההעשרה.
    2. לחץ על All in One Zip File להורדה של תוצאת ההעשרה, ולאחר מכן פתח את הקובץ _ FINAL_GO.csv בתיקייה Enrichment_GO כדי להשיג את התוצאה.
    3. פתח את תוכנת R (https://cran.r-project.org/). הקלד install.package ("ggplot2") וספריה (ggplot2) ב- R להתקנת חבילת ggplot2 R. הקש Enter כדי להפעיל את תוכנית התצוגה החזותית של KEGG.

2. אימות ניסיוני

  1. הכנת סמים
    הערה: Fritillaria thunbergii Miq ו - Trichosanthes kirilowii Maxim נרכשו מבית החולים Dongzhimen, המסונף לאוניברסיטת בייג'ינג לרפואה סינית.
    1. מערבבים 50 גרם של Fritillaria thunbergii Miq ו 50 גרם של Trichosanthes kirilowii מקסים יחד. השרו את התערובת בליטר אחד של מים מזוקקים למשך 20 דקות, ולאחר מכן רוקטו את התערובת בטמפרטורה של 100°C בלחץ רגיל למשך שעה אחת.
    2. סנן את מרתח כדי לקבל תסנין עם שכבה כפולה של גזה רפואית סטרילית, ולאחר מכן להשתמש נייר מסנן 80 מיקרומטר כדי לסנן עוד יותר את התמצית. חזור על הפעולה לעיל שלוש פעמים.
    3. מערבבים את התסנין יחד כדי לקבל כ 1.2 ליטר מרתח. מניחים את התמיסה בבקבוק של מאייד סיבובי. הגדר את מהירות הסיבוב ל 50 סל"ד עם טמפרטורה של 37 ° C. מערבבים ומעבים את המרתחים לתמצית במאייד הסיבובי במשך 6 שעות כדי להניב נוזל צמיג.
    4. הפעל את מנגנון ייבוש ההקפאה בוואקום כדי לקרר מראש את הטמפרטורה ל -40 מעלות צלזיוס. מכניסים את התמצית המתקבלת למגש החומר ומניחים אותה במלכודת הקרה להקפאה.
    5. כאשר טמפרטורת מלכודת הקור מגיעה ל -50 מעלות צלזיוס והחומר הוקפא למשך שעתיים, העבירו את החומרים הקפואים למדף ייבוש המונח במלכודת הקרה. הפעל את משאבת הוואקום כדי להתחיל את תהליך הליופיליזציה. הוציאו את האבקה המיובשת בהקפאה, ואחסנו אותה במקרר בטמפרטורה של 20°- לשימוש מאוחר יותר.
  2. טיפוח תאים
    1. הגדר מדיום DMEM שלם עם 89% DMEM בינוני בסיסי, 10% סרום בקר עוברי ו 1% פניצילין-סטרפטומיצין.
    2. לאחר הסרת תאי A549 מחנקן נוזלי, דוגרים על התאים באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס, ומערבבים עד שהתווך שבבקבוקון נמס.
    3. הוסף נפח פי ארבעה של מדיום DMEM שלם לתוך התאים המומסים. צנטריפוגות את התאים (4°C, 679 x g, 5 דקות), ומשליכים את הסופרנטנט.
    4. להשעות מחדש את התאים המושקעים עם 6 מ"ל של מדיום DMEM מלא, צלחת אותם בבקבוק תרבית T25, ולדגור את הבקבוק באינקובטור התא ב 37 ° C, 5% CO2.
  3. זיהוי כדאיות התא
    1. עיכול תאי A549 בשלב הגידול הלוגריתמי עם 1 מ"ל של 0.25% טריפסין למשך דקה אחת ב-37°C. הוסף 1 מ"ל של DMEM מדיום שלם כדי לנטרל את הטריפסין, ולנשוף אותו בעדינות כדי לקדם שפיכת תאים. צנטריפוגה את התערובת כדי לקבל את גלולת התא (4 ° C, 192 x גרם, 5 דקות). להשעות מחדש את התאים המתקבלים באמצעות מדיום DMEM מלא.
    2. הוסף את תרחיף התא להמוציטומטר, וספור באמצעות מונה תאים אוטומטי. לדלל אותו ל 5 x 104 תאים / מ"ל באמצעות מדיום DMEM מלא.
    3. יש להמיס 1 גרם של תמצית מים Trichosanthes-Fritillaria thunbergii בתמיסת PBS במינון 10 מ"ל, ולסנן-לעקר אותה דרך מסנן של 0.22 מיקרומטר. יש לדלל את התערובת ל-90 מ"ג/מ"ל, 80 מ"ג/מ"ל, 70 מ"ג/מ"ל, 60 מ"ג/מ"ל, 50 מ"ג/מ"ל, 40 מ"ג/מ"ל, 30 מ"ג/מ"ל, 20 מ"ג/מ"ל ו-10 מ"ג/מ"ל באמצעות PBS.
    4. צלחת את התאים מדוללים על צלחות 96 באר עם 100 μL לכל באר. לאחר היצמדות לתאים, יש להוסיף 1 μL של תמציות מים Trichosanthes-Fritillaria thunbergii בריכוזים שונים כדי להתאים את הריכוז של כל באר ל-900 מיקרוגרם/מ"ל, 800 מיקרוגרם/מ"ל, 700 מיקרוגרם/מ"ל, 600 מיקרוגרם/מ"ל, 500 מיקרוגרם/מ"ל, 400 מיקרוגרם/מ"ל, 300 מיקרוגרם/מ"ל, 200 מיקרוגרם/מ"ל ו-100 מק"ג/מ"ל.
    5. יש להשליך את התווך המקורי לאחר 24 שעות של תרבית, ולהוסיף 100 μL של מדיום בסיסי DMEM לדגירה נוספת למשך שעתיים ב-37°C, 5% CO2.
    6. לאחר הטיפול הנ"ל, הוסף 20 μL של תמיסת MTS (טבלה של חומרים), ודגר על התאים עוד 1 שעה ב 37 ° C, 5% CO2.
    7. מעבירים את התערובת המודגרת לצלחת אחרת. מדוד את הבליעה (OD) באורך גל של 490 ננומטר באמצעות קורא מיקרו-לוחות. חשב את כדאיות התא באמצעות הנוסחה הבאה:
      כדאיות (%) = 100 × (OD של המדגם המטופל - OD של המדיום)/(OD של מדגם הבקרה - OD של המדיום).
      הערה: ריכוז מינימלי קרוב ל- IC50 מוגדר כמינון גבוה. הריכוז שבו מתחילה התרבות התאים להיות מעוכבת מוגדר כריכוז במינון נמוך, וערך הביניים מוגדר כריכוז במינון בינוני למחקרים ניסיוניים עוקבים. במחקר זה, 400 מיקרוגרם/מ"ל, 600 מיקרוגרם/מ"ל ו-800 מיקרוגרם/מ"ל שימשו כמינונים נמוכים, בינוניים וגבוהים.
  4. התערבות בתרופות ואיסוף דגימות
    הערה: צמיחת התאים תוכננה כנגד הזמן כדי לקבוע את שלב היומן.
    1. לדלל את תאי שלב הגידול הלוגריתמי A549 ל 5 x 105 תאים / מ"ל. מוסיפים 2 מ"ל של תרחיף התא לצלחת 6 בארות, וגדלים במשך 12 שעות.
    2. חזור על שלב 2.3.3 כדי לקבל 80 מ"ג/מ"ל, 60 מ"ג/מ"ל ו-40 מ"ג/מ"ל PBS דילול של תמצית מים Trichosanthes-Fritillaria thunbergii. הוסף 20 μL של תמיסת PBS, 20 μL של 40 מ"ג / מ"ל Trichosanthes-Fritillaria thunbergii מים לחלץ, 20 μL של 60 מ"ג / מ"ל Trichosanthes-Fritillaria thunbergii מים לחלץ, ו 20 μL של 80 מ"ג / מ"ל Trichosanthes-Fritillaria thunbergii מים לחלץ מים ריק, קבוצת ריכוז נמוך, קבוצת ריכוז בינוני, וקבוצת ריכוז גבוה, בהתאמה. השליכו את הסופרנאטנט לאחר 24 שעות של התערבות, ונקו את התאים עם PBS שלוש פעמים.
      הערה: הריכוזים של קבוצת הביקורת הריקה, קבוצת הריכוז הנמוך, קבוצת הריכוז הבינוני וקבוצת הריכוז הגבוה של תמצית המים Trichosanthes-Fritillaria thunbergii היו 0 מיקרוגרם/מ"ל, 400 מיקרוגרם/מ"ל, 600 מק"ג/מ"ל ו-800 מק"ג/מ"ל, בהתאמה.
    3. הוסף 250 μL של חיץ RIPA (המכיל 1% PMSF ו 1% מעכב phosphatase) לכל באר, ו lyse את התאים במשך 30 דקות. אספו את הליזט לצנטריפוגה (4°C, 6,714 x g, 10 דקות), והשיגו את הסופרנטנט.
  5. כתם מערבי
    1. איתור ריכוז החלבון של הדגימות בשיטת BCA בהתאם להוראות היצרן. השתמש במאגר RIPA כדי להתאים את הריכוז של כל דגימה כך שיהיה עקבי.
    2. יש לערבב 40 μL של דגימת החלבון עם 10 μL של מאגר העמסה פי 5, ולהרתיח במשך 5 דקות בטמפרטורה של 100°C. צנטריפוגה (4°C, 6,714 x g, 10 דקות) התערובת כדי להשיג את הסופרנאטנט לניסויים הבאים.
    3. בודד את החלבונים על ידי אלקטרופורזה ג'ל באמצעות אלקטרופורזה אנכית 120 V.
    4. הכינו "כריך" חשמלי (ספוג - נייר סינון - ג'ל - קרום PVDF - נייר סינון - ספוג). השרו את מנגנון ההעברה באמבט קרח, והעבירו את החלבון לקרומי PVDF במתח של 70 וולט למשך 60 דקות.
    5. השתמש 100 מ"ל של תמיסת TBST (0.05% [v/v] Tween-20, 10 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7.5) ו 5 גרם של אבקת חלב דל שומן כדי להגדיר 5% חלב. לדלל מראש את נוגדני AKT ו- p-AKT עם דילול הנוגדנים ביחס של 1:1,000.
    6. יש לחסום את קרום PVDF באבקת חלב דל שומן 5% למשך שעה אחת עם טלטול. לאחר החסימה, יש להשליך את החלב החוסם, ולהוסיף את הנוגדן הראשוני המדולל לדגירה של לילה בטמפרטורה של 4°C.
    7. לאחר הסרת הנוגדן הראשוני, השתמש בתמיסת TBST כדי לשטוף את קרום PVDF חמש פעמים במשך 5 דקות כל אחת.
    8. לדלל מראש את הנוגדן המשני עם הנוגדן מדלל ביחס של 1:5,000. מוסיפים את הנוגדן המשני, ודגרים בטמפרטורת החדר (RT) למשך שעה וחצי. לאחר הסרת הנוגדן המשני, השתמש בתמיסת TBST כדי לשטוף את קרום PVDF חמש פעמים במשך 5 דקות כל אחת.
    9. זהה את החלבון באמצעות מערכת זיהוי כימילומינסנציה.

3. עגינה מולקולרית

  1. פתח את מסד הנתונים של UniProt (https://www.uniprot.org)28. הקלד את סמלי היעד בתיבת החיפוש ולחץ על כפתור החיפוש . בכותרת המשנה מבנה , לחץ על הורד עבור המבנים התלת-ממדיים של מטרות החלבון.
  2. פתח את מסד הנתונים RCSB PDB (https://www.rcsb.org/pdb/home/sitemap.do)29. הקלד את שם מקרומולקולות החלבון בתיבת החיפוש. הורד את מבני מקרומולקולת החלבון בתבנית PDB.
  3. הורד את חבילת ההתקנה של תוכנת UCSF Chimera 1.16 (https://vina.scripps.edu/) ו- AutoDock Vina (https://vina.scripps.edu/). התקן ופתח את תוכנת UCSF Chimera 1.16. לחץ על File > Open כדי להציג את חלבון הקולטן.
  4. לחץ על כלים > עריכת מבנה > Dock Prep, וסמן מחק ממס, הוסף מימן והוסף חיובים בחלון הקופץ כדי להסיר מים ולהוסיף הידרוגנציה ולאזן חיובים. לחץ על כתוב קובץ Mol2 כדי לשמור את חלבון הקולטן בפורמט mol2. בצע את אותו שלב על הליגנד.
  5. לחץ על File > Open כדי להציג את הליגנד בפורמט mol2 בתוכנת UCSF Chimera 1.16. ב- Tools > Surface/Binding Analysis >- AutoDock Vina, הגדר את סרגל הקולטן לשם חלבון הקולטן ואת סרגל הליגנד לשם הליגנד. הזן ערך בתיבה מאחורי מרכז וגודל כדי להתאים את המרחב החדש שפותח, כך שתאפשר להקיף באופן מלא את הליגנד ואת הקולטן.
  6. לחץ על אישור לסריקה וירטואלית של עגינה מולקולרית כדי לקבל את המיקום האופטימלי לקשירת ליגנד לקולטן. רשום את ערך האנרגיה המחייבת במיקום האופטימלי.

4. ניתוח סטטיסטי

  1. פתח תוכנה סטטיסטית SPSS 26.0. לחץ על קובץ > ייבוא נתונים לטעינת נתונים.
  2. להציג את נתוני הניסוי כממוצע ± סטיית תקן.
  3. השווה בין קבוצות מרובות באמצעות ANOVA חד-כיוונית.
    הערה: P < 0.05 נחשב מובהק סטטיסטית בעבודה זו.

תוצאות

סה"כ זוהו 31 רכיבים פעילים הקשורים ל-Trichosanthes-Fritillaria thunbergii, כולל 21 Trichosanthes ו-10 Fritillaria thunbergia, כמו גם 144 מטרות מקבילות. בסך הכל, 9,049 ו-67 גנים הקשורים ל-LUAD הופקו ממסד הנתונים GeneCards וממסד הנתונים OMIM, בהתאמה. לאחר מחיקת גנים כפולים, זוהו 9,057 גנים הקשורים ל-LUAD. ההצטלבות של הגנים הקשורים ללו?...

Discussion

באופן כללי, מחקר פרמקולוגי רשת שלם כולל זיהוי רכיבים פעילים ממאגרי מידע, רכישת מטרות המתאימות לרכיבים פעילים ומחלות, בניית רשת מטרה-רכיב-מחלה-תרופה, וחיזוי מטרות ומסלולי ליבה. הקשר בין רכיבים פעילים לחלבוני ליבה (עגינה מולקולרית) נחזה באופן ראשוני על ידי טכנולוגיית המחשב, והאימות הסופי מת?...

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר.

Acknowledgements

מחקר זה נתמך על ידי תוכנית ההכשרה לחדשנות של אוניברסיטת בייג'ינג לרפואה סינית (No: 202110026036).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.25% trypsin-EDTAGibcoR001100
A549 cell lineProcellCL-0016
AKT antibodyCST4691S
BCA Protein Assay KitSolarbioPC0020
Chemiluminescence detection systemShanghai Qinxiang Scientific Instrument FactoryChemiScope 6100
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM)Solarbio11995
Enhanced chemiluminescence (ECL) kit ABclonalRM00021
Fetal bovine serumScienCell0025
HRP Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)ABclonalAS014
MTS assay kitPromegaG3580
p-AKT antibodyCST6040S
Penicillin streptomycinGibcoC14-15070-063
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)SolarbioP0100
Phosphatase inhibitorBeyotimeP1081
Phosphate buffered saline (PBS)SolarbioP1020
Polyvinylidene difluoride (PVDF) membranesMilliporeISEQ00010
RIPA lysis solutionSolarbioR0010
Rotary evaporatorShanghai Yarong Biochemical Instrument FactoryRE52CS-1
Vacuum freeze-drying mechanismNingbo Scientz BiotechnologySCIENTZ-10
β-Actin antibodyABclonalAC026

References

  1. Thai, A. A., Solomon, B. J., Sequist, L. V., Gainor, J. F., Heist, R. S. Lung cancer. The Lancet. 398 (10299), 535-554 (2021).
  2. Sinha, A., et al. Early-stage lung adenocarcinoma MDM2 genomic amplification predicts clinical outcome and response to targeted therapy. Cancers. 14 (3), 708 (2022).
  3. Howlader, N., et al. The effect of advances in lung-cancer treatment on population mortality. The New England Journal of Medicine. 383 (7), 640-649 (2020).
  4. Hirsch, F. R., et al. Lung cancer: Current therapies and new targeted treatments. The Lancet. 389 (10066), 299-311 (2017).
  5. Liu, J., et al. Comprehensive treatment with Chinese medicine in patients with advanced non-small cell lung cancer: A multicenter, prospective, cohort study. Chinese Journal of Integrative Medicine. 23 (10), 733-739 (2016).
  6. Xiao, Z. W., et al. Comprehensive TCM treatments combined with chemotherapy for advanced non-small cell lung cancer: A randomized, controlled trial. Medicine. 100 (18), 25690 (2021).
  7. Li, Y., et al. Effectiveness of traditional Chinese medicine on chemoradiotherapy induced leukaemia in patients with lung cancer: A meta-analysis. Journal of Traditional Chinese Medicine. 38 (5), 661-667 (2018).
  8. Yuan, F., et al. Therapeutic effect and apoptosis mechanism of lung-tonifying and expectorant decoction on lung cancer rats with Qi deficiency and blood stasis. Asian Pacific Journal of Tropical Medicine. 8 (11), 983-988 (2015).
  9. Zhang, Y. L., Liang, Y. E., He, C. W. Anticancer activities and mechanisms of heat-clearing and detoxicating traditional Chinese herbal medicine. Chinese Medicine. 12, 20 (2017).
  10. Wang, T. B., et al. Exploring the rules of application of RONG Yuan-ming in the treatment of non-small cell lung cancer. Guiding Journal of Traditional Chinese Medicine and Pharmacy. 25 (14), 22-25 (2019).
  11. Chen, T. T., Wang, Y., Tian, T. Medication regularity and mechanism of traditional Chinese medicine in treating lung cancer. Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae. 24 (11), 206-210 (2018).
  12. Shen, C. J. Analysis of the rule of Chinese medicine in treating lung cancer. Journal of Shandong University of Traditional Chinese Medicine. 35 (2), 127-129 (2011).
  13. Yang, X. Y., et al. Evidence-based complementary and alternative medicine bioinformatics approach through network pharmacology and molecular docking to determine the molecular mechanisms of Erjing pill in Alzheimer's disease. Experimental and Therapeutic Medicine. 22 (5), 1252 (2021).
  14. Chen, G. Y., et al. Network pharmacology analysis and experimental validation to investigate the mechanism of total flavonoids of Rhizoma Drynariae in treating rheumatoid arthritis. Drug Design Development and Therapy. 16, 1743-1766 (2022).
  15. Chen, G. Y., et al. Integrating network pharmacology and experimental validation to explore the key mechanism of Gubitong recipe in the treatment of osteoarthritis. Computational and Mathematical Methods in Medicine. 2022, 7858925 (2022).
  16. Xie, G. G., et al. A network pharmacology analysis to explore the effect of Astragali Radix-Radix Angelica Sinensis on traumatic brain injury. BioMed Research International. 2018, 3951783 (2018).
  17. Chen, G. Y., et al. Prediction of Rhizoma Drynariae targets in the treatment of osteoarthritis based on network pharmacology and experimental verification. Evidence Based Complementary and Alternative Medicine. 2021, 5233462 (2021).
  18. World Federation of Chinese Medicine Societies. Network pharmacology evaluation methodology guidance. World Chinese Medicine. 16 (4), 527-532 (2021).
  19. Fang, S. S., et al. A high-throughput experiment- and reference-guided database of traditional Chinese medicine. Nucleic Acids Research. 49, 1197-1206 (2021).
  20. Chen, G. Y., et al. Network pharmacology-based strategy to investigate the mechanisms of Cibotium barometz in treating osteoarthritis. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2022, 1826299 (2022).
  21. Yu, J. H., et al. ZiYinHuaTan recipe inhibits cell proliferation and promotes apoptosis in gastric cancer by suppressing PI3K/AKT pathway. BioMed Research International. 2020, 2018162 (2020).
  22. Daina, A., Michielin, O., Zoete, V. SwissADME: A free web tool to evaluate pharmacokinetics, drug-likeness and medicinal chemistry friendliness of small molecules. Scientific Reports. 7, 42717 (2017).
  23. Keiser, M. J., et al. Relating protein pharmacology by ligand chemistry. Nature Biotechnology. 25 (2), 197-206 (2007).
  24. Safran, M., et al. GeneCards Version 3: The human gene integrator. Database. 2010, (2010).
  25. Amberger, J. S., Hamosh, A. Searching Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM): A knowledgebase of human genes and genetic phenotypes. Current Protocols in Bioinformatics. 58, 1-12 (2017).
  26. Mering, C. V., et al. STRING: Known and predicted protein-protein associations, integrated and transferred across organisms. Nucleic Acids Research. 33, 433-437 (2005).
  27. Zhou, Y. Y., et al. Metascape provides a biologist-oriented resource for the analysis of systems-level datasets. Nature Communications. 10, 1523 (2019).
  28. Pundir, S., et al. UniProt protein knowledgebase. Methods in Molecular Biology. 1558, 41-55 (2017).
  29. Burley, S. K., et al. Protein data bank (PDB): The single global macromolecular structure archive. Methods in Molecular Biology. 1607, 627-641 (2017).
  30. Welsh, L. C., Welsh, M. VEGFA and tumour angiogenesis. Journal of Internal Medicine. 273 (2), 114-127 (2013).
  31. Hsu, L. H., Chu, N. M., Kao, S. H. Estrogen, estrogen receptor and lung cancer. International Journal of Molecular Sciences. 18 (8), 1713 (2017).
  32. Atmaca, A., et al. SNAI2/SLUG and estrogen receptor mRNA expression are inversely correlated and prognostic of patient outcome in metastatic non-small cell lung cancer. BMC Cancer. 15, 300 (2015).
  33. Lakshmi, S. P., Reddy, A. T., Banno, A., Reddy, R. C. PPAR agonists for the prevention and treatment of lung cancer. PPAR Research. 2017, 8252796 (2017).
  34. Oguro, A., Sakamoto, K., Funae, Y., Imaoka, S. Overexpression of CYP3A4, but not of CYP2D6, promotes hypoxic response and cell growth of Hep3B cells. Drug Metabolism and Pharmacokinetics. 26 (4), 407-415 (2011).
  35. Jamroze, A., Chatta, G., Tang, D. G. Androgen receptor (AR) heterogeneity in prostate cancer and therapy resistance. Cancer Letters. 518, 1-9 (2021).
  36. Wu, Y. I., et al. Regulation of global gene expression and cell proliferation by APP. Scientific Reports. 6, 22460 (2016).
  37. Sedlář, A., et al. Growth factors VEGF-A 165 and FGF-2 as multifunctional biomolecules governing cell adhesion and proliferation. International Journal of Molecular Sciences. 22 (4), 1843 (2021).
  38. Guo, L. H., Yin, M., Wang, Y. X. CREB1, a direct target of miR-122, promotes cell proliferation and invasion in bladder cancer. Oncology Letters. 16 (3), 3842-3848 (2018).
  39. Wang, D. D., et al. Induction of CYP1A1 increases gefitinib-induced oxidative stress and apoptosis in A549 cells. Toxicology In Vitro. 44, 36-43 (2017).
  40. Tan, A. C. Targeting the PI3K/Akt/mTOR pathway in non-small cell lung cancer (NSCLC). Thoracic Cancer. 11 (3), 511-518 (2020).
  41. Jin, X., et al. RBM10 inhibits cell proliferation of lung adenocarcinoma via RAP1/AKT/CREB signalling pathway. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (6), 3897-3904 (2019).
  42. Henkels, K. M., et al. Phospholipase D (PLD) drives cell invasion, tumor growth and metastasis in a human breast cancer xenograph model. Oncogene. 32 (49), 5551-5562 (2013).
  43. Zhang, Z. Y., et al. CircRNA_101237 promotes NSCLC progression via the miRNA-490-3p/MAPK1 axis. Scientific Reports. 10, 490-493 (2020).
  44. Gao, T. X., et al. Exploring the mechanism of Fu-Zi Decoction in treatment of chronic heart failure based on network pharmacology and molecular docking technology. Journal of Chinese Pharmaceutical Sciences. 30 (09), 705-715 (2021).
  45. Wang, B., et al. PP4C facilitates lung cancer proliferation and inhibits apoptosis via activating MAPK/ERK pathway. Pathology, Research and Practice. 216 (5), 152910 (2020).
  46. Moon, M. Y., et al. Rap1 regulates hepatic stellate cell migration through the modulation of RhoA activity in response to TGF-β1. International Journal of Molecular Medicine. 44 (2), 491-502 (2019).
  47. Kan, J., et al. He-Chan Pian inhibits the metastasis of non-small cell lung cancer via the miR-205-5p-mediated regulation of the GREM1/Rap1 signaling pathway. Phytomedicine. 94, 153821 (2022).
  48. Sidrat, T., et al. Role of Wnt signaling during in-vitro bovine blastocyst development and maturation in synergism with PPARδ signaling. Cells. 9 (4), 923 (2020).
  49. Wagner, N., Wagner, K. D. PPAR beta/delta and the hallmarks of cancer. Cells. 9 (5), 1133 (2020).
  50. Miriam, M., et al. PI3K/AKT signaling pathway and cancer: An updated review. Annals of Medicine. 46 (6), 372-383 (2014).
  51. Ma, X. L., et al. CD73 promotes hepatocellular carcinoma progression and metastasis via activating PI3K/AKT signaling by inducing Rap1-mediated membrane localization of P110β and predicts poor prognosis. Journal of Hematology & Oncology. 12 (1), 37 (2019).
  52. Li, T., et al. Pomegranate flower extract bidirectionally regulates the proliferation, differentiation and apoptosis of 3T3-L1 cells through regulation of PPARγ expression mediated by PI3K-AKT signaling pathway. Biomedicine & Pharmacotherapy. 131, 110769 (2020).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE193Trichosanthes kirilowii MaximFritillaria thunbergii MiqPI3K AKT

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved