JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול זה מציג את השימוש ב-CRISPR SunTag-p65-HSF1 (SPH) באדיפוציטים (AdipoSPH) כאסטרטגיה חלופית לווירוס הקשור לאדנו (AAV) לחקר ביולוגיה של שומן בז'. הזרקת In vivo של sgRNA נושא AAV המכוונת לגן האנדוגני Prdm16 מספיקה כדי לגרום להתפתחות שומן בז' ולשפר את תוכנית הגן התרמוגני.

Abstract

טכנולוגיית CRISPR (ראשי תיבות של Clustered regular interspaced short palindromic repeats) חוללה מהפכה בביולוגיה, וכלים עדכניים יושמו הרבה מעבר לעריכה הגנטית שתוארה במקור. מערכת הפעלת CRISPR (CRISPRa) משלבת את חלבון Cas9 (dCas9) הבלתי פעיל קטליטית עם מודולי שעתוק נפרדים כדי לגרום לביטוי גנים אנדוגניים. SunTag-p65-HSF1 (SPH) היא טכנולוגיית CRISPRa שפותחה לאחרונה המשלבת רכיבים של מתווכי הפעלה סינרגטיים (SAMs) עם מפעילי SunTag. מערכת זו מאפשרת ביטוי יתר של גנים בודדים או מרובים על ידי תכנון RNA חד-מנחה מותאם אישית (sgRNA). במחקר זה, עכבר SPH שפותח בעבר שימש ליצירת עכבר מותנה המבטא SPH באדיפוציטים (שושלת adiponectin Cre), בשם AdipoSPH. כדי לגרום לפנוטיפ שומן לבן עד בז' (השחמה), הוזרק וירוס הקשור לאדנו (AAV) הנושא sgRNA המכוון לגן האנדוגני Prdm16 (גורם שעתוק מבוסס היטב הקשור להתפתחות שומן חום ובז') לרקמת השומן הלבן המפשעה (iWAT). מודל עכבר זה גרם לביטוי של Prdm16 אנדוגני והפעיל את תוכנית הגן התרמוגני. יתר על כן, ביטוי יתר של Prdm16 המושרה על ידי SPH במבחנה שיפר את צריכת החמצן של אדיפוציטים בצבע בז', פנוסקופיה של התוצאות של מודל עכבר מהונדס קודם של Prdm16. לפיכך, פרוטוקול זה מתאר מודל עכבר רב-תכליתי, חסכוני וחסכוני בזמן לחקר ביולוגיה של רקמת שומן.

Introduction

אדיפוציטים בצבע בז' (או בריט) הם אדיפוציטים המבטאים חלבון 1 (UCP1) ועשירים במיטוכונדריה השוכנים במחסני רקמת השומן הלבנה (WAT). שומן בז' יוצא מתת-קבוצה של אבות אדיפוציטים או אדיפוציטים לבנים בוגרים בתגובה לחשיפה לקור ולגירויים אחרים 1,2. אדיפוציטים בצבע בז' יכולים להמיר אנרגיה לחום באופן תלוי UCP1 או עצמאי3. ללא קשר לתפקוד התרמוגני, שומן בז 'יכול גם לשפר את הבריאות המטבולית באמצעים אחרים, כגון הפרשת אדיפוקינים ופעילויות אנטי דלקתיות ואנטי פיברוטיות. מחקרים בעכברים ובבני אדם הראו כי השראת שומן בז' משפרת את רמת הגלוקוז בכל הגוף ואת הומאוסטזיס השומנים3. עם זאת, למרות שהידע שלנו על ביולוגיה של שומן בז' התפתח במהירות בשנים האחרונות, רוב היתרונות המטבוליים שלו והמנגנונים הקשורים אליו עדיין אינם מובנים במלואם.

חזרות פלינדרומיות קצרות מקובצות במרווחים קבועים (CRISPR) תוארו לראשונה בתאים איקריוטים ככלי המסוגל ליצור שבר דו-גדילי (DSB) באתר מסוים בגנום באמצעות פעילות הנוקלאז של חלבון Cas9 4,5. Cas9 מונחה על ידי RNA סינתטי חד-מנחה (sgRNA) כדי להתמקד באזור גנומי מסוים, מה שמוביל ל-DNA DSB. בנוסף לשימוש בנוקלאז Cas9 למטרות עריכה, טכנולוגיית CRISPR-Cas9 התפתחה לשימוש ככלי לוויסות גנים ספציפילרצף 6. הפיתוח של חלבון Cas9 לא פעיל קטליטית (dCas9) והקשר של מודולי שעתוק המסוגלים לשפר ביטוי גנים הולידו כלי הפעלת CRISPR (CRISPRa). מספר מערכות CRISPRa התפתחו, כגון VP647,8, מתווך הפעלה סינרגטית (SAM)9, SunTag10,11, VPR12,13 ו-SunTag-p65-HSF1 (SPH)14, המשלב את הרכיבים של מפעילי SAM ו-SunTag. לאחרונה הוכח כי הביטוי המושרה של גנים נוירוגניים בנוירובלסטים N2a ובאסטרוציטים ראשוניים גבוה יותר באמצעות SPH בהשוואה למערכות CRISPRaאחרות 14, מה שמדגים SPH ככלי CRISPRa מבטיח.

כאן, ניצלנו עכבר SPH14 שפותח בעבר כדי ליצור מודל עכבר מותנה המבטא SPH במיוחד באדיפוציטים באמצעות שושלת אדיפונקטין Cre (AdipoSPH). באמצעות וירוס הקשור לאדנו (AAV) הנושא את ה-gRNA המכוון לגן האנדוגני Prdm16, השחמה (המרה מלבן לבז') של WAT מפשעתי (iWAT) הושרה כדי להגביר את הביטוי של תוכנית הגנים התרמוגניים. יתר על כן, ביטוי יתר של Prdm16 במבחנה שיפר את צריכת החמצן. לכן, פרוטוקול זה מספק מודל עכבר SPH רב-תכליתי לחקר מנגנוני התפתחות שומן בז' ברקמת השומן.

Protocol

מחקרים בבעלי חיים בוצעו בהתאם למדריך אוניברסיטת קמפינאס לטיפול ושימוש בחיות מעבדה (פרוטוקול CEUA #5810-1/2021).

1. שיבוט מולקולרי

  1. תכנון רנ"א מנחה יחיד (sgRNAs)
    1. תכנן sgRNA להפעלת CRISPR באמצעות CHOPCHOP, הזמין ב- https://chopchop.cbu.uib.no/, או כל כלי מתאים אחר. השתמש בפרמטרים הבאים כדי לתכנן sgRNA המכוון לגן Prdm16: יעד: Prdm16; בתוך: Mus musculus; שימוש: Crispr/Cas9; עבור: הפעלה.
      הערה: תכנן sgRNA עבור כל אזור עניין המתפרש על פני אזור 200 bp במעלה הזרם של התחלת תמלול (TSS). לדוגמה, sgRNA המכוון Prdm16 המשמש במחקר זה קושר 154 bp במעלה הזרם של TSS.
    2. הוסף שלוחות ל-sgRNA כך שיתאימו לאתר הגבלת SacI בעמוד השדרה הווקטורי pAAV-U6-gRNA-CBh-mCherry (ראה טבלת חומרים). כולל: 5'- (N20)AGCT-3' (N = נוקלאוטידים). לדוגמה, הרצף המכוון לגן Prdm16 הוא 5'- CGAGCTGCGCTGAAAAAGGGG-3', ועם שלוחות הוא 5'- CGAGCTGCGCTGAAAAGGGGAGCT-3'.
    3. השג את רצף המשלים ההפוך sgRNA 3' באמצעות הכלי הזמין ב- https://arep.med.harvard.edu/labgc/adnan/projects/Utilities/revcomp.html. לדוגמה, רצף sgRNA 3' המכוון לגן Prdm16 הוא 3'- TCGAGCTCGACGCGACTTTTTCCCC-5'.
  2. חישול אוליגונוקלאוטידים משלימים חד-גדיליים
    1. הוסף 1 μL מכל אוליגונוקלאוטיד חד-גדילי 5' ו-3' (ריכוז מלאי: 100 μM), 1 μL של חיץ ליגאז T4, 0.5 μL של T4 polynucleotide kinase (PNK) (1 × 104 יחידות/מ"ל), ו-6.5 μL של H2O לנפח תגובה סופי של 10 μL. אנאל את האוליגונוקלאוטידים החד-גדיליים המשלימים באמצעות תרמוסייקלר בתנאים הבאים: 37°C למשך 30°C ו-95°C למשך 5 דקות, ולאחר מכן קצב ירידה של 5°C/min.
      הערה: האנזים PNK מסופק עם מאגר PNK ואינו מכיל מספיק ATP הדרוש לתגובת הזרחן (ראה טבלת חומרים). כדי לפשט את התגובה, השתמש במאגר ליגאז T4 (במקום במאגר PNK). חיץ ליגאז T4 מספק את הכמות המתאימה (1 mM ATP) של פוספט לתגובת הזרחון. אנזים PNK מספק זרחן סופי של 5' של אוליגונוקלאוטידים לתגובת הקשירה שלאחר מכן.
  3. קשירה של אוליגונוקלאוטידים sgRNA מחושלים
    1. הוסף 25 ng של פלסמיד pAAV-U6-gRNA-CBh-mCherry ל-2 μL של אוליגונוקלאוטידים sgRNA מחושלים, 1 μL של אנזים SacI, 2 μL של 10x T4 DNA ligase buffer, 1 μL של T4 DNA ligase (1-3 u/μL) (ראה טבלת חומרים), ו-H2O לנפח תגובה סופי של 10 μL.
    2. בצע קשירה על ידי דגירה של תערובת התגובה באמצעות thermocycler בתנאים הבאים: 15 מחזורים של 37 ° C במשך 5 דקות ו 25 ° C במשך 5 דקות, ולאחר מכן להחזיק ב 4 ° C.
  4. טרנספורמציה ואחריה תגובת שרשרת פולימראז מושבה (PCR)
    1. הפוך את תאי E. coli DH10B המוסמכים (ראה טבלת חומרים) עם 4 μL של מוצר הקשירה באמצעות שוק חום (42 ° C עבור 45 שניות) ולהפיץ על צלחת אגר המכיל 100 מיקרוגרם / מ"ל אמפיצילין.
    2. אשר מושבות שעברו טרנספורמציה לפי PCR מושבה באמצעות תערובת האב PCR (ראה טבלת חומרים). בחר את המושבה וערבב עם 5 μL של תערובת מאסטר, 0.1 μL של פריימר אוניברסלי (ריכוז מלאי: 100 μM), 0.1 μL של פריימר הפוך sgRNA (ריכוז מלאי: 100 μM) (טבלה 1), ו 5 μL של H 2 O. הפעל את ה- PCR באמצעות thermocycler בתנאים הבאים: דנטורציה ראשונית (94 ° C למשך2דקות), לאחר מכן 35 מחזורים של דנטורציה (94 ° C עבור 20 שניות), חישול (60 ° C עבור 30 שניות), הארכה (72 ° C עבור 30 שניות), ושלב התארכות סופי (72 ° C במשך 5 דקות). פתור את ה- DNA באמצעות אלקטרופורזה ג'ל אגרוז (1.5%) במאגר 0.5x TAE במתח של 90 וולט למשך 30 דקות.
      הערה: שיבוטים חיוביים נותנים להקה של ~280 bp.
    3. שלח דוגמאות חיוביות לריצוף Sanger באמצעות פריימר אוניברסלי (טבלה 1, קובץ משלים 1).
  5. טיהור פלסמיד
    1. לטהר את הפלסמיד משיבוט חיובי באמצעות ערכת טיהור פלסמיד (ראה טבלת חומרים), בהתאם להוראות היצרן.
      הערה: לטהר את הפלסמיד באמצעות שרף החלפת אניון או ערכה אחרת המתאימה לשימוש בהעברת תאים.
    2. לדגור על השיבוט החיובי (12 שעות ב-37°C עם טלטול ב-200 סל"ד) באמצעות מדיום גידול חיידקים סטנדרטי המכיל 100 מיקרוגרם/מ"ל אמפיצילין.
    3. צנטריפוגה את תאי החיידק ב 6,000 × גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C. בצע את השלבים הבאים בהתאם להוראות הערכה של היצרן.

2. אריזת AAV

הערה: אריזות AAV בוצעו על פי פרסומים קודמים15,16 עם שינויים קלים.

  1. צלחת 293T תאים (ראה טבלת חומרים) בבקבוק2 בגודל 175 ס"מ (זריעה 5 × 106 תאים לצלוחית) באמצעות 25 מ"ל של מדיום הנשר המעובד של דולבקו (DMEM) המכיל 10% נסיוב בקר עוברי (FBS) ו-1% פניצילין/סטרפטומיצין (P/S). יש לדגור בטמפרטורה של 37°C, 5%CO2 ו-95% לחות עד שהתאים מגיעים למפגש של 50%-70%.
  2. יש לערבב 14 μL של פוליאתילנימין (1 מיקרוגרם/μL) עם 1 מ"ל של 150 mM NaCl. ערבבו את שלושת הפלסמידים הדרושים לייצור AAV ביחס מולארי של 1:1:1 (כלומר, 17.7 מיקרוגרם של pAdDeltaF6, 7.9 מיקרוגרם של AAV2/8 (ראו טבלת חומרים), ו-5.9 מיקרוגרם של sgRNA משובט משלב 1 ב-1 מ"ל של 150 מילימטר NaCl. מעבירים את הפוליאתילנימין:תערובת NaCl טיפה אחר טיפה לצינור המכיל את ה- DNA (תערובת של פלסמידים) ודגרים במשך 20 דקות ב 25 מעלות צלזיוס.
    הערה: pAdDeltaF6 הוא פלסמיד עוזר ו-pCapsid pAAV2/8 הוא פלסמיד אריזה המבטא שכפול (Rep) וקפסיד (capsid) גנים. שני פלסמידים נחוצים לייצור AAV.
  3. לפני הטרנספקציה, להחליף את מדיום גידול התאים עם 18 מ"ל של DMEM המכיל 1% FBS ו L-alanyl-L-גלוטמין (0.5 גרם / ליטר). הוסף 2 מ"ל של תערובת פוליאתילנימין:DNA לכל בקבוק תרבית ודגר על התאים באינקובטור CO 2 (37 ° C, 5% CO2, 95% לחות).
  4. לאחר 5 שעות, להוסיף 5 מ"ל של DMEM בתוספת 10% FBS ו- L-alanyl-L-גלוטמין (0.5g / L).
  5. לאחר 3 ימי דגירה, מנתקים את התאים מבקבוק התרבית באמצעות מגרד תאים. אספו את תאי 293T מ-10 (175 ס"מ2) צלוחיות תרבית תאים לתוך צינורות חרוטיים של 50 מ"ל והוסיפו DMEM (ראו טבלת חומרים) עד 30 מ"ל.
  6. מוסיפים 3 מ"ל כלורופורם לכל צינור חרוטי 50 מ"ל המכיל את תאי 293T ומערבבים באמצעות מערבל מערבולת במהירות גבוהה במשך 5 דקות. להשעות מחדש את התאים על ידי הוספת 7.6 מ"ל של 5 M NaCl ומערבולת לזמן קצר. צנטריפוגה בעוצמה של 3,000 × גרם ו-4°C למשך 5 דקות.
  7. מעבירים את הפאזה המימית לצינור חרוטי חדש ומוסיפים 9.4 מ"ל של 50% (v/v) פוליאתילן גליקול (PEG) 8000. מערבבים עם מערבל מערבולת במהירות גבוהה במשך 10 שניות ומניחים את הדגימות על קרח למשך שעה.
  8. צנטריפוגה ב-3,000 × גרם ב-4°C למשך 30 דקות. מוציאים את הסופרנאטנט ומניחים לגלולה להתייבש למשך 10 דקות.
  9. מוסיפים 1.4 מ"ל HEPES (50 mM, pH 8) ומערבבים במשך 5 דקות באמצעות מערבל במהירות גבוהה. הוסף 3.5 μL של 1 M MgCl2, 14 μL של DNase I (20 יחידות / μL), ו 1.4 μL של RNase A (10 מיקרוגרם / μL). יש לדגור באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות, ולאחר מכן להעביר את הדגימות לצינורות חדשים של 1.5 מ"ל (700 מיקרוליטר בכל צינור).
  10. הוסף 700 μL של כלורופורם לכל צינור 1.5 מ"ל וערבב באמצעות מערבל במהירות גבוהה במשך 10 שניות. צנטריפוגה ב-3,000 × גרם ב-4°C למשך 5 דקות ומעבירים את הפאזה המימית לצינור חדש. חזור על שלב זה 3x.
  11. יש לאדות את הכלורופורם למשך 30 דקות בארון בטיחות ביולוגית. לאחר מכן, להעביר 300 μL של הפאזה המימית לתוך צינור אולטרה צנטריפוגה 0.5 מ"ל (ראה טבלה של חומרים). סובבו את המסנן בטמפרטורה של 14,000 × גרם ב-25°C למשך 5 דקות. הסר את הזרימה וסובב שוב את המסנן עד שכל אמצעי האחסון יעבור דרך המסנן.
  12. שטפו את המסנן על ידי הוספת 300 μL של מלח חוצץ פוספט (DPBS) של Dulbecco וערבבו את התמיסות על ידי פיפט. צנטריפוגה את המסנן למשך 5 דקות ב-14,000 × גרם ב-25°C. חזור על שלב כביסה זה 4x.
  13. צנטריפוגה את המסנן למשך 8 דקות בטמפרטורה של 14,000 × גרם ב-25°C. הניחו את המסנן הפוך לתוך צינור חדש, וסובבו במשך 2 דקות בטמפרטורה של 1,000 × גרם ב-25°C.

3. טיטרציה של AAV על ידי qPCR

  1. הכינו עקומה סטנדרטית לטיטרציה AAV וקבעו את הטיטר AAV על פי המחקר המקורי של Fripont et al.15.

4. הזרקת In vivo של AAV לרקמת השומן הלבן המפשעה (iWAT)

  1. יש להפריד בין הכלים והציוד הכירורגי הדרושים לניתוח ולעקר אותם בהתאם להמלצות לכל חומר ספציפי.
  2. מרדימים את העכבר עם 100 מ"ג / ק"ג קטמין ו 10 מ"ג / ק"ג xylazine על ידי הזרקה intraperitoneal. אשר את ההרדמה על ידי הפעלת לחץ נמרץ על הכף והזנב ובדיקת רפלקס. יש למרוח משחה על עיני העכבר כדי למנוע יובש בעיניים במהלך הניתוח.
  3. מניחים את העכבר המרדים במצב שכיבה ומגלחים אזור קטן באגפים, פרוקסימלי למפרקי הירך להזרקות iWAT, עם מכונת גילוח. יש למרוח קרם depilatory במשך 5 דקות. יש להסיר שאריות קרם עם מים כדי למנוע כוויות בעור.
  4. לחטא את העור באמצעות שלושה סבבים לסירוגין של החלת פתרון חיטוי (פובידון-יוד) על העור עם גזה נקייה ו 70% אלכוהול. יש להשליך את הגזה לאחר כל שימוש.
  5. בצע יישום סופי של פתרון חיטוי על העור. לאחר מכן, בצע חתך של 1-2 ס"מ עם מספריים מעוקרים באזור הפרוקסימלי של המפרקים, והחזק את העור פתוח באמצעות מלקחיים כדי לחשוף את מחסן השומן. ניתן למצוא את ה- WAT מחובר לעור משני הצדדים, המשתרע מההתחלה על הגב ומטה לכיוון האשכים.
    הערה: יש להשתמש בווילונות כדי למנוע זיהום במהלך ניתוח או הליכי תפרים.
  6. באמצעות מלקחיים, דרך החתך, משכו בעדינות את מחסן השומן כלפי מעלה כדי לוודא שההזרקה נמצאת במיקום ובעומק הנכונים.
    הערה: היזהר שלא להסיר את הרקמה ממיקומה המקורי.
  7. מלא את מזרק המיקרוליטר (מד: 33; סגנון נקודה: 4; זווית: 12; אורך: 10) (ראה טבלת חומרים) ב- 2.5 μL (5.6 × 1010 גנומים נגיפיים [VG]/μL) של AAV (המכיל את sgRNA המכוון לגן האנדוגני Prdm16). הכנס בזהירות את המחט בזווית של 30°-45° לתוך iWAT. חזור על הזריקה 5x למיקומים שונים של הרקמה כדי להדביק הומוגנית את כל כרית השומן iWAT. נפח כולל של 15 μL מומלץ להדביק את iWAT.
    הערה: עומק החדרת המזרק תלוי בעובי המשקעים של כרית השומן. השתמש בטכניקה ללא מגע כדי לצייר את ההזרקה.
  8. סגור את חתך העור המגולח באמצעות 4/0 תפרי מונופילמנט. הניחו את העכבר על כרית חום עד להכרה חוזרת. עקוב אחר בעל החיים כל 10-15 דקות עד שהוא מתאושש לחלוטין. לאחר שהחיה חוזרת להכרה, שימו לב לפרופיל המוטורי, שאמור להיות ליניארי וללא סימני מצוקה או כאב.
  9. בצע בקרת כאב לאחר הניתוח בתוך 48 שעות לאחר הניתוח על ידי מתן tramadol hydrochloride (5 מ"ג / ק"ג) intraperitoneally במשך 3 ימים (2x / day).
    הערה: שימו לב לסימני מצוקה ואי נוחות ועקבו אחר צריכת המים והמזון. תן מינון יעיל של משכך כאבים באופן מונע, רצוי לפני או בתחילת הניתוח.
  10. שמור את העכבר בכלוב עם גישה חופשית למזון ומים במהלך תקופת הריפוי. לאחר תקופת הריפוי, המשך להרדים את העכבר. במחקר זה, המתת חסד בוצעה על ידי מנת יתר של חומרי הרדמה בהזרקה (intraperitoneal) מ פי 3 מינון השראת (300-360 מ"ג / ק"ג קטמין הידרוכלוריד + 30-40 מ"ג / ק"ג קסילזין הידרוכלוריד) ואחריו עריפת ראש.
    הערה: מומלץ מאוד להחזיק את בעלי החיים בכלובים נפרדים עד להחלמה מלאה מההרדמה.

5. התמיינות חוץ גופית של תאי כלי דם סטרומליים (SVFs) לאדיפוציטים בצבע בז'

  1. בצע בידוד וציפוי של SVFs ראשוניים מה- iWAT של עכברי AdipoSPH על פי Aune et al.17. זרעי SVF שמקורם בעכברי AdipoSPH iWAT לצלחת בעלת 6 בארות המכילה תווך שלם (DMEM המכיל 3.1 גרם/ליטר גלוקוז, 0.5 גרם/ליטר L-אלניל-L-גלוטמין, 10% FBS ו-2.5% P/S) למשך 1-2 שעות.
    הערה: מקטע SVF מכיל תערובת של סוגי תאים שונים. בשלב זה, לא ניתן להגדיר את מספר תאי האב זרע המעוררים אדיפוציטים.
  2. שואפים את המדיום, שוטפים את הבאר 2x באמצעות מלח חוצץ פוספט (1x PBS), ומחליפים במדיום שלם טרי. לדגור על התאים ב 37 ° C, 5% CO2, 95% לחות עד התאים מגיעים 70%-80% מפגש.
  3. השראת התמיינות (יום 0) על-ידי טיפול בתאים עם מדיום האינדוקציה (טבלה 2).
    הערה: קוקטייל התרופות של מדיום האינדוקציה נחוץ לשיפור התמיינות האדיפוציט בצבע בז' ולביטוי תוכנית הגן התרמוגנית17.
  4. לאחר יומיים (יום 2), החלף את אמצעי האינדוקציה באמצעי התחזוקה (טבלה 2).
  5. לאחר יומיים (יום 4), החלף את אמצעי התחזוקה באמצעי תחזוקה טריים (טבלה 2) למשך יומיים עד שלושה.
  6. שנה את מדיום התחזוקה כל 48 שעות עד שהפרדיפוציטים מתמיינים במלואם לאדיפוציטים (בדרך כלל 6 ימים לאחר הוספת מדיום האינדוקציה). ניתן לצפות באדיפוציטים בוגרים באמצעות מיקרוסקופ אור, שכן התאים המתמיינים נראים עמוסים בטיפות שומנים.

6. זיהום AAV במבחנה של SVFs

הערה: SVFs שמקורם בעכברי AdipoSPH iWAT היו נגועים ב-sgRNA-Prdm16 נושא AAV כפי שתואר קודם לכן על ידי Wang et al.18 עם כמה שינויים.

  1. לגדל את התאים על צלחת תרבית 6 בארות עם מדיום מלא עד שהתאים מגיעים 70%-80% מפגש, כפי שתואר קודם לכן בשלבים 5.1-5.3.
  2. ערבבו 5.6 ×10 10 VG/μL של sgRNA-Prdm16 נושא AAV עם 2 מ"ל של ברומיד בינוני מלא והקסדימתרין ברומיד (8 מיקרוגרם/מ"ל) (ראו טבלת חומרים). התמירו את התאים על ידי החלפת המדיום השלם והוספת המדיום השלם המכיל AAV. לדגור על התאים המומרים במשך 12 שעות ב 37 ° C, 95% לחות, ו 5% CO2.
  3. לפצל ולזרוע את התאים כמתואר בשלב 5 להתרבות תאים והתמיינות לאדיפוציטים בצבע בז'.
    הערה: עבור בדיקת צריכת חמצן, זרע 4.0 × 104 תאים (משלב 6.2) לכל באר עם מדיום אינדוקציה בצלחת תרבית תאים של 24 בארות. השלבים הבאים של התפשטות והתמיינות תאים מבוצעים כמתואר בשלב 5. בדיקת צריכת החמצן מבוצעת כאשר התאים מגיעים למפגש של 80%-100% והם ממוינים לחלוטין, כפי שדווח קודם לכן19.

תוצאות

עכברי AdipoSPH פותחו על ידי גידול זני עכברי SPH ו- Adipoq-Cre. שני זני העכבר היו על רקע היברידי C57BL6J-DBA/2J (על פי הספק המסחרי; ראה טבלת חומרים). שושלת עכברי SPH תוארה במקור על ידי Zhou et al.14.

התפתחות אדיפוציט In vivo בצבע בז' באמצעות ביטוי יתר של Prdm16 בתיווך Adip...

Discussion

אחד היישומים השימושיים ביותר של טכנולוגיית CRISPR הוא חקירת תפקוד גנים באמצעות הפעלת גנים אנדוגניים באמצעות מערכות CRISPRa6. SPH הוא CRISPRa רב עוצמה שתואר במקור כגורם להמרה של אסטרוציטים לנוירונים פעילים על ידי התמקדות במספר גנים נוירוגניים14. במחקר זה, AdipoSPH הוכח ככלי מתאי?...

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

המחברים מודים לתמיכה שקיבלו מ- Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica na Área da Ciência em Animais de Laboratório (Cemib), Unicamp, עבור הדור של עכברי AdipoSPH, המעבדה לאינמונומטבוליזם ואיתות התא, והמכון הלאומי למדע וטכנולוגיה בנושא פוטוניקה יישומית לביולוגיה של התא (INFABIC) עבור כל התמיכה הניסויית. אנו מודים לתמיכה הכספית מקרן המחקר של סאו פאולו (FAPESP): 2019/15025-5; 2020/09308-1; 2020/14725-0; 2021/11841-2.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
3,3',5-Triiodo-L-thyronineSigma-AldrichT2877
3-Isobutyl-1-methylxanthineSigma-AldrichI5879
AAVpro 293T Cell LineTakarabio632273
Amicon Ultra Centrifugal FilterMerckmilliporeUFC510008100 KDa
DexamethasoneSigma-AldrichD1756
Dulbecco's Modification of Eagles Medium (DMEM)Corning10-017-CV
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) F-12, GlutaMAX™ supplementGibco10565-018high concentrations of glucose, amino acids, and vitamins
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS)Sigma-AldrichD8662
Excelta Self-Opening Micro ScissorsFisher Scientific17-467-496
Fetal bovine serumSigma-AldrichF2442
Fisherbrand Cell Scrapers (100 pk)Fisher Scientific08-100-241
Fisherbrand High Precision Straight Tapered Ultra Fine Point Tweezers/ForcepsFisher Scientific12-000-122
Fisherbrand Sharp-Pointed Dissecting ScissorsFisher Scientific08-940
GlycerolSigma-AldrichG5516
HEPESSigma-AldrichH3375-25G
Hexadimethrine bromide (Polybrene)Sigma-AldrichH9268
IndomethacinSigma-AldrichI7378
InsulinSigma-AldrichI9278
LigaFast Rapid DNA Ligation SystemPromegaM8225
Maxiprep purification kit Qiagen12162
Microliter syringeHamilton80308Model 701
NEB 10-beta/Stable New England BiolabsC3019HE. coli competent cells
pAAV2/8 Addgene 112864
pAAV-U6-gRNA-CBh-mCherryAddgene 91947
pAdDeltaF6 Addgene 112867
PEG 8000Sigma-Aldrich89510
Penicillin/streptomycinGibco15140-122
PolyethylenimineSigma-Aldrich23966Linear, MW 25000
Povidone-iodineRioquímica510101303Antiseptic
RosiglitazoneSigma-AldrichR2408
SacI enzymeNew England BiolabsR0156
Surgical Design Premier Adson ForcepsFisher Scientific22-079-741
SyringeHamilton475-40417
T4 DNA LigasePromegaM180B
T4 DNA ligase buffer New England BiolabsB0202S
T4 PNK enzyme kitNew England BiolabsM0201S
Tramadol HydrochlorideSEM43930
Vidisic Gel Bausch + Lomb 99620

References

  1. Wang, W., Seale, P. Control of brown and beige fat development. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (11), 691-702 (2016).
  2. Wu, J., et al. Beige adipocytes are a distinct type of thermogenic fat cell in mouse and human. Cell. 150 (2), 366-376 (2012).
  3. Cohen, P., Kajimura, S. The cellular and functional complexity of thermogenic fat. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 22 (6), 393-409 (2021).
  4. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  5. Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
  6. Dominguez, A. A., Lim, W. A., Qi, L. S. Beyond editing: Repurposing CRISPR-Cas9 for precision genome regulation and interrogation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (1), 5-15 (2016).
  7. Gilbert, L. A., et al. CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes. Cell. 154 (2), 442-451 (2013).
  8. Perez-Pinera, P., et al. RNA-guided gene activation by CRISPR-Cas9-based transcription factors. Nature Methods. 10 (10), 973-976 (2013).
  9. Konermann, S., et al. Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex. Nature. 517 (7536), 583-588 (2015).
  10. Gilbert, L. A., et al. Genome-scale CRISPR-mediated control of gene repression and activation. Cell. 159 (3), 647-661 (2014).
  11. Tanenbaum, M. E., Gilbert, L. A., Qi, L. S., Weissman, J. S., Vale, R. D. A protein-tagging system for signal amplification in gene expression and fluorescence imaging. Cell. 159 (3), 635-646 (2014).
  12. Chavez, A., et al. Highly efficient Cas9-mediated transcriptional programming. Nature Methods. 12 (4), 326-328 (2015).
  13. Chavez, A., et al. Comparison of Cas9 activators in multiple species. Nature Methods. 13 (7), 563-567 (2016).
  14. Zhou, H., et al. In vivo simultaneous transcriptional activation of multiple genes in the brain using CRISPR-dCas9-activator transgenic mice. Nature Neuroscience. 21 (3), 440-446 (2018).
  15. Fripont, S., Marneffe, C., Marino, M., Rincon, M. Y., Holt, M. G. Production, purification, and quality control for adeno-associated virus-based vectors. Journal of Visualized Experiments. (143), e58960 (2019).
  16. Negrini, M., Wang, G., Heuer, A., Björklund, T., Davidsson, M. AAV production everywhere: a simple, fast, and reliable protocol for in-house aav vector production based on chloroform extraction. Current Protocols in Neuroscience. 93 (1), 103 (2020).
  17. Aune, U. L., Ruiz, L., Kajimura, S. Isolation and differentiation of stromal vascular cells to beige/brite cells. Journal of Visualized Experiments. (73), e50191 (2013).
  18. Wang, Q., et al. Post-translational control of beige fat biogenesis by PRDM16 stabilization. Nature. 609 (7925), 151-158 (2022).
  19. Oeckl, J., Bast-Habersbrunner, A., Fromme, T., Klingenspor, M., Li, Y. Isolation, culture, and functional analysis of murine thermogenic adipocytes. STAR Protocols. 1 (3), 100118 (2020).
  20. Cohen, P., et al. Ablation of PRDM16 and beige adipose causes metabolic dysfunction and a subcutaneous to visceral fat switch. Cell. 156 (1-2), 304-316 (2014).
  21. Harms, M., Seale, P. Brown and beige fat: development, function and therapeutic potential. Nature Medicine. 19 (10), 1252-1263 (2013).
  22. Divakaruni, A. S., Jastroch, M. A practical guide for the analysis, standardization and interpretation of oxygen consumption measurements. Nature Metabolism. 4 (8), 978-994 (2022).
  23. Seale, P., et al. Prdm16 determines the thermogenic program of subcutaneous white adipose tissue in mice. The Journal of Clinical Investigation. 121 (1), 96-105 (2011).
  24. Valet, P., Tavernier, G., Castan-Laurell, I., Saulnier-Blache, J. S., Langin, D. Understanding adipose tissue development from transgenic animal models. Journal of Lipid Research. 43 (6), 835-860 (2002).
  25. Bates, R., Huang, W., Cao, L. Adipose tissue: an emerging target for adeno-associated viral vectors. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 19, 236-249 (2020).
  26. Wang, D., Tai, P. W. L., Guangping, G. Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 18 (5), 358-378 (2019).
  27. Colella, P., Ronzitti, G., Mingozzi, F. Emerging issues in AAV-mediated in vivo gene therapy. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 8, 87-104 (2018).
  28. Deshmukh, A. S., et al. Proteomics-based comparative mapping of the secretomes of human brown and white adipocytes reveals EPDR1 as a novel batokine. Cell Metabolism. 30 (5), 963-975 (2019).
  29. Sponton, C. H., et al. The regulation of glucose and lipid homeostasis via PLTP as a mediator of BAT-liver communication. EMBO reports. 21 (9), 49828 (2020).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE191

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved