יצירה וטיפוח של אורגנואידים שמקורם בסרטן השחלות הסרוסי ברמה גבוהה

Summary

אורגנואידים שמקורם בחולה (PDO) הם תרבית תלת ממדית (3D) שיכולה לחקות את סביבת הגידול במבחנה. בסרטן שחלות סרוסי בדרגה גבוהה, PDOs מייצגים מודל לחקר סמנים ביולוגיים וטיפולים חדשים.

Abstract

אורגנואידים הם מודלים תלת-ממדיים של גידולים דינמיים שניתן לגדל בהצלחה מרקמת גידול שחלה שמקורה במטופלת, מיימת או נוזל פלאורלי ולסייע בגילוי טיפולים חדשניים וסמנים ביולוגיים מנבאים לסרטן השחלות. מודלים אלה משחזרים הטרוגניות שבטית (clonal heterogeneity), את המיקרו-סביבה של הגידול (tumor microenvironment) ואת האינטראקציות בין תאים לתאים ולמטריצות תאים. בנוסף, הם הוכחו כמתאימים לגידול הראשוני מבחינה מורפולוגית, ציטולוגית, אימונוהיסטוכימית וגנטית. לפיכך, אורגנואידים מאפשרים מחקר על תאי הגידול ועל המיקרו-סביבה של הגידול והם עדיפים על קווי תאים. הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטות שונות ליצירת אורגנואידים של סרטן השחלות שמקורם במטופלות מגידולים, מיימת ודגימות נוזל פלאורלי עם שיעור הצלחה גבוה מ-97%. דגימות המטופל מופרדות לתרחיפים תאיים על ידי עיכול מכני ואנזימטי כאחד. לאחר מכן התאים מצופים באמצעות תמצית קרום מרתף (BME) ונתמכים במצע גדילה אופטימלי המכיל תוספים ספציפיים לגידול סרטן שחלות סרוסי בדרגה גבוהה (HGSOC). לאחר יצירת אורגנואידים ראשוניים, PDOs יכולים לקיים תרבית ארוכת טווח, כולל מעבר להרחבה לניסויים הבאים.

Introduction

בשנת 2021, כ-21,410 נשים בארה"ב אובחנו לאחרונה עם סרטן שחלות אפיתל, ו-12,940 נשים נפטרו ממחלה זו¹. למרות התקדמות מספקת נעשו בניתוחים וכימותרפיה, מעל 70% מהחולים עם מחלה מתקדמת לפתח עמידות כימותרפית למות בתוך 5 שנים של אבחנה ^2,3. לפיכך, יש צורך דחוף באסטרטגיות חדשות לטיפול במחלה קטלנית זו ובמודלים מייצגים ואמינים למחקר פרה-קליני.

קווי תאים סרטניים וקסנוגרפטים שמקורם במטופלות (PDX) שנוצרו מגידולים ראשוניים בשחלות הם המכשירים העיקריים המשמשים במחקר סרטן השחלות. יתרון מרכזי של קווי תאים סרטניים הוא ההתרחבות המהירה שלהם. עם זאת, התרבית המתמשכת שלהם גורמת לשינויים פנוטיפיים וגנוטיפיים הגורמים לקווי התאים הסרטניים לסטות מדגימת הגידול הסרטני הראשונית המקורית. בשל ההבדלים הקיימים בין קו התאים הסרטניים לבין הגידול הראשוני, בדיקות תרופות שיש להן השפעות חיוביות בשורות תאים אינן מצליחות להשיג את אותן השפעות בניסויים קליניים². כדי להתגבר על מגבלות אלה, מודלים PDX משמשים. מודלים אלה נוצרים על ידי השתלת רקמת סרטן שחלה טרייה בעכברים מדוכאי חיסון. מכיוון שהם מודלים in vivo , הם דומים יותר למאפיינים ביולוגיים אנושיים, ובתורם, מנבאים יותר את תוצאות התרופות. עם זאת, למודלים אלה יש גם מגבלות משמעותיות, כולל העלות, הזמן והמשאבים הדרושים כדי לייצר אותם⁴.

PDOs מציעים מודל חלופי למחקר פרה-קליני המתגבר על המגבלות של קווי תאים סרטניים ומודלים של PDX. PDOs משחזרים את הגידול ואת המיקרו-סביבה של המטופל, ובכך מספקים מודל טרקטיבי במבחנה אידיאלי למחקר פרה-קליני ^2,3,5. למודלים תלת-ממדיים אלה יש יכולות ארגון עצמי המדמים את הגידול הראשוני, תכונה שאין לעמיתיהם בקו התא הדו-ממדי (2D). יתר על כן, מודלים אלה הוכחו כמייצגים גנטית ותפקודית את גידולי האב שלהם, ולכן הם מודלים אמינים לחקר טיפולים חדשניים ותהליכים ביולוגיים. בקיצור, הם מציעים יכולות הרחבה ואחסון ארוכות טווח הדומות לקווי תאים, אך גם מקיפות את המיקרו-סביבה ואת אינטראקציות התא-תא הטבועות בדגמי עכברים ^4,6.

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את היצירה של PDOs מגידולים, מיימת ודגימות נוזל פלאורלי שמקורם במטופל עם שיעור הצלחה גבוה מ-97%. לאחר מכן ניתן להרחיב את תרביות ה-PDO למשך דורות רבים ולהשתמש בהן לבדיקת רגישות לטיפול תרופתי וסמנים ביולוגיים מנבאים. שיטה זו מייצגת טכניקה שניתן להשתמש בה כדי להתאים אישית טיפולים המבוססים על התגובות הטיפוליות של PDOs.

Protocol

כל דגימות הרקמה האנושית שנאספו למחקר התקבלו על פי פרוטוקול שאושר על ידי מועצת הביקורת המוסדית (IRB). הפרוטוקולים המתוארים להלן בוצעו בסביבת תרבית רקמה אנושית סטרילית. הסכמה מדעת בכתב התקבלה מנבדקים אנושיים. מטופלות זכאיות היו צריכות לקבל אבחנה או אבחנה משוערת של סרטן השחלות, להיות מוכנות ומסוגלות לחתום על הסכמה מדעת, ולהיות בנות 18 לפחות. רקמת הגידול (גידול ראשוני ממאיר או אתרים גרורתיים), מיימת ונוזל פלאורלי התקבלו מחולים בהסכמה בזמן ההליך. דגימות אלה הועברו מיד למעבדה ועובדו לייצור אורגנואידים בשיטות המתוארות להלן.

1. הכנת מדיה

1. הכנת מדיה אורגנואידית מלאה
   1. הכינו מדיום מותנה R-spondin 1/Noggin בעקבות דו"ח שפורסם בעבר⁷.
      הערה: מדיום מותנה R-spondin-1/Noggin הוא חלופה זולה יותר לחלבונים רקומביננטיים הזמינים מסחרית. תאי HEK293T המפרישים ביציבות R-ספונדין-1 ונוגין באמצעות התמרה בתיווך לנטיוירוס היו מתנה נדיבה מרון בוס, בית הספר לרפואה של אוניברסיטת וושינגטון בסנט לואיס, ואניל רוסטגי, המרכז הרפואי אירווינג של אוניברסיטת ניו יורק-פרסביטריאן/קולומביה ^8,9,10. מדיום מסחרי מותנה יכול לשמש כתחליף (ראה טבלת חומרים).
2. כדי ליצור את מדיום האורגנואיד השלם, יש לשלב 10% R-spondin 1/Noggin מותנה בינוני, 50 ng/mL EGF, 10 ng/mL FGF-10, 10 ng/mL FGF2, 1x B27, 10 mmol / L nicotinamide, 1.25 mmol / L N-אצטיל-ציסטאין, 1 μmol / L פרוסטגלנדין E2, 10 μmol / L SB202190, 500 nmol / L A83-01 ומעכב ROCK 10 μM (ראה טבלת חומרים).
   הערה: ניתן לאחסן את המדיום בטמפרטורה של 4°C למשך עד 3 חודשים. מדיום זה הותאם מ-Hill et ^al.11. הריכוזים והמרכיבים של המדיום זהים, בתוספת מעכב ROCK.
3. הכן בסיס אורגנואיד בינוני על ידי שילוב של 500 מ"ל של נוסחה מתקדמת של DMEM/F12 עם 1% פניצילין-סטרפטומיצין, 1x דיפפטיד, L-alanyl-L-גלוטמין, 1x HEPES (10 mM) (ראה טבלה של חומרים).

2. קצירת אורגנואידים מיימת ונוזל פלאורלי

הערה: מיימת ונוזל פלאורלי חייבים להיות מעובדים בהקדם האפשרי לקבלת התשואה הטובה ביותר של אורגנואידים. הפשרה השתמשה בעבר ב-BME, DNase I ובמאגר התגובה DNase I (ראו טבלת חומרים) על ידי הנחתו על קרח עד לנוזלי התכולה.

1. יש להשיג מיימת ונוזל פלאורלי ממטופלים שהסכימו לכך בזמן ניתוחים או הליכים סטנדרטיים, ולשנע בטמפרטורת החדר במיכל נסיעות למעבדה.
   הערה: כל מיימת או עיבוד נוזל pleural צריך להתבצע בסביבה סטרילית.
2. העברת 50 מ"ל של מיימת או נוזל pleural ל 50 מ"ל צינורות חרוטי (מספר צינורות תלוי בנפח מיימת המתקבל). צנטריפוגה ב-1,650 x גרם למשך 5 דקות ב-4°C. לאחר הצנטריפוגה, השתמש פיפטה פסטר זכוכית כדי לשאוף בזהירות את supernatant.
3. המשך על ידי הוספת 50 מ"ל של מיימת או נוזל pleural לגלולה צנטריפוגה בעבר, וצנטריפוגה שוב ב 1,650 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. שאפו בזהירות את הסופרנטנט בעזרת פיפטה מזכוכית. חזור על שלב זה עד שכל מיימת או נוזל pleural עובדו.
4. הכינו תמיסת DNase I של 100 מיקרוגרם/מ"ל על ידי שילוב של 1,000 מיקרוליטר מים נטולי נוקלאז, 100 מיקרוליטר של מאגר התגובה של DNase I ו-10 מיקרוליטר של DNase I.
   הערה: הטיפול ב- DNase I המיושם מספיק כדי לבצע השעיה של תא בודד ללא קשר לנוכחות של צברי תאים בחלק מדגימות החולים¹².
5. השהה מחדש כל כדור תא ב- 1 מ"ל של תמיסת DNase I של 100 מיקרוגרם/מ"ל. הוסיפו בעדינות את תמיסת DNase I טיפתית, ואפשרו לצינורית לדגור במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
   הערה: הוסף לפחות 1 מ"ל של תמיסת DNase I. אם 1 מ"ל אינו מספיק כדי להפריע לכדור, הוסף 1 מ"ל נוספים.
6. לאחר הדגירה, מוסיפים 25 מ"ל של מדיום בסיס אורגנואיד (שלב 1.3) לתאים, והופכים בעדינות כדי לערבב. לאחר מכן, צנטריפוגה ב 1,650 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. לאחר הצנטריפוגה, שאפו בזהירות את הסופרנאטנט באמצעות פיפטה פסטר זכוכית.
7. יש להשהות מחדש את כדורי התא החדשים שנוצרו ב-5 מ"ל שחוממו מראש של חיץ ליזה של 1x תאי דם אדומים (RBC) (ראו טבלת חומרים). הגדר את המערבולת ל 458 x g, ומערבל את התמיסות בכל צינור חרוט. ברגע שהתמיסות הומוגניות, השתמש בצינור סרולוגי כדי לשלב את התוכן של כל הצינורות החרוטיים לצינור חרוטי יחיד של 50 מ"ל.
8. דוגרים על הצינור החרוטי המכיל את התמיסה המערבולת בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות. לאחר השלמת הדגירה, צנטריפוגה ב 1,650 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
   הערה: בדוק את הכדור. גלולה ורודה/אדומה מציינת את נוכחותם של RBCs, מה שידרוש חזרה על שלב חיץ הליזה של RBC עד שהגלולה כבר לא תהיה אדומה.
9. לאחר הצנטריפוגה, שאפו בזהירות את הסופרנאטנט באמצעות פיפטה פסטר זכוכית. לאחר מכן, לשטוף את הגלולה עם 10 מ"ל של PBS, מערבל את התמיסה ב 458 x גרם, וצנטריפוגה ב 1,650 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
10. אם נוצרת גלולת תא גדולה, שאפו את PBS באמצעות פיפטת פסטר זכוכית, והוסיפו 1 מ"ל של מדיום בסיס אורגנואיד (שלב 1.3) על גבי הכדורית. מערבלים את התמיסה ב 458 x גרם, ומעבירים 300-400 μL לצינור מיקרוצנטריפוגה. צנטריפוגה צינור microcentrifuge ב 1,650 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
    הערה: ניתן להקפיא את החלק של גלולת התא שאינו ממוקם בצינור המיקרוצנטריפוגה לשימוש עתידי (500 מיקרוליטר תאים עד 1 מ"ל של 10% DMSO ב- FBS). את גלולת התא הקפואה ניתן לאחסן במשך שבועות בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס ובמשך שנים אם מניחים אותה בחנקן נוזלי¹³.
11. יש לשאוף בזהירות את מדיום בסיס האורגנואיד (שלב 1.3) באמצעות פיפטה מזכוכית, ולהשהות מחדש ב-BME (ראו טבלת חומרים) בעזרת קצוות קרים.
    הערה: כמות BME מבוססת על גודל הכדור. מומלץ להשתמש 25% בסיס אורגנואיד בינוני (שלב 1.3) עם תאים מרחפים ל 75% BME.
12. צלחת 40 μL aliquots של תמיסת התא resuspended על צלחת 6 באר. צלחת עד חמישה aliquots לכל באר (איור 1).
13. הניחו מיד את הצלחת באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות כדי לאפשר ל-BME להתמצק. לאחר הדגירה, מוסיפים בעדינות 2 מ"ל של מדיום אורגנואיד שלם (שלב 1.2) לכל באר.

איור 1: ציפוי אורגנואידים של סרטן השחלות שמקורם במטופלות. תמונה מייצגת של ציפוי האורגנואידים. Aliquots של תערובת אורגנואיד מצופים בקפידה, להבטיח לא בועות נוצרו. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

3. קצירת אורגנואידים מרקמה

הערה: יש לעבד רקמות בהקדם האפשרי לקבלת התשואה הטובה ביותר של אורגנואידים.

1. לאסוף ולשנע את הגידול על קרח במיכל נסיעות המכיל PBS.
2. הניחו את הדגימה על צלחת תרבית רקמה בקוטר 10 ס"מ (איור 2). בעזרת אזמל חד פעמי, טוחנים את הרקמה. לאחר מכן, באמצעות קצה עמום של מזרק חד פעמי, למחוץ את הרקמה עד תערובת הומוגנית נוצר.
3. בעזרת מלקחיים, מניחים את תערובת הרקמה ההומוגנית לתוך צינור דיסוציאציה. עבור כל 1-2 מ"ל של רקמה הומוגנית, הוסף 7-8 מ"ל של תמיסת קולגנאז מסוג II של 1 מ"ג/מ"ל (ראה טבלת חומרים) בתווך בסיס אורגנואיד (שלב 1.3) ו-1 מ"ל של תמיסת DNase I. מערבולת את הפתרון ב 458 x גרם.
   הערה: כמות הרקמה תקבע את כמות תמיסת הקולגנאז ואת מספר הצינורות הדרושים.
4. השתמש במכונת הדיסוציאציה (ראה טבלת חומרים) כדי לנזול את הרקמה בזמן שהיא בתמיסת הקולגנאז. הפעל את התוכנית 37C_h_TDK3 (1 שעות) עד שהיא תשעה של תא יחיד.
   הערה: יהיה צורך להפעיל מחדש את התוכנית אם התערובת המתקבלת אינה הומוגנית (כלומר, אם חתיכות רקמה עדיין קיימות בתערובת). אם הרקמה מתעכלת אך התמיסה צמיגה, מדללים באמצעות תווך בסיס אורגנואיד (שלב 1.3).
5. מעבירים את התערובת ההומוגנית לצינור חרוטי חדש של 50 מ"ל, ומוסיפים 20-40 מ"ל של מדיום בסיס אורגנואיד (שלב 1.3). לאחר מכן, סנן את התמיסה דרך מסננת תאים של 100 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי חדש של 50 מ"ל.
6. צנטריפוגה את התערובת המסוננת ב 1,650 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. לאחר מכן, שאפו בזהירות את הסופרנאטנט באמצעות פיפטה מזכוכית.
7. הכינו תמיסת DNase I של 100 מיקרוגרם/מ"ל על ידי שילוב של 1,000 מיקרוליטר מים נטולי נוקלאז, 100 מיקרוליטר של מאגר התגובה של DNase I ו-10 מיקרוליטר של DNase I.
   הערה: הטיפול ב- DNase I המיושם מספיק כדי לבצע השעיה של תא בודד ללא קשר לנוכחות של צברי תאים בחלק מדגימות החולים¹².
8. להשעות מחדש את התאים ב 1 מ"ל של 100 ug / mL DNase פתרון I. הוסיפו בעדינות את תמיסת DNase I טיפתית, ואפשרו לצינורית לדגור במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
9. לאחר הדגירה, מוסיפים 25 מ"ל של מדיום בסיס אורגנואיד (שלב 1.3) לתאים, והופכים בעדינות כדי לערבב. לאחר מכן, צנטריפוגה ב 1,650 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. לאחר הצנטריפוגה, שאפו בזהירות את הסופרנאטנט באמצעות פיפטה פסטר זכוכית.
10. השהה מחדש את גלולת התא החדשה שנוצרה ב -5 מ"ל של חיץ ליזיס 1x RBC שחומם מראש. מערבול את התמיסות בכל צינור חרוטי ב 458 x גרם.
11. דגרו על הצינור החרוטי המכיל את גלולת התא התלויה מחדש במאגר הליזה של RBC למשך 5 דקות. לאחר השלמת הדגירה, צנטריפוגה ב 1,650 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
    הערה: בדוק את הכדור. גלולה ורודה/אדומה מציינת נוכחות של RBC, מה שיחייב חזרה על שלב חיץ הליזיס של RBC עד שהגלולה נראית לבנה.
12. לאחר הצנטריפוגה, שאפו בזהירות את הסופרנאטנט באמצעות פיפטה פסטר זכוכית. לאחר מכן, לשטוף את הגלולה עם 10 מ"ל של PBS, מערבל את התמיסה ב 458 x גרם, וצנטריפוגה ב 1,650 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
13. אם נוצרת גלולת תא גדולה, שאפו את PBS באמצעות פיפטת פסטר זכוכית, והוסיפו 1 מ"ל של מדיום בסיס אורגנואיד (שלב 1.3) על גבי הכדורית. מערבלים את התמיסה ב 458 x גרם, ומעבירים 300-400 μL לצינור מיקרוצנטריפוגה. צנטריפוגה ב-1,650 x גרם למשך 5 דקות ב-4°C.
    הערה: ניתן להקפיא את החלק של גלולת התא שאינו ממוקם בצינור המיקרוצנטריפוגה לשימוש עתידי (500 מיקרוליטר תאים עד 1 מ"ל של 10% DMSO ב- FBS) (שלב 5.1). את גלולת התא הקפואה ניתן לאחסן במשך שבועות בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס ובמשך שנים אם מניחים אותה בחנקן נוזלי¹³.
14. שאפו בזהירות את מדיום הבסיס האורגנואידי באמצעות פיפטה פסטר זכוכית, והשהו מחדש ב- BME באמצעות קצוות קרים.
    הערה: כמות BME מבוססת על גודל הכדור. מומלץ להוסיף 25% מדיום בסיס אורגנואיד (שלב 1.3) עם תאים מרחפים ל-75% BME.
15. לוחית את תמיסת התא המרחף מחדש על צלחת 6 בארות ב 40 μL aliquots. צלחת עד חמישה aliquots לכל באר.
16. מניחים מיד את צלחת הבאר באינקובטור למשך 20 דקות. לאחר הדגירה, מוסיפים בעדינות 2 מ"ל של מדיום אורגנואיד שלם (שלב 1.2) לכל באר.

איור 2: רקמת הגידול לפני נתיחה. תמונה מייצגת של רקמת הגידול המתקבלת לייצור אורגנואידים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

4. מעבר של אורגנואידים

הערה: אם הדגימה היא חופפת, כל באר אורגנואידים יכולה לעבור מדי שבוע לשתי בארות חדשות.

1. באמצעות פיפטה של 1 מ"ל, הוסף 1 מ"ל של מדיום בסיס אורגנואיד (שלב 1.3) לכל באר, ופיפטה את המדיה למעלה ולמטה ישירות על לשוניות האורגנואידים כדי לנתק אותה. לאסוף את כל המדיום המכיל את כדורי resuspended בצינור חרוטי 15 מ"ל.
2. צנטריפוגה את הצינור החרוטי 15 מ"ל המכיל את התערובת ב 1,650 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. לאחר מכן, שאפו בזהירות את הסופרנאטנט באמצעות פיפטה מזכוכית.
3. הוסף 1 מ"ל של אנזים רקומביננטי ללא מקור מן החי (ראה טבלת חומרים) לכדורית התא, מערבל את התמיסה ב 458 x גרם, ומעביר לצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל. אפשר לצינור לדגור במשך 15 דקות באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס.
4. לאחר הדגירה, צנטריפוגה ב 1,650 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. לאחר מכן, שאפו בזהירות את הסופרנאטנט באמצעות פיפטה מזכוכית.
5. השהה מחדש את הגלולה ב- BME.
   הערה: כמות BME מבוססת על גודל הכדור. מומלץ להוסיף 25% מדיה בסיסית אורגנואידית (שלב 1.3) עם תאים מרחפים ל-75% BME.
6. צלחת את תמיסת התא resuspended לתוך צלחת 6 באר ב 40 μL aliquots. צלחת עד חמישה aliquots לכל באר. לאחר שכל aliquots כבר מצופה, מיד מניחים את צלחת הבאר באינקובטור במשך 20 דקות. לאחר הדגירה, מוסיפים בעדינות 2 מ"ל של מדיום אורגנואיד שלם (שלב 1.2) לכל באר.

5. הקפאה והפשרה של אורגנואידים

1. הקפאת אורגנואידים
   1. התחל בשלבים 4.1-4.4.
   2. יש להשהות מחדש את כדורית התא ב-0.5-1 מ"ל של תרבית תאי התאוששות בהקפאה (ראו טבלת חומרים), ולהעביר 1 מ"ל לכל קריוביאלי.
   3. לאחר מכן, הניחו את הקריובלים במיכל מלא איזופרופנול בטמפרטורה של -80°C למשך עד שבועיים לפני העברתם למיכל חנקן נוזלי לאחסון לטווח ארוך¹³.
2. הפשרת אורגנואידים
   1. הסר את הדגימות ממיכל החנקן הנוזלי, והפשיר באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס.
   2. לאחר ההפשרה, להעביר צינור חרוטי 15 מ"ל, צנטריפוגה ב 1,650 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. לאחר הצנטריפוגה, שאפו בזהירות את הסופרנאטנט באמצעות פיפטה פסטר זכוכית.
   3. השהה מחדש את הגלולה ב- BME.
      הערה: כמות BME מבוססת על גודל הכדור. מומלץ להוסיף 25% מדיה בסיסית אורגנואידית (שלב 1.3) עם תאים מרחפים ל-75% BME.
   4. לוחית את תמיסת התא המרחף מחדש על צלחת 6 בארות ב 40 μL aliquots. מניחים עד חמישה aliquots לכל באר.
   5. מניחים מיד את הצלחת באינקובטור למשך 20 דקות. לאחר הדגירה, להוסיף בעדינות 2 מ"ל של מדיום אורגנואיד מלא (שלב 1.2) לבארות.

6. הטבעה ויצירה של שקופיות משובצות פרפין קבועות פורמלין (FFPE) להערכת הרכב האורגנואידים

1. לאחר גידול אורגנואידים במשך 10 ימים לפחות כדי להבטיח גודל נאות, להסיר את המדיום אורגנואיד מלא מן הבארות, ולהוסיף 1 מ"ל של 2% paraformaldehyde fixative (PFA). יש לדגור בטמפרטורת החדר למשך 5-10 דקות.
2. לאחר הדגירה, לשטוף את aliquots אורגנואיד תרבית 3 פעמים במשך 5 דקות בכל פעם עם 1 מ"ל של PBS.
3. מוציאים את PBS מכל באר, ומוסיפים 1 מ"ל של אגר חם 2% ב H₂O נטול יונים. בעת הוספת האגר, הרימו את עלי האורגנואיד המתורבת מהצלחת באמצעות מרית.
   הערה: חשוב לא לתת לאגר להתקשות לפני הרמת האליציטוטים האורגנואידים המתורבתים.
   1. מניחים לאגר להתמצק בבאר בטמפרטורת החדר.
4. בעזרת מרית קטנה, שחררו את האגר המוצק מהבאר, ואחסנו אותו בקלטת עד 48 שעות (ראו טבלת חומרים) בטמפרטורה של 4°C באתנול 70% עד לעיבוד¹⁴.
5. הטמיעו את הדגימות בפרפין 15, חתכו את השקופיות לעובי של 5 מיקרומטר, וצבעו את השקופיות בצביעה של המטוקסילין ואאוזין (H&E, ראו טבלת חומרים) באמצעות פרוטוקול סטנדרטי¹⁵.

תוצאות

כדי ליצור PDOs, הדגימות עוכלו באופן מכני ואנזימטי לתרחיפים חד-תאיים. התאים הושעו מחדש ב-BME ונוספו להם מדיה מהונדסת במיוחד (איור 3). אורגנואידים נוצרים בדרך כלל על פני מסגרת זמן של 10 ימים, שלאחריה הם מדגימים אורגנואידים נפרדים בתרבית (איור 4).

Discussion

סרטן השחלות קטלני ביותר בשל השלב המתקדם שלו באבחון, כמו גם ההתפתחות הנפוצה של עמידות לכימותרפיה. התקדמות רבה במחקר סרטן השחלות נעשתה על ידי שימוש בקווי תאים סרטניים ומודלים PDX; עם זאת, יש צורך ברור במודל ייצוגי יותר ובמחיר סביר יותר במבחנה . PDOs הוכיחו שהם מייצגים במדויק את ההטרוגניות ש?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1% HEPES	Life Technologies	15630080
1% Penicillin-Streptomycin	Fisher Scientific	30002CI
1.5 mL Eppendorf Tubes	Genesee Scientific	14125
10 cm Tissue Culture Dish	TPP	93100
10 mL Serological Pipet
100 µm Cell Filter	MidSci	100ICS
15 mL centrifuge tubes	Corning	430052
2 mL Cryovial	Simport Scientific	T301-2
2% Paraformaldehyde Fixative	Sigma-Aldrich
37 °C water bath	NEST	602052
3dGRO R-Spondin-1 Conditioned Media Supplement	Millipore Sigma	SCM104
6 well plates	TPP	92006
70% Ethanol	Sigma-Aldrich	R31541GA
A83-01	Sigma-Aldrich	SML0788
Advanced DMEM/F12	ThermoFisher	12634028
Agar	Lamda Biotech	C121
B-27	Life Technologies	17504044
Centrifuge
Cultrex Type 2	R&D Systems	3533-010-02	basement membrane extract
DNase I	New England Bio Labs	M0303S
DNase I Reaction Buffer	New England Bio Labs	M0303S
EGF	PeproTech	AF-100-15
FBS	Sigma-Aldrich	F2442
FGF-10	PeproTech	100-26
FGF2	PeproTech	100-18B
gentleMACS C Tubes	Miltenyi BioTech	130-096-334
gentleMACS Octo Dissociator with Heaters	Miltenyi BioTech	130-096-427	We use the manufacturers protocol.
GlutaMAX	Life Technologies	35050061	dipeptide, L-alanyl-L-glutamine
Hematoxylin and Eosin Staining Kit	Fisher Scientific	NC1470670
Histoplast Paraffin Wax	Fisher Scientific	22900700
Microcentrifuge
Mr. Frosty Freezing Container	Fisher Scientific	07202363S
N-acetylcysteine	Sigma-Aldrich	A9165
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	N0636
p1000 Pipette with Tips
p200 Pipette with Tips
Pasteur Pipettes 9"	Fisher Scientific	1367820D
PBS	Fisher Scientific	MT21031CM
Pipet Controller
Prostaglandin E2	R&D Systems	2296
Puromycin	ThermoFisher	A1113802
Recombinant Murine Noggin	PeproTech	250-38
Recovery Cell Culture Freezing Medium	Invitrogen	12648010
Red Blood Cell Lysis Buffer	BioLegend	420301
ROCK Inhibitor (Y-27632)	R&D Systems	1254/1
SB202190	Sigma-Aldrich	S7076
T75 Flask	MidSci	TP90076
Tissue Culture Hood
Tissue Embedding Cassette
TrypLE Express	Invitrogen	12604013	animal origin-free, recombinant enzyme
Type II Collagenase	Life Technologies	17101015
Vortex