בידוד וטיהור תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים ומקרו-וסקולריים מדגימות שמקורן בריאה

Summary

למרות שהוא מאתגר, הבידוד של תאי אנדותל ריאתיים חיוני למחקרים על דלקת ריאות. הפרוטוקול הנוכחי מתאר הליך לבידוד בעל תפוקה גבוהה וטוהר גבוה של תאי אנדותל מקרו-וסקולריים ומיקרו-וסקולריים.

Abstract

זמינותם של תאים שבודדו מרקמות ואיברים בריאים וחולים מהווה מרכיב מפתח בגישות של רפואה מותאמת אישית. למרות שביובנקים יכולים לספק אוסף רחב של תאים ראשוניים ואימורטליים למחקר ביו-רפואי, אלה אינם מכסים את כל צרכי הניסוי, במיוחד אלה הקשורים למחלות או גנוטיפים ספציפיים. תאי אנדותל וסקולריים (ECs) הם מרכיבים מרכזיים של התגובה הדלקתית החיסונית, ולכן ממלאים תפקיד מרכזי בפתוגנזה של מגוון הפרעות. יש לציין כי ECs מאתרים שונים מציגים תכונות ביוכימיות ותפקודיות שונות, מה שהופך את הזמינות של סוגי EC ספציפיים (כלומר, כלי דם, כלי דם, עורקים וורידים) חיונית לתכנון ניסויים אמינים. כאן, הליכים פשוטים להשגת תפוקה גבוהה, כמעט טהור אנושי תאי אנדותל microvascular מן העורק הריאה ואת parenchyma הריאות מתוארים בפירוט. מתודולוגיה זו ניתנת לשכפול בקלות בעלות נמוכה יחסית על ידי כל מעבדה כדי להשיג עצמאות ממקורות מסחריים ולקבל פנוטיפים / גנוטיפים EC שעדיין אינם זמינים.

Introduction

אנדותל כלי הדם מצפה את פני השטח הפנימיים של כלי הדם. הוא ממלא תפקידי מפתח בוויסות קרישת הדם, טונוס כלי הדם ותגובות דלקתיות של מערכת החיסון 1,2,3,4. למרות שתרבית תאי אנדותל (ECs) שבודדו מדגימות אנושיות חיונית למטרות מחקר, יש לציין כי ECs מכלי דם שונים (עורקים, ורידים, נימים) יש פונקציות ספציפיות. אלה אינם ניתנים לשחזור מלא על ידי תאי אנדותל ורידים טבוריים אנושיים (HUVEC), אשר זמינים בקלות ונמצאים בשימוש נרחב במחקרים על פתופיזיולוגיה של אנדותל כלי דם ^5,6. לדוגמה, תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים של הריאה האנושית (HLMVECs) ממלאים תפקידי מפתח בדלקת ריאות על ידי שליטה בגיוס והצטברות לויקוציטים ^4,7. לפיכך, הגדרה ניסיונית שמטרתה לשחזר דלקת ריאות עם נאמנות גבוהה צריך לכלול HLMVECs. מצד שני, תפקוד לקוי של EC ניתן לראות במספר פתולוגיות; לכן, ECs מן המטופל הם היסוד לבניית מודל אמין במבחנה של המחלה. לדוגמה, הבידוד של שברי ECs מעורק הריאה (HPAECs), שנותחו מהריאות המושתלות של אנשים שנפגעו מסיסטיק פיברוזיס (CF), איפשר לנו לחשוף מנגנונים של תפקוד לקוי של האנדותל במחלה זו ^8,9.

לפיכך, פרוטוקולים שמטרתם לייעל את הבידוד של ECs ממקורות / איברים שונים גם במצבי מחלה חיוניים כדי לספק לחוקרים כלי מחקר יקרי ערך, במיוחד כאשר כלים אלה אינם זמינים מסחרית. פרוטוקולי בידוד HLMVEC ו-HPAEC דווחו בעבר 10,11,12,13,14,15,16,17,18,19. בכל המקרים, העיכול האנזימטי של דגימות הריאה הביא לאוכלוסיות תאים מעורבות, שטוהרו באמצעות מדיה סלקטיבית אד-הוק ומיון תאים מבוססי חרוזים מגנטיים או ציטומטריים. אופטימיזציות נוספות של פרוטוקולים אלה חייבות לטפל בשתי בעיות עיקריות בבידוד EC: (1) זיהום תאים ורקמות, שיש לפתור במעברי התרבית המוקדמים ביותר האפשריים כדי למזער את ההזדקנות המשוכפלת של EC²⁰; ו-(2) התשואה הנמוכה של מבודדי EC ראשוניים.

מחקר זה מתאר פרוטוקול חדש לבידוד בעל תפוקה גבוהה וטוהר גבוה של HLMVECs ו-HPAECs. הליך זה יכול להיות ישים בקלות ולתת ECs macrovascular ו microvascular טהור בכמה צעדים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

מחקר זה אושר, והפרוטוקול פעל בהתאם להנחיות ועדת האתיקה של המחקר האנושי של אוניברסיטת קייטי-פסקארה (#237_2018bis). איור 1 מדגים את הבידוד של תאי אנדותל ממקטעים (באורך 1-3 ס"מ) של פרנכימה ריאתית או עורק ריאתי מנבדקים אנושיים לא מזוהים (בהסכמה בכתב) שעברו ניתוחי חזה מסיבות שונות, כגון דלקת ריאות או לובקטומיה. במקרה האחרון, המנתחים אספו גם קטע עורק ריאתי. יש לציין כי המנתחים הונחו במדויק לאסוף דגימות נקיות מסרטן. הפרוטוקול המוצג הותאם להשגת התשואה והטוהר הגדולים ביותר האפשריים.

1. הכנה ניסיונית

1. הרכבה מחדש של Collagenase
   1. יש להמיס אבקת קולגנאז במי מלח חוצצי פוספט ללא CaCl 2 ו-MgCl 2 (^PBS−−, ראו טבלת חומרים) בריכוז של₂ מ"ג/מ"ל, ולסנן את התמיסה באמצעות מסנן נקבוביות של 0.22 מיקרומטר.
   2. הכינו 5 מ"ל aliquots, ולאחסן אותם ב -20 ° C. הפשירו וחממו מראש את האליציטוטים ל-37°C לפני השימוש.
2. ציפוי פלטה
   1. עבור ציפוי צלחת, פיפטה 1.5% תמיסת ג'לטין או 50 מיקרוגרם / מ"ל פיברונקטין (ראה טבלה של חומרים) לתוך צלחת התרבית (500 μL מספיק כדי לכסות את פני השטח של כל באר של צלחת 6 בארות), לדגור במשך 1 שעה ב 37 ° C.
   2. לאחר הדגירה, להסיר את הג'לטין העודף, ולשטוף את הבארות עם PBS^−−. שאפו את ה-PBS^, ותנו לצלחת להתייבש במכסה מנוע סטרילי.
      הערה: להרכבה מחדש של ג'לטין, יש להמיס את האבקה במים כדי ליצור תמיסה של 1.5%, ולאחר מכן לבצע אוטוקלבה ולאחסן בטמפרטורה של 4°C. ג'לטין ב 1.5% אינו נוזלי ב 4 ° C; לכן, יש לחמם אותו לפני ציפוי הצלחת. לחילופין, ניתן להשתמש בכל תמיסת ג'לטין מסחרית המתאימה לתרביות תאים לצורך ציפוי הצלחת.

2. הכנת מדגם

1. פרנכימה ריאתית
   1. שטפו את הדגימות שנאספו על ידי טבילתן בצינור של 50 מ"ל המכיל ^PBS−−.
   2. מעבירים את הדגימות לצלחת פטרי סטרילית, וקוצצים ידנית באמצעות מספריים כירורגיים (גודל אופטימלי: >2 ס"מ) למקטעים קטנים של כ-3-4 מ"מ כל אחד.
2. מקטעי עורקים
   1. שטפו את הדגימות שנאספו על ידי טבילתן בצינור של 50 מ"ל המכיל ^PBS−−.
   2. העבירו אותו לצלחת פטרי סטרילית ללא קיצוץ, שכן פיצול יגדיל את שטח הפנים של חתך הרוחב של קטע העורק, ובכך יגדיל את האפשרות לבודד שאינם ECs.

3. עיכול אנזימטי

1. שטפו את פרנכימת הריאה הקצוצה או את מקטע עורק הריאה פעמיים עם PBS^−−. צעד זה יסיר חלק גדול מהדם השיורי.
2. מניחים את הדגימות בצינורות של 15 מ"ל, ודגרים עם 5 מ"ל של collagenase מסוג 2 (ראה טבלת חומרים) למשך 10 דקות ב 37 ° C ו 5% CO₂. במהלך דגירה זו, ההתפרקות של המטריצה החוץ תאית משחררת תאים בודדים וצברי תאים.

4. התאוששות של תאים מעוכלים

1. הניחו מסננת פלדה / מתכת סטרילית (כלומר, מסננת תה בגודל רשת ~ 1 מ"מ) על החלק העליון של צינור איסוף של 50 מ"ל.
2. יוצקים את כל התוכן מצינורית 15 מ"ל על המסננת, מעסים בעדינות את הרקמה המעוכלת עם מרית, ושוטפים את הדגימה עם PBS⁻⁻ עד שצינורית האיסוף מתמלאת.
   הערה: שלב זה יבטל שברי רקמות גדולים בקנה מידה מילימטרי, ויבטיח יעילות רבה יותר של שלבי הסינון הבאים.

5. הסרה שאינה EC על ידי סינון

1. סנן את הזרימה שנאספה בשלב 4.2 באמצעות מסננת תאים בגודל רשת של 70 מיקרומטר, ואסוף את הזרימה בצינור טרי של 50 מ"ל.
2. לאחר מכן, השתמש במסננת תאים בגודל רשת של 40 מיקרומטר, ואסוף את הזרימה החוצה בצינור טרי של 50 מ"ל. תייג צינור זה כ"צינור 1".
   הערה: סינונים אלה בשלב 5.1 ובשלב 5.2 יסירו צברי תאים גדולים, המורכבים לעתים קרובות מאוכלוסיות תאים מעורבות.

6. שקיעה של צבירי תאים וזריעת תאים

1. צנטריפוגה את הדגימות ב 30 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי לשקע את אשכולות התא.
2. מוציאים בזהירות את הסופרנאטנט בעזרת פיפטה סטרילית (לא שופכים), ומניחים אותו בצינור טרי של 50 מ"ל ("צינור 2").
3. השהה את הגלולה ב"צינור 1", ומלא את הצינור עד 50 מ"ל עם ^PBS−−. מלא "צינור 2" עד 50 מ"ל עם ^PBS−−.
   הערה: משלב זה ואילך, שני הצינורות מטופלים באותו אופן.
4. צנטריפוגה את הדגימות ב 300 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
5. להשהות את הכדוריות עם 2 מ"ל של מדיום צמיחה (ראה טבלת חומרים), ולזרוע את התרחיף בשתי בארות נפרדות של צלחת מצופה מראש 6 בארות (שלב 1.2).
   הערה: משלב זה, הזן את התאים כל יומיים עם מדיום הגידול עד שהם מגיעים למפגש (כשבוע, בהתאם לגודל המדגם) על מנת לקבל מספר סביר של תאים למיון.

7. הרחבת תאים

1. שטפו את התאים עם 2 מ"ל PBS עם CaCl 2 ו-MgCl₂ (PBS++, ראו טבלת חומרים) כדי להסיר את שאריות תאי הדם (שימוש ב-PBS⁺⁺ חשוב כדי למנוע ניתוק תאים).
2. הסר את ^PBS++ והוסף מדיום תרבית רענן.
3. חזור על שלב 7.1 ושלב 7.2 עד שהתאים מגיעים למפגש (כשבוע, בהתאם לגודל הדגימה).

8. מיון תאים

1. נתק את התאים באמצעות 500 μL של טריפסין-EDTA (0.05%, ראה טבלת חומרים), צנטריפוגה, והשהה מחדש את הגלולה עם 190 μL של ^PBS−−.
2. הוסף 10 μL של נוגדן CD31-FITC מצומד פלואורסצנטי אנטי-אנושי (דילול 1:20, ראה טבלת חומרים), ודגור על תרחיף התא ב -4 ° C למשך 30 דקות.
3. שטפו את התאים באמצעות 10 מ"ל של PBS−−, צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, והשעו מחדש את הגלולה ב 300 מיקרוליטר של PBS−^−−.
4. בודד ואסוף תאים חיוביים CD31 (CD31+) על ידי מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות (FACS), באמצעות פייה של 100 מיקרומטר, ואסוף אותם בצינור.
   1. בהתאם לאסטרטגיית הגאט, הגדר תחילה את המורפולוגיה של התא באמצעות פרמטרי אזור פיזור הצד, SSC-A ו- FSC-A. לאחר מכן, בחר תאים בודדים באמצעות תרשים נקודות FSC-Area/FSC-Height או SSC-Area/SSC-Height, הגדר את התאים החיוביים במדגם המסומן לעומת דגימת הבקרה הלא מוכתמת, וכוון את התאים הפלואורסצנטיים לתוך צינור האיסוף²¹.
5. צנטריפוגה את תרחיף התא ב 300 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, ולהשעות את הגלולה ב 2 מ"ל של מדיום צמיחה לזריעה בבארות מצופות מראש של צלחת 6 בארות.

9. הרחבה לאחר מיון

1. יומיים לאחר מיון התאים, החליפו את המדיום המותנה במדיום גידול טרי.
2. חזור על שלב 7.1 ושלב 7.2 כל יומיים לצורך הרחבת תאים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

בידוד HLMEC
הבעיה העיקרית במהלך הבידוד של HLMVECs היא נוכחות של תאים מזהמים, שכן נימים מיקרוסקופיים לא ניתן להפריד בקלות מרקמת סטרומה. לכן, השגת טוהר גבוה ככל האפשר בשלבים המוקדמים ביותר של תהליך הבידוד היא חיונית על מנת להפחית את מעברי התרבית, ובכך את הזדקנות התא. כמו כן, פרוטוקול ביד?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

התפקידים המרובים שממלאים תאי אנדותל וסקולריים בפתופיזיולוגיה האנושית הופכים תאים אלה לכלי חיוני למחקרים פתוגנטיים ופרמקולוגיים במבחנה . מכיוון שECs מאתרים / איברים שונים של כלי דם מציגים תכונות ותפקודים מוזרים, הזמינות של ECs בריאים וחולים מהאיבר המעניין תהיה אידיאלית למטרות מחקר. לד?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% trypsin-EDTA 1X	GIBCO	25300-054	Used to detach cells from the culture plates
Anti CD31 Antibody, clone WM59	Dako	M0823	Used for CD-31 staining in immunocytochemistry. Dilution used: 1:50
Anti vWF Antibody	Thermo Fisher Scientific	MA5-14029	Used for von Willebrand factor staining in immunocytochemistry. Working dilution: 1:100
Autoclavable surgical scissors	Any		Used for chopping specimens
Cell strainers 40 µm	Corning	431750	Used during the second filtration
Cell strainers 70 µm	Corning	431751	Using during the first filtration
Collagenase, Type 2	Worthington	LS004177	Type 2 Collagenase used for enzymatic digestion. Working concentration: 2 mg/mL
Conjugated anti CD31 Antibody	BD Biosciences	555445	Used for cell sorting (1:20 dilution)
Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS) with  CaCl2 and MgCl2	Sigma-Aldrich	D8662	Used for cell washing before medium change
Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS) without CaCl2 and MgCl2	Sigma-Aldrich	D8537	Used for washing surgical specimens and cells before trypsinization
Endothelial Cell Growth Medium MV	PromoCell	C-22020	HLMVEC growth medium
Fibronectin	Sigma-Aldrich	F0895	Fibronectin from human plasma used for plate coating. Working concentration: 50 µg/mL
Gelatin from porcine skin, type A	Sigma-Aldrich	G2500	Used for plate coating
Type A gelatin	Sigma-Aldrich	g-2500	Gelatin from porcine skin used for plate coating. Working concentration: 1.5%