מיפוי מוח באמצעות מערך אלקטרודות גרפן

Summary

אנו מציגים הליך מיפוי מוח מבוסס מערך גרפן כדי להפחית את הפולשנות ולשפר את הרזולוציה המרחבית-זמנית. אלקטרודות משטח מבוססות מערך גרפן מציגות תאימות ביולוגית ארוכת טווח, גמישות מכנית והתאמה למיפוי מוח במוח מפותל . פרוטוקול זה מאפשר לבנות צורות מרובות של מפות חושיות בו זמנית וברצף.

Abstract

מפות קורטיקליות מייצגות את הארגון המרחבי של תגובות עצביות תלויות מיקום לגירויים סנסומוטוריים בקליפת המוח, ומאפשרות חיזוי של התנהגויות רלוונטיות מבחינה פיזיולוגית. שיטות שונות, כגון אלקטרודות חודרות, אלקטרואנצפלוגרפיה, טומוגרפיה של פליטת פוזיטרונים, מגנטואנצפלוגרפיה והדמיית תהודה מגנטית תפקודית, שימשו להשגת מפות קליפת המוח. עם זאת, שיטות אלה מוגבלות על ידי רזולוציה מרחבית-זמנית ירודה, יחס אות לרעש נמוך (SNR), עלויות גבוהות ואי-תאימות ביולוגית או גורמות נזק פיזי למוח. מחקר זה מציע שיטת מיפוי סומטוסנסורי מבוססת מערך גרפן כתכונה של אלקטרוקורטיקוגרפיה המציעה תאימות ביולוגית מעולה, רזולוציה מרחבית-זמנית גבוהה, SNR רצוי ונזק מינימלי לרקמות, תוך התגברות על החסרונות של שיטות קודמות. מחקר זה הדגים את ההיתכנות של מערך אלקטרודות גרפן למיפוי סומטוסנסורי בחולדות. הפרוטוקול המוצג יכול להיות מיושם לא רק על קליפת המוח הסומטוסנסורית, אלא גם על קליפות אחרות כגון קליפת המוח השמיעתית, הראייתית והמוטורית, ומספק טכנולוגיה מתקדמת ליישום קליני.

Introduction

מפה קורטיקלית היא קבוצה של טלאים מקומיים המייצגים תכונות תגובה לגירויים סנסומוטוריים בקליפת המוח. הם היווצרות מרחבית של רשתות עצביות ומאפשרים חיזוי של תפיסה וקוגניציה. לכן, מפות קליפת המוח שימושיות בהערכת תגובות עצביות לגירויים חיצוניים ובעיבוד מידע סנסומוטורי 1,2,3,4. קיימות שיטות פולשניות ולא פולשניות למיפוי קליפת המוח. אחת השיטות הפולשניות הנפוצות ביותר כוללת שימוש באלקטרודות תוך קורטיקליות (או חודרות) למיפוי 5,6,7,8.

הערכת מפות קליפת המוח ברזולוציה גבוהה לפי דרישה באמצעות אלקטרודות חודרות נתקלה במספר מכשולים. השיטה מייגעת מכדי להשיג מפה הגונה ופולשנית מדי ליישום לשימוש קליני, ואוסרת על פיתוח נוסף. טכנולוגיות עדכניות יותר כגון אלקטרואנצפלוגרפיה (EEG), טומוגרפיית פליטת פוזיטרונים (PET), מגנטואנצפלוגרפיה (MEG) ודימות תהודה מגנטית תפקודי (fMRI) צברו פופולריות מכיוון שהן פחות פולשניות וניתנות לשחזור. עם זאת, בהתחשב בעלויות הגבוהות שלהם וברזולוציה גרועה, הם משמשים במספר מוגבל של מקרים 9,10,11. לאחרונה, אלקטרודות משטח גמישות עם אמינות אות מעולה משכו תשומת לב רבה. אלקטרודות משטח מבוססות גרפן מדגימות תאימות ביולוגית ארוכת טווח וגמישות מכנית, ומספקות הקלטות יציבות במוח מפותל 12,13,14,15,16. הקבוצה שלנו פיתחה לאחרונה מערך רב-ערוצי מבוסס גרפן להקלטה ברזולוציה גבוהה וגירוי עצבי ספציפי לאתר על פני קליפת המוח. טכנולוגיה זו מאפשרת לנו לעקוב אחר ייצוגים קליפת המוח של מידע חושי במשך תקופה ממושכת.

מאמר זה מתאר את השלבים הכרוכים ברכישת מפה מוחית של קליפת המוח הסומטוסנסורית באמצעות מערך רב-אלקטרודות גרפן בן 30 ערוצים. כדי למדוד את פעילות המוח, מערך אלקטרודות גרפן ממוקם על האזור התת-דוראלי של קליפת המוח, בעוד שהכף הקדמית, הגפה הקדמית, הכף האחורית, הגפה האחורית, תא המטען והשפם מגורים באמצעות מקל עץ. הפוטנציאלים הסומטוסנסוריים-מעוררים (SEPs) נרשמים עבור אזורים סומטוסנסוריים. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם גם על אזורים אחרים במוח, כגון קליפת המוח השמיעתית, הראייתית והמוטורית.

Protocol

כל נהלי הטיפול בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של האוניברסיטה הלאומית אינצ'און (INU-ANIM-2017-08).

1. הכנת בעלי חיים לניתוח

הערה: השתמש בעכברוש Sprague Dawley (בן 8-10 שבועות) ללא הטיית המין עבור ניסוי זה.

1. מרדימים את החולדה עם 90 מ"ג/ק"ג קטמין ו-10 מ"ג/ק"ג קוקטייל קסילזין תוך צפקי. כדי לשמור על עומק ההרדמה הרצוי במהלך הניתוח, ספקו תוספת של 45 מ"ג/ק"ג קטמין ו-5 מ"ג/ק"ג קוקטייל קסילזין כאשר החולדה מראה סימני התעוררות.
2. ודאו שהחולדה נמצאת תחת הרדמה עמוקה ובדקו באופן קבוע השתקפויות גוף כגון צביטת בוהן, צביטת זנב ורפלקס הקרנית.
3. לגלח את הפרווה בין העיניים והחלק האחורי של האוזניים באמצעות גוזם .
4. יש למרוח משחה אופתלמית על העיניים כדי למנוע מהן להתייבש.

2. ניתוח לחשיפה למשטח קליפת המוח

1. תקן את ראש החולדה על המנגנון הסטריאוטקסי באמצעות מתאם סטריאוטקסי. כדי לשמור על טמפרטורת גוף של 37 מעלות צלזיוס במהלך הניתוח, הניחו את החולדה על כרית חימום מבוקרת טמפרטורה.
2. לעקר את האזור המגולח עם קרצוף לסירוגין של אלכוהול פובידון-יוד שלוש פעמים.
3. השתמש במלקחיים כדי לתפוס את הקרקפת בחוזקה ולהזריק 0.1 מ"ל של לידוקאין (2%) עם מזרק ישירות לתוך הקרקפת כדי לגרום להרדמה מקומית באזור הניתוח.
4. בצע חתך קו אמצע באורך 2-3 ס"מ עם אזמל ופרק את הקרקפת כדי לחשוף את הגולגולת.
5. הדקו את הקרקפת עם מלקחיים נגד יתושים כדי לחשוף את הגולגולת.
6. לגרד את פני השטח של הגולגולת עם מלקחיים כדי להסיר את periosteum.
7. קהה לנתח את השרירים מעל הגולגולת העורפית כדי לחשוף את cisterna magna מעל הציר בחלק העליון של חוט השדרה.
8. חותכים את cisterna magna עם הלהב כדי לנקז את הנוזל השדרתי ולשים גזה סטרילית בתוך החתך של cisterna magna כדי לספוג את הנוזל השדרתי כל הזמן כדי למנוע בצקת במוח ולמזער דלקת.
9. בעזרת עיפרון מסמנים על הגולגולת חלון מלבני בגודל 3 מ"מ בציר הקדמי ו-6 מ"מ בכיוון הצדדי הימני מהברגמה של ההמיספרה הימנית.
   הערה: הסימון חייב להבטיח מרחק של 1 מ"מ מקו האמצע כדי למנוע קרע מעולה של הסינוס הסגיטלי.
10. קודחים את האזור המסומן על פי הקואורדינטה הסטריאוטקסית ומסירים את הגולגולת עם רונגר עצם.
11. כדי להסיר את הדורה מאטר, כופפו את קצה המחט 26 G ל-90°, צרו חור בדורה מאטר, הרימו את הדורה מאטר, הכניסו מלקחיים לתוך החור וקרעו אותו במלקחיים.
12. הניחו גזה רטובה במי מלח על קליפת המוח הסומטוסנסורית, כדי למנוע ממנה להתייבש.

3. הכנת מערך אלקטרודות גרפן המחובר למערכת ההקלטה

1. הכן מערך אלקטרודות גרפן עם מחבר אומנטיקה (omnetics).
   1. נתק את מערך הגרפן מרובה האלקטרודות מבלי לגרום נזק על ידי יישום תמיסת המלח.
   2. הסר את הכיסוי החיצוני של חוטי הייחוס והארקה מהמחבר.
2. חבר את שלב הראש עם מערך אלקטרודות הגרפן למחבר.
3. חבר את כבל הממשק המקושר לשלב הראש למערכת ההקלטה.
4. אבטחו את קומפלקס מערך אלקטרודות הגרפן לתוך הזרוע הסטריאוטקסית.
5. כדי ללכוד אותות עצביים מכל הערוצים, מקמו את המערך על קליפת המוח הסומטוסנסורית ללא כל כיפוף, בהתאם לקואורדינטות הסטריאוטקסיות שנקבעו מראש.
6. הניחו חוט ייחוס מתחת לרקמה מאחורי העצם העורפית וחברו את חוט הארקה לשולחן האופטי המוארק.

4. גירוי פיזי ורישום SEPs למיפוי

1. פתח את תוכנת הקלטת האותות העצביים.
2. הגדר את סביבת תוכנת ההקלטה: (1) הגדר את קצב הדגימה עבור SEPs ומסנן חריצים (60 או 50 הרץ, תדר של חשמל ביתי) כדי להסיר את הרעש מקו החשמל.
3. למיפוי שפם, כופפו את השפם בעזרת מקל דק.
4. כל הזמן לדקור את הכף הקדמית, הגפה הקדמית, הכף האחורית, הגפה האחורית, ואת תא המטען עם מקל עץ למיפוי הגוף.
5. רשום אותות עצביים במערכת רכישת הנתונים למשך הזמן שצוין.

5. המתת חסד של בעלי חיים

1. לאחר כל הליכי ההקלטה, להקריב את החולדות עם הרדמה באמצעות >5% isoflurane ולבצע דיסקציה צוואר הרחם.

6. מדידת SEP למיפוי קליפת המוח

1. פתחו את MATLAB בשם הקוד read_Intan_RHS2000_file.m לצורך ניתוח אותות.
   הערה: ניתן להוריד read_Intan_RHS2000_file.מ מ 'מ 'https://intantech.com/downloads.html?tabSelect=Software".
2. לחץ על הפעל לחצן, בחר את קובץ ההקלטה עם סיומת שם הקובץ ".rhs" והמתן עד שהקובץ יעובד וייקרא.
3. הזן את הפקודה "plot (t, amplifier_data("channel number",:))" כדי ליצור תרשים קו דו-ממדי של נתוני ההקלטה, למצוא את ה- SEPs ולחשב את המשרעת של SEPs בכל הערוצים.
   הערה: הזן את מספר הערוץ ב"מספר ערוץ". לדוגמה, "plot(t, amplifier_data(1,:))" יוצר את תרשים הקו הדו-ממדי של ערוץ 1. בנוסף, כאשר הנסיין מחשב את המשרעת של התגובה, בחר את התגובה שהוקלטה מכל ערוץ.
4. קבל נתונים על ידי צביעת הרשת בגוון שונה בהתאם למשרעת של SEPs.
   הערה: הפקודה "imagesc" של MATLAB מסייעת להשיג מפה טופוגרפית במהירות רבה יותר.

תוצאות

פרוטוקול זה מתאר כיצד מערך רב ערוצי גרפן מותקן על פני השטח של המוח. המפה הסומטוסנסורית נבנתה על ידי רכישת תגובות עצביות לגירויים פיזיים וחישוב המשרעת של התגובה. איור 1 מראה את הסכמה של הניסוי הזה.

איור 2A מציג את המאפיינים המבניים של מערך אלקטר...

Discussion

הפרוטוקול המוצג מספק תהליך מעמיק, שלב אחר שלב, המסביר כיצד לגשת ולמפות את התגובות הסומטוסנסוריות של חולדות באמצעות מערך אלקטרודות גרפן. הנתונים שנרכשו בפרוטוקול הם SEPs המספקים מידע סומטוסנסורי המקושר באופן סינפטי לכל חלק בגוף.

יש לשקול מספר היבטים של פרוטוקול זה. בעת שאיבת ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1mL syringe	KOREAVACCINE CORPORATION		injecting the drug for anesthesia
3mL syringe	KOREAVACCINE CORPORATION		injecting the drug for anesthesia
Bone rongeur	Fine Science Tools	16220-14	remove the skull
connector	Gbrain		Connect graphene electrode to headstage
drill	FALCON tool		grind the skull
drill bits	Osstem implant		grind the skull
Graefe iris forceps slightly curved serrated	vubu	vudu-02-73010	remove the tissue from the skull or hold wiper
graphene multielectrode array	Gbrain		records signals from neuron
isoflurane	Hana Pharm Corporation		sacrifce the subject
ketamine	yuhan corporation		used for anesthesia
lidocaine(2%)	Daihan pharmaceutical		local anesthetic
Matlab R2021b	Mathworks		Data analysis Software
mosquito hemostats	Fine Science Tools	91309-12	fasten the scalp
ointment	Alcon		prevent eye from drying out
povidone	Green Pharmaceutical corporation		disinfect the incision area
RHS 32ch Stim/Record headstage	intan technologies	M4032	connect connector to interface cable and contain intan RHS stim/amplifier chip
RHS 6-ft (1.8m) Stim SPI interface cable	intan technologies	M3206	connect graphene electrode to headstage
RHS Stim/Recording controller software	intan technologies		Data Acquisition Software
RHS stimulation/ Recording controller	intan technologies	M4200
saline	JW Pharmaceutical
scalpel	Hammacher	HSB 805-03
stereotaxic instrument	stoelting		fasten the subject
sterile Hypodermic Needle	KOREAVACCINE CORPORATION		remove the dura mater
Steven Iris Tissue Forceps	KASCO	50-2026	remove the dura mater
surgical blade no.11	FEATHER		inscise the scalp
surgical sicssors	Fine Science Tools	14090-09	inscise the scalp and remove the dura mater
wooden stick			whisker stimulation
xylazine	Bayer Korea		used for anesthesia