התפתחות זני לישמניה עם ביטוי מכונן של eGFP

Summary

במאמר זה נתאר את המתודולוגיה ששימשה ליצירת הזנים L. panamensis ו-L . donovani המבטאים את הגן ל-eGFP כטרנסגן משולב יציב באמצעות מערכת pLEXSY. טפילים נגועים שובטו על ידי הגבלת דילול, ושיבוטים בעלי עוצמת הפלואורסצנטיות הגבוהה ביותר בשני המינים נבחרו לשימוש נוסף בבדיקות סינון תרופות.

Abstract

טפילים פרוטוזואניים מהסוג לישמניה גורמים ללישמניאזיס , מחלה בעלת ביטויים קליניים משתנים המשפיעה על מיליוני אנשים ברחבי העולם. זיהום עם L. donovani יכול לגרום למחלה קרבית קטלנית. בפנמה, קולומביה וקוסטה ריקה, L. panamensis אחראי לרוב המקרים המדווחים של לישמניאזיס עורית ורירית. לימוד מספר רב של מועמדים לתרופות עם המתודולוגיות הזמינות עד כה הוא די קשה, בהתחשב בכך שהם מייגעים מאוד להערכת הפעילות של תרכובות נגד צורות תאיות של הטפיל או לביצוע בדיקות in vivo . בעבודה זו אנו מתארים את הדור של הזנים L. panamensis ו-L. donovani עם ביטוי מכונן של הגן המקודד לחלבון פלואורסצנטי ירוק משופר (eGFP) המשולב בלוקוס המקודד ל-18S rRNA (ssu). הגן המקודד eGFP התקבל מווקטור מסחרי והוגבר על ידי תגובת שרשרת פולימראז (PCR) כדי להעשיר אותו ולהוסיף אתרי הגבלה לאנזימים BglII ו-KpnI. האמפליקון eGFP בודד על ידי טיהור ג'ל אגרוז, עוכל עם האנזימים BglII ו-KpnI, ונקשר לווקטור ביטוי הלישמניה pLEXSY-sat2.1 שעוכל בעבר עם אותה קבוצה של אנזימים. וקטור הביטוי עם הגן המשובט הופץ ב- E. coli, מטוהר, ונוכחות העלון אומתה על ידי PCR המושבה. הפלסמיד המטוהר היה ליניארי ושימש להעברת טפילי L. donovani ו - L. panamensis. שילוב הגן אומת על ידי PCR. הביטוי של הגן eGFP הוערך על ידי ציטומטריית זרימה. טפילים פלואורסצנטיים שובטו על ידי הגבלת דילול, ושיבוטים בעלי עוצמת הפלואורסצנטיות הגבוהה ביותר נבחרו באמצעות ציטומטריית זרימה.

Introduction

טפילים פרוטוזואניים מהסוג לישמניה גורמים ללישמניאזיס, מחלה בעלת מגוון רחב של ביטויים קליניים. מחלה זו נפוצה ב-98 מדינות, ושכיחותה השנתית נאמדת ב-0.9 עד 1.6 מיליון מקרים¹. מיני לישמניה שהם פתוגניים לבני אדם מחולקים לשני תת-סוגים, כלומר L. (לישמניה) ול'. (ויאניה). זיהום עם כמה מינים השייכים L. תת-סוג (לישמניה), כגון L. donovani ו-L. infantum, עלול לגרום ללישמניאזיס ויסצרלי (VL), שהוא קטלני אם אינו מטופל². מינים השייכים ל- L. תת-סוג (Viannia) קשור לרוב המקרים של לישמניאזיס עורי (CL) ולישמניאזיס רירית (MCL) במרכז ודרום אמריקה, במיוחד בפנמה, קולומביה וקוסטה ריקה, כאשר L. panamensis הוא הסוכן האטיולוגי העיקרי של מצגות קליניות אלה ^3,4.

כימותרפיה קיימת נגד לישמניה הכוללת תרופות כגון אנטימוניאלים מחומשים, מילטפוסין ואמפוטריצין B היא רעילה מאוד ויקרה. יתר על כן, עמידות מוגברת לתרופות בעשורים האחרונים נוספה לגורמים המפריעים לטיפול יעיל בחולים ברחבי העולם⁵. הבדלים משמעותיים הודגמו בין מינים בסוג לישמניה ביחס לרגישות לתרופות, במיוחד בין מינים בעולם החדש והישן ^6,7. מסיבות אלה, יש צורך להפנות מאמצים לזיהוי ופיתוח של תרופות חדשות נגד לישמניה, תוך מתן תשומת לב מיוחדת לגישות ספציפיות למינים. לימוד ספריות גדולות של מועמדים לתרופות עם מתודולוגיות מסורתיות הוא די קשה, בהתחשב בכך מתודולוגיות אלה הם מאוד מייגע להערכת הפעילות של תרכובות נגד amastigotes תאית או לביצוע ניסויים in vivo ⁸; לכן, היה צורך לפתח טכניקות חדשות המפחיתות חסרונות אלה, כולל יישום גנים של כתב ופיתוח בדיקות סינון פנוטיפיות בעלות תוכן גבוה⁹.

השימוש בגנים של כתבים הראה את הפוטנציאל להגביר את היעילות של תהליך סינון התרופות מכיוון שהוא מאפשר פיתוח של מבחני תפוקה גבוהה ו- in vivo. טפילי לישמניה רקומביננטיים המבטאים מספר גנים של כתבים נוצרו על ידי קבוצות מחקר שונות. גנים עיתונאיים, כגון β-גלקטוזידאז, β-לקטמאז ולוציפראז, הוכנסו למספר מיני לישמניה באמצעות וקטורים אפיזומליים, והראו תועלת מוגבלת לבדיקת תרופות בצורות חוץ-תאיות ותוך-תאיות של הטפיל 10,11,12,13,14,15. גישות אלה יש את המגבלה של דרישת לחץ סלקטיבי חזק בתרבית כדי למנוע חיסול של המבנה האפיזומלי, כמו גם את השימוש בריאגנטים נוספים כדי לחשוף את הפעילות של הגן המדווח. לעומת זאת, החלבון הפלואורסצנטי הירוק (GFP) וגרסתו, החלבון הפלואורסצנטי הירוק המשופר (eGFP), שימשו ביצירת מספר רב של זני לישמניה טרנסגניים לבדיקות סקר תרופות חוץ גופיות בשל גמישותם ורגישותם, כמו גם האפשרות להפוך את תהליך הסינון לאוטומטי באמצעות ציטומטריית זרימה או פלואורומטריה^{15, 16,17,18,19}. למרות התוצאות המבטיחות, תרביות של זנים טרנסגניים אלה היו הטרוגניות מאוד ברמות הפלואורסצנטיות שלהם, שכן מספר העותקים של הגן GFP לא היה זהה בכל הטפילים. יתר על כן, שמירה על פלואורסצנטיות דרשה לחץ סלקטיבי מתמיד על הטפילים בתרבית, שכן הגן GFP הוכנס במבנה אפיזומלי.

מהסיבות שצוינו קודם לכן, מאמצים רבים התמקדו בפיתוח מתודולוגיות חדשות לייצור זנים רקומביננטיים יציבים. מאמצים אלה הסתמכו בעיקר על שילוב של גנים מדווחים לתוך loci ריבוזומלי, תוך ניצול שיעורי השעתוק הגבוהים יותר של גנים ריבוזומליים²⁰. זנים של L. infantum ו- L. amazonensis נוצרו לאחר ששילבו את הגנים המקודדים עבור β-galactocidase 21, IFP 1.4, iRFP²² ו- tdTomato²³, והם הוערכו על יעילותם בבדיקות סינון תרופות. קבוצות שונות פיתחו זני L. donovani המבטאים GFP באופן קונסטיטוטיבי על ידי שילוב גן הקידוד שלו בלוקוס RNA ריבוזומלי 18S (ssu locus) באמצעות רקומבינציה הומולוגית^24,25; הם הראו ביטוי GFP יציב והומוגני באוכלוסייה הנגועה, כולל אמסטיגוטים תוך-תאיים 24,25, והם יושמו בהצלחה בבדיקות סקר תרופות^24,25,26. Bolhassani et ^al.27 פיתחו זנים של L. major ו- L. infantum המבטאים GFP כטרנסגן משולב. הם השתמשו בווקטור האינטגרציה pLEXSY, שתוכנן במקור עבור ביטוי מהונדס של חלבונים במערכת באמצעות L. tarentolae כמארח²⁸. וקטור pLEXSY-GFP הוכח כיעיל מאוד ליצירת זני לישמניה שונים המבטאים באופן מכונן GFP 24,25,27,29,30. בטפילים אלה, פלואורסצנטיות היא הומוגנית ומתוחזקת בצורות תוך תאיות, להיות מסוגל להיות מזוהה נגעים כרית רגל של עכברים נגועים²⁷.

בעבודה זו, אנו מתארים את המתודולוגיה המשמשת ליצירת זנים L. panamensis ו- L. donovani המבטאים את הגן המקודד ל- eGFP כטרנסגן משולב באמצעות מערכת pLEXSY. הזנים הנוצרים בתהליך זה משמשים במעבדה שלנו לביצוע בדיקות סינון תרופות המעריכות את הפעילות האנטי-לישמניה הפוטנציאלית של מולקולות ממקור טבעי וסינתטי.

Protocol

כדי לשמור על הדגימות סטריליות, כל השלבים הכוללים תרבית טפילים צריכים להתבצע בתוך מכסה מנוע ברמת בטיחות ביולוגית 2 (BSL-2) או על פי תקנות הבריאות והבטיחות המקומיות. סיכום גרפי של פרוטוקול זה ניתן למצוא באיור 1.

איור 1: סכמה מסכמת של הפרוטוקול ליצירת טפילי L. panamensis ו-L. donovani המבטאים eGFP באמצעות משפחת הווקטורים pLEXSY-2.1. כל ששת הסעיפים העיקריים המתוארים במאמר מתוארים כאן. 1) הגברה והחדרה של הגן eGFP לווקטור pLEXSY-2.1: גן המטרה מוגבר, ומוסיף את אתרי הזיהוי של האנזימים KpnI ו- BglII, וגם אמפליקון eGFP וגם פלסמיד pLEXSY מתעכלים ברצף עם שני האנזימים לקשירה עוקבת עם ליגאז T4. 2) ליניאריזציה של פלסמיד ביטוי pLEXSY: מבנה pLEXSY + eGFP מתעכל עם SwaI לליניאריזציה וטיהור של קלטת ביטוי 7-8 kbp. 3) טרנספקציה 4) ברירה רב-שבטית: פרומסטיגוטות לישמניה מועברות בקלטת הביטוי על ידי אלקטרופורציה ומוחזרות לתרבית לבחירת אנטיביוטיקה של טפילים רקומביננטיים. פלואורסצנטיות הטפיל מאושרת באמצעות ציטומטריית זרימה. 5) אישור אינטגרציה גנומית 6) שיבוט על ידי הגבלת דילול: אינטגרציה של קלטת הביטוי pLEXSY-eGFP מאושרת על ידי PCR אבחנתי, באמצעות הכלאה של פריימר קדמי לקלטת הביטוי והכלאה של פריימר הפוך לרצף כרומוזומלי הנעדר בקלטת הביטוי. תרביות נגועות יכולות להיות מועשרות עבור טפילים פלואורסצנטיים על ידי שיבוט על ידי הגבלת דילול, ושיבוטים עם עוצמות הפלואורסצנטיות הממוצעות הגבוהות ביותר ניתן לבחור ליישומים נוספים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

1. הגברה והחדרה של הגן eGFP לווקטור pLEXSY-2.1

1. הגברה של הגן eGFP
   הערה: מכיוון שפרוטוקול זה משתמש במשפחת הווקטורים pLEXSY-2.1 (ראה טבלת חומרים) לביטוי מכונן של חלבוני מטרה בעקבות שילוב קלטת הביטוי לתוך מוקד rRNA כרומוזומלי 18S (ssu) של מיני לישמניה , הצעד הראשון הוא להכניס לגן eGFP את הרצפים המכילים את אתרי ההגבלה המאפשרים את הכנסתו לווקטורים pLEXSY-2.1. במקרה זה, מכיוון ש-eGFP נדרש להתבטא רק באופן ציטוסולי, אתרי ההגבלה של האנזימים BglII ו-KpnI נוספו בקצוות 5' ו-3' של הגן eGFP, בהתאמה. שיבוט עם KpnI גורם לאיחוי של חלבון המטרה לתג פוליהיסטידין C-terminal של שש שאריות, ואחריו קודון עצירה המקודד בפלסמיד pLEXSY-2.1 לטיהור נוסף של החלבון המעניין. מסיבה זו, רצף הפריימר ההפוך אינו מכיל קודון עצירה.
   1. בהתאם למקור הפלסמיד עבור eGFP, נתח את רצף המטרה באמצעות כלי ניתוח הגבלה כגון NEBcutter (http://tools.neb.com/NEBcutter/index.php3)³¹ כדי לוודא שהוא אינו מכיל אתרים פנימיים עבור אנזימי הגבלה המשמשים לשיבוט (BglII ו - KpnI) או עבור SwaI, שהוא האנזים המשמש לליניאריזציה וקטורית לפני טרנספקציה.
   2. תכננו פריימרים קדימה ואחורה להגברה eGFP המכילים את רצפי ההגבלה BglII ו-KpnI. לדוגמה, מקור ה-eGFP לפרוטוקול זה היה פלסמיד³² pEGFP-N1-1X, ורצפי הפריימר היו אלה שדווחו על ידי Bolhassani et ^al.27:
      פריימר קדמי (EGFP1): 5'-ATGATATCAAGATCTATGGTGAGCAAGGGC-3' (אתר הגבלת BglII מודגש).
      פריימר הפוך (EGFP2): 5'-GCTCTAGATTAGGTACCCTTGTACAGCTCGTC-3' (אתר הגבלת KpnI מודגש).
   3. להגביר את גן המטרה באמצעות פולימראז באיכות גבוהה כדי להבטיח את שימור רצף הקידוד. לדוגמה, עבור פריימרים EGFP1 ו- EGFP2, הפעל את פרוטוקול מחזור PCR כפי שדווח על ידי Bolhassani et ^al.27. הפעל דנטורציה ראשונית של 2 דקות ב- 94 ° C, ואחריה 30 מחזורים של 30 שניות ב- 94 °C, 30 שניות ב- 57 °C ודקה אחת ב- 72 °C. הפעל שלב הארכה אחרון של 10 דקות ב- 72 ° C. מוסיפים את הפריימרים בריכוז סופי של 0.2 מיקרומטר.
   4. לטהר את הקטע באמצעות ערכת טיהור מוצר PCR קונבנציונלית, או משקעים סטנדרטיים של נתרן אצטט ואתנול, כמתואר במקום אחר³³.
2. הכנסת eGFP לווקטור הביטוי pLEXSY-2.1
   1. חתוך את הקצוות של מוצר eGFP-PCR באמצעות BglII ו - KpnI, בהתאם להוראות היצרן.
      1. ראשית, הגדר את התגובה עבור האנזים הדורש את ריכוז המלח הנמוך ביותר (במקרה זה, KpnI), על פי הוראות היצרן, ודגר ב 37 ° C במשך 1 שעות.
      2. לאחר מכן, להוסיף 100 mM NaCl ו 10 יחידות של BglII ולדגור במשך 15 דקות. לטהר את התגובה, כמתואר בשלב 1.1.4.
   2. עכל את וקטור ביטוי pLEXSY עם BglII ו - KpnI, בהתאם לפרוטוקול העיכול הרציף המתואר בשלב 1.2.1.
   3. קשר את וקטור pLEXSY ואת הגן eGFP עם ליגאז T4 באמצעות יחס מולארי של 1:3 (וקטור:insert). הוסף בקצרה 100 ng של pLEXSY מעוכל ו 28 ng של מוצר eGFP מעוכל לתגובה של 20 μL המכילה חיץ ליגאז בריכוז סופי של 1x ו -3 יחידות של ליגאז T4 DNA. לדגור לילה ב 4 °C (75 °F).
   4. התמירו תאי E. coli מתאימים, כגון XL-10, DH5α או DH10B, עם מוצר הקשירה שהתקבל בשלב 1.2.3 באמצעות פרוטוקולי טרנספורמציה סטנדרטיים³³. צלחת את התאים מותמרים באגר Luira-Bertani (LB)-ampicillin ולדגור במשך 24 שעות ב 30 ° C כדי לבחור שיבוטים רקומביננטיים (פלסמידים pLEXSY יציבים יותר E . coli ב 30 ° C מאשר ב 37 ° C).
   5. מסך לנוכחות של הכנס פלסמידים על ידי PCR מושבה.
      1. בחרו מושבות בודדות, השהו מחדש ב-20 מיקרוליטר מים נטולי נוקלאז, חממו ב-95°C למשך 15 דקות, וקחו 1 μL של הליזט כתבנית DNA עבור PCR מושבה. השתמש בפריימר קדימה להגברת eGFP, המתואר בשלב 1.1.2 (בדוגמה זו, EGFP1), ובפריימר A264 (5'-CATCTATAGAGAAGTACACGTAAAAG-3') כפריימר הפוך²⁹.
      2. הפריימר A264 מתוכנן לאשל 80 bp לאחר קודון העצירה של ההוספה בווקטורי ביטוי pLEXSY-2.1. לדוגמה, עבור זוג הפריימר EGFP1 + A264, השתמש בפרוטוקול מחזור PCR המורכב מדנטורציה ראשונית של 2 דקות ב- 94 ° C, ואחריה 30 מחזורים של 30 שניות ב- 94 ° C, 30 s ב- 50 ° C ודקה אחת ב- 72 ° C. הפעל שלב הארכה אחרון של 10 דקות ב- 72 ° C. הפריימרים מתווספים בריכוז סופי של 0.2 מיקרומטר.
         הערה: המוצר הצפוי בשימוש בערכת פריימר זו הוא באורך 859 bp. אתרי החישול של הפריימרים EGFP1 ו-A264 מתוארים באיור 2.
   6. הכן את DNA פלסמיד מטוהר משיבוט חיובי עבור transfection הבא באמצעות ערכת בידוד פלסמיד מסחרית או משקעים אלקליין סטנדרטי³³. השתמש 50 מ"ל של תרבית לילה ב 30 ° C לבידוד של מינימום של 10 מיקרוגרם של שיבוט פלסמיד/חיובי.

2. ליניאריזציה של פלסמיד ביטוי pLEXSY

1. השתמש לפחות 10 מיקרוגרם של פלסמיד pLEXSY-eGFP מטוהר לעיכול עם SwaI (אתר זיהוי: 5'-ATTTAAAT-3). יש לעכל במשך 3-4 שעות ב-25°C ולהשבית בחום ב-65°C למשך 20 דקות.
2. הפעל את מוצר העיכול באלקטרופורזה של ג'ל אגרוז כדי להפריד את השברים המתקבלים. עיכול זה ייצור שני פרגמנטים, מקטע 2.9 kbp המייצג את האלמנטים הדרושים לשכפול ובחירה ב- E. coli, ומקטע 7-8 kbp המייצג את קלטת הביטוי הליניארית.
3. לטהר את קלטת הביטוי באמצעות ערכת מיצוי ג'ל אגרוז מסחרית.

3. טרנספקציה של L. panamensis ו L. donovani על ידי electroporation

הערה: תרבות הלישמניה מבוצעת כמתואר במקום אחר³⁴. בדוגמה זו, L. panamensis ו-L . donovani promastigotes תורבתו בתווך החרקים של שניידר, בתוספת 20% (v/v) נסיוב בקר עוברי (FBS) ו-50 מיקרוגרם/מ"ל גנטמיצין, והודגרו בטמפרטורה של 26°C.

1. לגדל את תרביות הטפילים עד שיש מספיק promastigotes בשלב לוג או בשלב נייח מוקדם להשתמש בערך 4 x 10⁷ טפילים לכל transfection. צפיפות התאים המרבית לבקבוק תרבית לפני ההגעה לשלב הנייח עשויה להשתנות בהתאם למין הלישמניה ועד כמה הזנים מותאמים לתנאי המעבדה. אגרו את התוכן של צלוחיות תרבית מרובות במידת הצורך.
2. צנטריפוגה את תרבית הטפיל ב 2,000 x גרם במשך 3 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
3. יש להשהות מחדש את הגלולה בחיץ אלקטרופורציה בטמפרטורה של 4°C (21 mM HEPES, 137 mM NaCl, 5 mM KCl, 0.7 mM Na₂HPO₄ ו-6 mM גלוקוז; pH 7.5)²⁷ כדי לקבל ריכוז של 1 x 10⁸ טפילים/מ"ל. לשים על קרח במשך 10 דקות.
   הערה: יש לעקר את מאגר האלקטרופורציה על-ידי סינון לפני השימוש.
4. במקביל, צינורות pre-chill עם 2-10 מיקרוגרם של pLEXSY-eGFP ליניארי לבנות בנפח מרבי של 50 μL של מים או 10 mM tris buffer (pH 8.0) ו electroporation cuvettes של d = 2 מ"מ.
5. הוסף 350 μL של טפילים מקוררים מראש לצינור עם פלסמיד ליניארי ולהעביר את כל 400 μL לקובט electroporation על קרח. במקביל, אלקטרופורציה תאי הטפיל ללא DNA פלסמיד כבקרה שלילית.
6. אלקטרופורט באמצעות אחד משני הפרוטוקולים הבאים:
   דעיכה מעריכית: 450 V, 450 μF, פעימה אחת.
   קבוע זמן: 450 V, T = 3.5 אלפיות השנייה, פעימה אחת.
   הערה: פרוטוקולים אלה הופעלו באמצעות פולסר גנים מסחרי (Table of Materials) עם מודולי PC ו-CE.
7. מחזירים את הקובט לקרח למשך 10 דקות ומעבירים את הטפילים המחושמלים ל-5 מ"ל של מדיום התרבית המתאים. דוגמה זו השתמשה בתווך החרקים של שניידר בתוספת FBS של 20% (v/v). לדגור ב 26 ° C במשך 20 שעות.

4. ברירה רב-שבטית בתרבית

1. כ-20 שעות לאחר ההתחשמלות, התבוננו בתרביות תחת מיקרוסקופ. לפחות מחצית מאוכלוסיית הטפילים צריכה להראות מורפולוגיה ותנועתיות טובות מבחינה חזותית (פרומסטיגוטים דמויי טיפות עם שוטונים מתנדנדים הנעים במדיה ו/או יוצרים אגרגטים פעילים של טפילים). הוסף את האנטיביוטיקה הסלקטיבית המתאימה בהתאם לפלסמיד pLEXSY בשימוש. בדוגמה זו, pLEXSY-sat2.1 משמש, המכיל סטרפטוטריצין אצטילטרנספראז כסמן בחירה. לכן, השתמש nourseothricin כאנטיביוטיקה סלקטיבית בריכוז 0.1 מ"ג / מ"ל.
2. עקבו אחר התרביות באופן מיקרוסקופי עד שנראה הבדל ברור בין הטפילים שהתחשמלו עם ובלי DNA פלסמיד.
3. אמת את פלואורסצנטיות הטפיל באמצעות ציטומטריית זרימה.
   1. צנטריפוגה 1 מ"ל של תרבית השלב הנייח ב 2,000 x גרם במשך 3 דקות ב RT. לשטוף פעמיים PBS ולהשעות מחדש את הגלולה הסופית ב 1 מ"ל של PBS.
      הערה: ניתן לזהות את הפלואורסצנטיות של eGFP בערוץ FL1 של רוב הציטומטרים המסחריים. השג הגדרות עבור פיזור קדימה וצדדי, וערוץ FL1 עשוי להשתנות בין ציטומטרים. עבור דוגמה זו, נעשה שימוש בציטומטר מרחב CyFlow (Sysmex).
   2. הפעל את הדגימות, תוך איסוף 20,000 אירועים במהירות של 0.5 μL/s, והגדר את ערכי הרווח עבור ערוצי הפיזור קדימה (FSC), פיזור הצד (SSC) והפלואורסצנטיות 1 (FL-1) כ- 225.0, 200.0 ו- 520.0, בהתאמה. הפעל דגימת ביקורת עם טפילים שאינם פלואורסצנטיים כדי לקבוע את אוכלוסיית הטפילים בתרשים נקודות FSC לעומת SSC.
   3. צור שער (G1) המכיל את אוכלוסיית הטפילים וסנן את תעלת FL-1 דרך שער זה לצורך קביעת האוטופלואורסצנטיות של פרומסטיגוטים וקביעת שער טווח (G2) עבור ערוץ FL-1.
   4. הפעל את הטפילים הנגועים כדי לוודא אם יש פלואורסצנטיות. רשום את אחוז הטפילים ב- G1 שהם פלואורסצנטיים ואת הממוצע של עוצמת הפלואורסצנטיות ב- G2.

5. אישור אינטגרציה גנומית

הערה: ניתן לאשר שילוב של קלטת הביטוי pLEXSY-eGFP על ידי PCR אבחנתי, באמצעות הכלאה של פריימר קדמי לקלטת הביטוי (משתנה בהתאם לווקטור pLEXSY-2.1 בשימוש) והכלאה של פריימר הפוך F3002 (5'-CTGCAGGTTCACCTACAGCTAC-3') לרצף כרומוזומלי של איגוף ssu, הנעדר בקלטת הביטוי. בדוגמה זו, הפריימר F2999 קדימה (5'-CCTAGTATGAAGATTTCGGTGATC-3') משמש להכלאה בקסטת הביטוי pLEXSY-sat2.1. ייצוג סכמטי של קלטת הביטוי המשולבת ואתרי חישול פריימר עבור PCR אבחוני מתואר באיור 2.

1. לטהר את הדנ"א הגנומי מ 2-5 מ"ל של תרבית טפיל בשלב נייח על ידי מיצוי פנול / כלורופורם קונבנציונאלי³⁵ או עם ערכה מסחרית.
2. בצע את ה- PCR האבחנתי עבור pLEXSY-sat2.1 באמצעות פרוטוקול רכיבה על אופניים המורכב מדנטורציה ראשונית של 2 דקות ב- 94 מעלות צלזיוס, ואחריה 30 מחזורים של 30 שניות ב- 94 מעלות צלזיוס, 30 שניות ב- 53 מעלות צלזיוס ודקה אחת ב- 72 מעלות צלזיוס. הפעל שלב הארכה אחרון של 10 דקות ב- 72 ° C. הפריימרים מתווספים בריכוז סופי של 0.2 מיקרומטר.

איור 2: ייצוג סכמטי של קלטת הביטוי המשולבת. תיבות המסומנות כ-Chr-S (אפור) מייצגות את הרצפים הכרומוזומליים הסמוכים של מוקד ה-rRNA 18S (ssu) שבו משולבת קלטת הביטוי. קלטת הביטוי המשולבת מורכבת מרצפים של 5' ו-3' (כחול) עבור רקומבינציה הומולוגית לתוך לוקוס ssu , מקדם ריבוזומלי נוסף של לישמניה (אדום) לייצור חלבון משופר, גן eGFP (ירוק), גן סמן ברירה (צהוב), ושלושה אזורים לא מתורגמים (אפור בהיר), כלומר utr1, 2 ו-3, המספקים את אותות השחבור לעיבוד mRNA לאחר שעתוק לביטוי אופטימלי של eGFP וסמן הבחירה בטפילי לישמניה . אתרי חישול עבור פריימרים קדימה ואחורה המשמשים לאימות נוכחות ההוספה על ידי PCR מושבה (שלב 1.2.5) מסומנים על ידי החיצים השחורים המסומנים כ- cpcr-fwd (פריימר EGFP1) ו- cpcr-rev (פריימר A264) בהתאמה, התוחמים מוצר של 859 bp. אתרי החישול של פריימרים קדימה ואחורה המשמשים לאימות אינטגרציה גנומית על ידי PCR אבחוני (שלב 5) מסומנים בחצים השחורים המסומנים כ-sat-fwd (פריימר F2999) ו-ssu-rev (פריימר F3002), בהתאמה, התוחמים מוצר של 2,271 bp. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

6. שיבוט על ידי הגבלת דילול (אופציונלי)

1. לאחר אישור פלואורסצנטיות באמצעות ציטומטריית זרימה, יש להכין דילול של טפילים רקומביננטיים בריכוז של חמישה פרומסטיגוטים/מ"ל³⁶.
2. הוסף 100 μL של דילול זה לתוך כל באר של צלחת 96 באר. באופן זה, הלוחות נזרעים בצפיפות ממוצעת של 0.5 פרומסטיגוטות/באר, מה שמבטיח שחלק מהבארות יקבלו טפיל בודד תוך מזעור ההסתברות ליותר מטפיל אחד לכל באר³⁶.
3. השאירו את הצלחת ללא הפרעה למשך 12 שעות לפחות. עקבו אחר הצלחת באופן מיקרוסקופי בהגדלה מינימלית של פי 100 עד לגילוי בארות עם צמיחת טפילים.
4. כאשר צלחת מלאה בטפילים, השתמש בתוכן כדי לחסן תרבית 5 מ"ל. זה לוקח 1-2 שבועות.
5. כאשר תרביות זרעי שיבוט מגיעות לשלב הנייח, אמת פלואורסצנטיות באמצעות ציטומטריית זרימה, כמתואר בשלב 4.3. בחר את השיבוטים שישמשו לבדיקות מבחנה ו- in vivo נוספות בהתבסס על אחוז הטפילים הפלואורסצנטיים ועוצמת הפלואורסצנטיות הממוצעת שנמדדה בערוץ FL-1 . כוונו לשיבוטים עם 98%-99% של טפילים פלואורסצנטיים ובחרו את אלה עם עוצמת הפלואורסצנטיות הממוצעת הגבוהה ביותר.

תוצאות

לאחר בניית מבנה pLEXSY-eGFP והפיכת תאי E. coli מוכשרים, מושבות המכילות את המבנה עם תוספת eGFP יפיקו תוצר של כ- 859 bp לאחר הפעלת PCR המושבה המתואר בסעיף 1.2 (איור 3A). עיכול כולל של הפלסמיד המטוהר ממושבות חיוביות באמצעות SwaI צריך לתת שני מקטעים אופייניים באלקטרופורזה של ג'ל, מקטע 2.9 kbp ...

Discussion

היתרונות והחסרונות של גנים שונים נחקרו במספר טפילים פרוטוזואים. ביניהם, GFP ו- eGFP הם פלואורסצנטיים במהותם ומאפשרים כימות והדמיה קלים. ניתן לזהות את הפעילות הפלואורסצנטית של חלבונים אלה עם מניפולציה מינימלית באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, פלואורימטריה או ציטומטריית זרימה. מחקרים מעטים בו?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 Well Microplates	Corning	CLS3340	Flat bottom clear, black polystyrene, sterile, lid
Agarose	Sigma-Aldrich	A4718
Ampicillin sodium salt	Sigma-Aldrich	A8351	BioXtra, suitable for cell culture
BglII restriction enzyme	New England BioLabs	R0144S	2,000 units. 10,000 units/mL
Cell Culture Flasks	Corning	CLS430168	Surface area 25 cm2, canted neck, cap (plug seal)
ChemiDoc Imaging System	Bio-Rad	17001401
CyFlow Space	Sysmex	Not available
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G7021	powder, BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, ≥99.5%
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	F7524
Gel Loading Buffer	Sigma-Aldrich	G2526	The rate of migration varies with gel composition. Dilute 1:3 to 1:6 with sample before loading.
Gene Pulser Xcell Electroporation System	Bio-Rad	1652660	The system is composed of a main unit, two accessory modules, the capacitance extender (CE module) and the pulse controller (PC module), and a ShockPod cuvette chamber.
Gene Pulser/MicroPulser Electroporation Cuvettes	Bio-Rad	1652086	Pkg of 50, 0.2 cm–gap sterile electroporation cuvette, for use with the Gene Pulser and MicroPulser Systems, for mammalian and other eukaryotic cells
Gentamicin solution	Sigma-Aldrich	G1397	50 mg/mL in deionized water, liquid, 0.1 μm filtered, BioReagent, suitable for cell culture
GoTaq Long PCR Master Mix	Promega	M4021
HEPES solution	Sigma-Aldrich	H0887	1 M, pH 7.0-7.6, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture
Inverted microscope	Olympus	IXplore Standard
KpnI-HF restriction enzyme	New England BioLabs	R3142S	4,000 units. 20,000 units/mL
LB Broth with agar	Sigma-Aldrich	L3147	Highly-referenced nutrient-rich microbial growth powder medium with Agar, suitable for regular E.coli culture.
LB Broth	Sigma-Aldrich	L2542	Liquid microbial growth medium
Mini-Sub Cell GT Horizontal Electrophoresis System	Bio-Rad	1640300	Mini horizontal electrophoresis system, includes 8- and 15-well combs, 7 cm x 10 cm UV-transparent tray
pEGFP-N1-1x	Addgene	172281	Expressing eGFP mRNA fused with 1 tandem repeat of a 50-base sequence
pLEXSYcon2.1 expression kit	Jena Bioscience	EGE-1310sat	Contains integrative constitutive expression vector pLEXSY-sat2.1. Antibiotic selection of transfectants with Nourseothricin (NTC, clonNAT). Contains all primers for diagnostic PCRs and sequencing.
Potassium Chloride	Millipore	529552	Molecular Biology Grade - CAS 7447-40-7 - Calbiochem
PureYield Plasmid Miniprep System	Promega	A1222	Up to 15 μg of Transfection-Ready Plasmid from 3 mL cultures.
Schneider′s Insect Medium	Sigma-Aldrich	S0146	Medium used in our laboratory for culturing Leishmania.
SOC Medium	Sigma-Aldrich	S1797
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S3014	for molecular biology, DNase, RNase, and protease, none detected, ≥99% (titration)
Sodium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	RDD038	BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, ≥99.0%, free-flowing, Redi-Dri
SwaI restriction enzyme	New England BioLabs	R0604S	2,000 units. 10,000 units/mL
Syringe filters	Corning	CLS431212	regenerated cellulose membrane, diam. 4 mm, pore size 0.2 μm
T100 Thermal Cycler	Bio-Rad	1861096	Thermal cycler system, includes 96-well thermal cycler, power cord, tube support ring
T4 DNA Ligase	Promega	M1801	Joins two DNA strands with cohesive or blunt ends
Tris-Borate-EDTA buffer	Sigma-Aldrich	T4415	BioReagent, suitable for electrophoresis, 10× concentrate
Wizard Genomic DNA Purification Kit	Promega	A1120
Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System	Promega	A9285
XL10-Gold Ultracompetent Cells	Agilent	200317	XL10-Gold Kanr Ultracompetent Cells, 10 x 0.1 mL. Features the kanamycin-resistance gene on the F' episome, for extremely demanding cloning in chloramphenicol-resistant vectors. Efficiency: > 5 x 10 9 transformants/µg pUC18 DNA.