דיסקציה של עכברים במערכת העצבים המרכזית וההיקפית

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להשלמת דיסקציה של מערכת העצבים המרכזית וההיקפית של עכברים. הרקמות המנותחות מנותחות עוד יותר ביישומים במורד הזרם, כגון צילום תמונות גסות או היסטולוגיה.

Abstract

מודלים של בעלי חיים מייצגים את סוס העבודה של תחום מדעי המוח. למרות זאת, כיום, עדיין אין פרוטוקול שלב אחר שלב לניתוח מערכת עצבים שלמה של מכרסמים, וגם אין סכימה שלמה המייצגת אותה הזמינה באופן חופשי. קיימות רק שיטות לקצירת המוח, חוט השדרה, גנגליון שורש גבי ספציפי והעצב הסיאטי (בנפרד). כאן, אנו מספקים תמונות מפורטות וסכימה של מערכת העצבים של העכברים המרכזית וההיקפית. חשוב מכך, אנו מתארים הליך חזק לביצוע הנתיחה שלו. השלב שלפני הדיסקציה של 30 דקות מאפשר לבודד את מערכת העצבים השלמה בתוך החוליה עם שרירים נקיים מקרביים ועור. דיסקציה של 2-4 שעות עוקבת אחריו תחת מיקרוסקופ מיקרו-דיסקציה כדי לחשוף את חוט השדרה ועצבי בית החזה, ולבסוף לקלף את כל מערכת העצבים המרכזית וההיקפית מהפגר. פרוטוקול זה מייצג צעד משמעותי קדימה בחקר האנטומיה והפתופיזיולוגיה של מערכת העצבים ברחבי העולם. לדוגמה, ניתן לעבד עוד יותר את גנגליוני השורש הגבי המנותחים ממודל עכברים מסוג נוירופיברומטוזיס מסוג I לצורך היסטולוגיה כדי לחשוף שינויים בהתקדמות הגידול.

Introduction

המטרה הכוללת של שיטה זו היא לבודד את מערכת העצבים המרכזית וההיקפית של העכבר בחתיכה אחת. כיום אין פרוטוקול לניתוח כל מערכת העצבים של מכרסם כדי לחקור אותו ברמה גלובלית. מדעני מוח משתמשים בדרך כלל בעצב הסיאטי כתחליף לכל עצב היקפי¹, ובגנגליונים L3 עד L5² כתחליף לכל גנגליון. באמצעות שיטות אלה, לא ניתן להסיק אם התוצאות ספציפיות לעצב/גנגליון המסוים. מכיוון שידוע שלפחות חלק מהפתולוגיות העצביות אינן משפיעות על כל העצבים והגנגליונים באותה מידה ^3,4,5, יש לפתח טכניקה שתאפשר בידוד של מערכת העצבים השלמה של המכרסמים כדי לחקור אותה ברחבי העולם.

במהלך השנים פיתחנו ושכללנו שיטה לניתוח מערכת העצבים המרכזית וההיקפית השלמה של עכברים. השלב הראשון הוא בעצם דיסקציה גסה של העכברים כהכנה לשלבי המיקרו-דיסקציה תחת מיקרוסקופ הדיסקציה. בשלבים 2 עד 4, חוט השדרה ועצבי בית החזה נחשפים, המוח מנותח וכל חוט השדרה והעצבים ההיקפיים מתקלפים מהפגר.

שיטה זו עוצמתית כאשר היא משולבת עם הדמיה או היסטולוגיה כדי לתעד כל שינוי מקרוסקופי או מיקרוסקופי 6,7,8,9. מדעני מוח המעוניינים לסקור שינויים גלובליים או לערוך ניסויים שאינם מונעי השערות צריכים להשתמש בשיטה זו כדי לסקור את מערכת העצבים העולמית.

Protocol

הפרוטוקולים ששימשו במחקר זה אושרו על ידי Comité Institutionnel des Animaux de l'Université de Sherbrooke, מוסד מוסמך של המועצה הקנדית לטיפול בבעלי חיים.

1. הכנה למיקרו-דיסקציה (טרום דיסקציה)

1. בצע הרדמה עם 5% איזופלורן, ולאחר מכן המתת חסד עם 2% איזופלורן ו-10 psi של CO₂ עד שאין סימנים חיוניים.
   הערה: אין לבצע פריקת צוואר הרחם, מכיוון שהדבר פוגע בחוט השדרה ובגנגליונים הצוואריים.
2. הנח את העכבר המומת עם הפנים כלפי מעלה (מבט קדמי) על משטח חיתוך, ורסס את הפרווה ב-70% אתנול.
3. לאחר מכן, הצמד את הגפיים העליונות והתחתונות, באמצעות ארבעה סיכות בקוטר קטן כדי להחזיק את העכבר במקומו במהלך הדיסקציה.
4. בעזרת מספריים כירורגיים חותכים את העור מהבטן התחתונה לגרון.
5. מקלפים את העור כדי לחשוף את האיברים הפנימיים, ומשתמשים בסיכות נוספות כדי לשמור על העור מכל צד תוך חשיפת חלל הבטן.
6. חתכו את כלוב בית החזה כדי לחשוף את הלב והריאות.
7. בעזרת זוג מלקחיים אנטומיים סטנדרטיים, אחזו בוושט ובקנה הנשימה, וחתכו ממש מעל המלקחיים.
8. לאחר מכן, התחל לקלף את כל האיברים הפנימיים בגישה גולגולתית לזנב. לשם כך, חתוך את הסרעפת לאורך עמוד השדרה כדי להסיר את כל האיברים הפנימיים בחתיכה אחת.
9. שחרר את העכבר ושטוף דם עכבר עודף מחלל הבטן בכיור.
10. הנח את העכבר עם הפנים כלפי מטה (אחורי view). הצמד את הגפיים העליונות והתחתונות, באמצעות ארבעה סיכות כדי להחזיק את העכבר במקומו במהלך הדיסקציה.
11. בעזרת מספריים כירורגיים מקלפים את העור מהראש לגפיים האחוריות.
12. חשוף את העצב הסיאטי השמאלי (הגפה התחתונה).
    1. חותכים את השרירים פתוחים בחלק התחתון של הגפה התחתונה השמאלית.
    2. אתר וחשוף את העצב הסיאטי על ידי הסרת השריר סביבו.
    3. חתכו בזהירות את העצב הסיאטי בהסתעפות העצב הסוראלי, הטיביאלי והפרונאלי, וחסכו את כלי הדם.
    4. המשיכו לבודד את העצב הסיאטי באמצעות מלקחיים אנטומיים סטנדרטיים ומספריים עדינים במיוחד של בון, עד שהוא הופך מקביל לעמוד השדרה ומשאיר עצב חופשי של כ -2 ס"מ.
    5. הכנס את המספריים הכירורגיים במקביל לחוט השדרה, וחתוך את הירך.
    6. נקע את הירך על ידי פירוק עצם העצה ועצם הירך בעזרת אצבעות.
       הערה: במהלך תהליך זה, נדרש לעצור לעתים קרובות כדי למשוך בעדינות את העצב הסיאטי באמצעות מלקחיים כדי למנוע הפרעה.
    7. בסוף, קרעו בעדינות את הגפה האחורית מפגר העכבר, והשאירו עצב סיאטי באורך של כ -4 ס"מ.
       הערה: במהלך תהליך זה, אתר את עצב L2 והקניט אותו מהגפה האחורית כדי למנוע נזק ל-L2. חזור על שלב 1.12 עבור צד ימין.
13. לחשוף את העצבים הברכיאליים (הגפיים העליונות).
    1. תפעל את פגר העכבר בידיים, ולא על משטח ישר (כרית דיסקציה).
    2. אתר את מקלעת הזרוע השמאלית על ידי התגרות בשומן ובשרירים בבית השחי השמאלי.
    3. לאחר האיתור, חותכים את ההסתעפויות העיקריות של מקלעת הזרוע (רדיאלית, בית השחי, סופראסקפולרית) ואת השלכות המשנה שלהן סביב האולנה בעזרת מספריים בון עדינים במיוחד, ומשאירים עצבים חופשיים של כ -1.5 ס"מ. מקלפים בעדינות את המקלעת מהגפה השמאלית העליונה.
    4. נקע את הגפה השמאלית העליונה; ודא שהוא נטול עצבים. חזור על שלב 1.13 עבור הצד הימני.
14. חשפו את המוח.
    1. כעת, מקם את העכבר עם הפנים כלפי מעלה (מבט קדמי)
    2. הכניסו להב אחד של המספריים העדינים במיוחד של בון לפה, וחתכו את הלסת התחתונה דרך הגרון.
    3. הסר את הלסת התחתונה על ידי חיתוך נוסף מהלחיים לגרון.
    4. לאחר מכן, חותכים את עצם הגולגולת העוברת מאוזן אחת לשנייה.
       הערה: היזהר להימנע מלהיכנס עמוק מדי ולפגוע במוח.
    5. חותכים ומסירים את החך ועצמות האף כדי לפתוח את הגולגולת.
    6. חותכים את חוליית C1 בבסיס הגולגולת, משחררים את המוח הקטן ואת תחילת חוט השדרה.
    7. לבסוף, חתכו את הגולגולת לרוחב עד העין, והסירו את חלקי הגולגולת כדי לחשוף את המוח.
       הערה: שמור את המוח בחלל שלו עד שהעצבים מתקלפים.
15. הסר כל שומן או שרירים מיותרים מהפגר. מניחים את הפגר בפורמלין 10% למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר (RT), ולאחר מכן שטיפות קצרות של 1x מי מלח עם פוספט (PBS) עד שאין יותר ריח מקבע, והמשיכו לשלב הבא.
    הערה: אם מערכת העצבים מנותחת בשבועיים הקרובים, אחסן אותה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס ב-PBS. אחרת, אחסן אותו בפורמלין 10% ללא הגבלת זמן. השתמש תמיד במכסה מנוע כימי בעת מניפולציה של פורמלין.

2. חשיפה לחוט השדרה

1. כדי לחשוף את חוט השדרה, השתמש בגישה גולגולת לזנב. כדי להסיר כל חוליה ושכבת השריר שלה מעל, חתכו בעמדות השעה עשר ושתיים בצד הגחון, בעזרת מספריים קפיציים של ואנאס. שבב את החוליה באמצעות מיני מלקחיים של דומונט. המשך בתהליך זה דרך חוליות צוואר הרחם ובית החזה.
2. עבור החלק המותני, חותכים את התהליך הרוחבי מכל צד של החוליה. לאחר מכן, חתכו במצבים של שתיים ועשר על ידי החדרת להב של זוג מספריים קפיציים של Vannas לתעלת החוליות. הסר את הרקמות, תוך שימת לב לעצבים שלעיתים דבוקים לעצמות.
3. המשך באופן דומה עבור החלק הזנבי.

3. חשיפה לעצב בית החזה

1. שים את הפגר מתחת למיקרוסקופ הדיסקציה כדי לדמיין את הצד הקדמי.
2. בעזרת מספריים קפיציים של Vannas, חותכים לאורך כל צלע (מעצם החזה ועד הגפיים התחתונות) כדי לחשוף את העצבים ההיקפיים.
3. לאחר מכן, חותכים את החוליה משני צידי הגנגליון (לרוחב) כדי לחשוף את הגנגליון.

4. עצב היקפי מתקלף

1. כדי לקלף את חוט השדרה ולעקור עוד יותר את העצבים ההיקפיים, השתמש במלקחיים המיני של דומונט כדי לגלגל בעדינות את חוט השדרה ולשלוף את העצבים בזה אחר זה, החל מהחלק הזנבי של חוט השדרה.
   הערה: לפני הקילוף, ניתן לבצע קיבוע נוסף בפורמלין 10% למשך 15 דקות ב-RT, ולאחר מכן שטיפות קצרות של 1x PBS עד שאין יותר ריח מקבע, כפי שבוצע בשלב 1.15.
2. עבור החלק החזי, משוך את העצב בזווית של 90 מעלות (בניצב לחוט השדרה).
3. עבור מקלעת הזרוע, חותכים את החוליה ליד העצב, כדי לפנות מקום לעצב.
   הערה: לא ניתן לעבור את מקלעת הזרוע מתחת לחוליה, כמו באזור בית החזה.
4. הסר את עודפי השרירים כדי לנקות את העצבים.
5. יש לאחסן ב-PBS בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך עד שבועיים בסך הכל, או ללא הגבלת זמן בפורמלין 10% ב-RT.

תוצאות

מכרסמים היו חיוניים להבנתנו את הביולוגיה והפתופיזיולוגיה של מערכת העצבים¹⁰. באופן מעניין, אף שיטה אינה מציגה את הדיסקציה המלאה של מערכת העצבים המרכזית וההיקפית של מכרסם כדי להעריך את האנטומיה והשונות הפתולוגית במודל בזמן אמת ^1,2,11

Discussion

כדי למנוע את התייבשות השרירים והעצבים, יש להשרות את הפגר ב- PBS כל 10 דקות. בעת פריקת הגפיים התחתונות (שלב 1.12.6), חשוב תמיד לראות את מקלעת העצב הסיאטית ו-L2 באופק כדי למנוע נזק/קריעה. כאשר מנתחים את המוח (שלב 1.14.4), זה קריטי להימנע מלהיכנס עמוק מדי כדי לא לפגוע במוח. כאשר מנתחים את ג...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dumont mini-forceps	Fine Science Tools	#11200-10
Extra Bonn scissors	Fine Science Tools	#14084-08
Formalin 10%	Fischer Scientific	#22-046-361
PBS 1x	BioShopCanada	#PBS404.500
Standard anatomical forceps	Fine Science Tools	#91100-12
Surgical scissors	Fine Science Tools	#140001-12
Vannas spring scissors	Kent Scientific	#INS600124