JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

מחקר זה פיתח שיטה לא פולשנית ובזמן אמת להערכת ההתפלגות של ליגנד מוות מתוכנת 1 בכל הגוף, בהתבסס על הדמיה טומוגרפית של פליטת פוזיטרונים של אנטגוניסט D-dodecapeptide [68Ga]. לטכניקה זו יתרונות על פני אימונוהיסטוכימיה קונבנציונלית והיא משפרת את יעילות זיהוי החולים המתאימים אשר יפיקו תועלת מטיפול בחסימת נקודות בקרה חיסוניות.

Abstract

הפיתוח של טיפול בחסימת נקודות בקרה חיסוניות המבוסס על חלבון מוות תאי מתוכנת 1 (PD-1)/ליגנד מוות מתוכנת 1 (PD-L1) חולל מהפכה בטיפולים בסרטן בשנים האחרונות. עם זאת, רק חלק קטן מהחולים מגיב למעכבי PD-1/PD-L1, בשל הביטוי ההטרוגני של PD-L1 בתאי הגידול. הטרוגניות זו מציבה אתגר בזיהוי מדויק של תאי גידול על ידי הגישה האימונוהיסטוכימית הנפוצה (IHC). מצב זה דורש שיטות טובות יותר לריבוד חולים שייהנו מטיפול בחסימת נקודות בקרה חיסוניות, כדי לשפר את יעילות הטיפול. טומוגרפיית פליטת פוזיטרונים (PET) מאפשרת הדמיה בזמן אמת של ביטוי PD-L1 בכל הגוף באופן לא פולשני. לכן, יש צורך בפיתוח נותבים רדיואקטיביים לאיתור התפלגות PD-L1 בגידולים באמצעות הדמיית PET.

בהשוואה לעמיתיהם L, לפפטידים דקסטרורוטאריים (D) יש תכונות כגון עמידות פרוטאוליטית וזמן מחצית חיים מטבולי ממושך להפליא. מחקר זה תכנן שיטה חדשה לזיהוי ביטוי PD-L1 המבוססת על הדמיית PET של 68פפטיד D-L1 ממוקד PD-L1, אנטגוניסט D-dodecapeptide (DPA), בעכברים נושאי גידול. התוצאות הראו כי [68Ga]DPA יכול להיקשר באופן ספציפי לגידולים בעלי ביטוי יתר של PD-L1 in vivo, והראו יציבות חיובית כמו גם יכולת הדמיה מצוינת, דבר המצביע על כך [68Ga]DPA-PET היא גישה מבטיחה להערכת מצב PD-L1 בגידולים.

Introduction

גילוי חלבוני נקודות הביקורת החיסונית היווה פריצת דרך בטיפול בגידולים, והוביל להתקדמות משמעותית בפיתוח טיפול בחסימת נקודות בקרה חיסוניות1. חלבון מוות תאי מתוכנת 1 (PD-1) וליגנד מוות מתוכנת 1 (PD-L1) הם מטרות פוטנציאליות לתרופות עם מספר נוגדנים שאושרו על ידי מנהל המזון והתרופות האמריקאי (FDA). PD-1 מבוטא על ידי תאי חיסון חודרי גידול, כגון CD4+, תאי T CD8+ ותאי T רגולטוריים. PD-L1 היא אחת מהליגנדות PD-1, אשר באה לידי ביטוי יתר במגוון תאי גידול 2,3. האינטראקציה בין PD-1 ו-PD-L1 משביתה את PD-1, ובכך מדכאת את התגובה החיסונית האנטי-סרטנית4. ממצאים אלה מציעים כי עיכוב PD-L1 יכול לשפר את אפקט ההרג של תאי מערכת החיסון ולחסל תאים סרטניים5. נכון לעכשיו, אימונוהיסטוכימיה כרומוגנית (IHC) היא הגישה הנפוצה ביותר לזיהוי חולים בעלי הסבירות הגבוהה ביותר להגיב לטיפול בנקודות בקרה חיסוניות 6,7. עם זאת, בשל הביטוי ההטרוגני של PD-L1 בתאי גידול, תוצאות IHC מביופסיות אינן יכולות לספק מידע מדויק על ביטוי PD-L1 בחולים8. מחקרים קודמים דיווחו כי רק 20%-40% מהמטופלים משיגים יתרונות ארוכי טווח מטיפול בחסימת נקודות בקרה חיסוניות 1,9,10. לכן, יש צורך דחוף לפתח שיטה חדשה כדי לעקוף את התוצאות השליליות הכוזבות הנגרמות על ידי ביטוי הטרוגני של חלבוני בקרה חיסונית אלה.

טכנולוגיית הדמיה מולקולרית, כגון טומוגרפיה של פליטת פוזיטרונים (PET), מאפשרת הדמיה בזמן אמת של כל הגוף באופן לא פולשני, ובכך יכולה לעלות בביצועיה על שיטת IHC הקונבנציונלית 11,12,13. נוגדנים, פפטידים ומולקולות קטנות בעלי תווית רדיואקטיבית הם נותבים מבטיחים לניטור ביטוי PD-L1 בחולי סרטן 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25. ה-FDA אישר שלושה נוגדנים חד-שבטיים טיפוליים PD-L1: avelumab, atezolizumab ו-durvalumab26. נותבי PET חיסוניים המבוססים על נוגדנים אלה תועדו היטב 27,28,29,30,31,32. ניסויים קליניים בשלב מוקדם גילו ערך מוגבל ליישום קליני, בגלל הפרמקוקינטיקה30 השלילית. בהשוואה לנוגדנים, פפטידים מפגינים פינוי מהיר יותר של דם ואיברים מאיברים בריאים, וניתן לשנות אותם כימית בקלות33. מספר פפטידים בעלי זיקה גבוהה ל-PD-1/PD-L1 דווחו2; WL12 הוא פפטיד מדווח המראה קשירה ספציפית ל-PD-L134. דווח כי עוקבים עם תווית רדיו, [64Cu]WL12, [68Ga]WL12 ו-[18F]FPyWL12, הראו יכולת מיקוד גידול ספציפית גבוהה in vivo, המאפשרת קציר של תמונות באיכות גבוהה של ביטוי PD-L1 בגידולים 26,35,36,37. יתר על כן, ההערכה הראשונה בבני אדם של WL12 עם תווית רדיו הראתה כי [68Ga]WL12 (כלאט על ידי NOTA) יש פוטנציאל בטוח ויעיל להדמיית גידול קליני38. בשל הידרופוביות גבוהה וספיגה גבוהה בכבד בריא, WL12 יש שימוש קליני מוגבל. פפטידים אחרים של תיוג רדיו, כגון TPP1 ו-SETSKSF, שנקשרים באופן ספציפי ל-PD-L1, הראו גם הם יציבות וספציפיות פוטנציאליות כדי להמחיש ביטוי PD-L1 של כל הגוף39,40. עם זאת, פפטידים שלא שונו מתפרקים בקלות על ידי פרוטאזות, והם מטבוליזם במהירות על ידי הכליה. Dextrorotary(D)-peptides נמצאים בשימוש נרחב כמתווכים יעילים, בשל יציבות ירודה של פפטידים שמאליים (L) 41,42,43. D-פפטידים עמידים במיוחד בפני פירוק פרוטאוליטי ויש להם זמן מחצית חיים מטבולי ממושך להפליא. בהשוואה לעמיתיהם L, D-peptides מראים בעיקר יכולות קישור ספציפיות 44,45,46.

מחקר זה תכנן שיטה חדשה לזיהוי ביטוי PD-L1, המבוססת על הדמיית PET של 68Ga-labeled PD-L1-targeted D-peptide, D-dodecapeptide antagonist (DPA), בעכבר נושא גידול מודל47. היציבות של [68Ga]DPA נחקרה לראשונה במי מלח חוצצי פוספט (PBS) ובסרום עכברים, ולאחר מכן נבדקה זיקה קושרת של [68Ga]DPA בגידולים בעלי ביטוי יתר PD-L1. לאחר מכן, הדמיית PET בוצעה במודלים של גליובלסטומה קסנוגרפט כדי לאשר אם [68Ga]DPA היה עוקב PET אידיאלי לניטור ביטוי PD-L1 בגידולים. השילוב של דימות PET ו- DPA לא רק מספק גישה חדשה להתגבר על אתגרים הקשורים לביטוי ההטרוגני של PD-L1, אלא גם מניח את הבסיס לפיתוח רדיוטרייסרים מבוססי D-פפטידים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

הליכי הניסוי בבעלי חיים אושרו על ידי ועדת האתיקה של בעלי חיים באוניברסיטה הרפואית נאנג'ינג או המכונים הלאומיים למדע וטכנולוגיה קוונטיים. ניסויי העכברים בוצעו בקפדנות בהתאם להנחיות המוסדיות של הוועדה לטיפול ושימוש בחיות מעבדה.

1. סינתזת פפטיד

  1. להתנפח 100 מ"ג של שרף 4-methylbenzhydrylamine (MBHA) (כושר טעינה של 0.37 mmol / g) ב 1 מ"ל של N-methyl-2-pyrrolidone (NMP) במשך 30 דקות תחת N2 מבעבע קל.
  2. הכינו מאגר מלאי טרי המורכב מחומצות אמינו מוגנות Fmoc (5.0 שווה ערך), HCTU (4.9 שווה ערך) ו-DIPEA (שווה ערך ל-10.0) ב-1 מ"ל של תמ"ג, והוסיפו לשרף (100 מ"ג). אפשר לתגובת הצימוד להמשיך במשך 1.5-2 שעות.
  3. הכינו חיץ הגנה המורכב מ-50% (vol/vol) מורפולין בתמ"א. שטפו את השרף (100 מ"ג) 2 x 30 דקות עם 1 מ"ל של חיץ ההגנה בכל שטיפה כדי להסיר את קבוצת ה-Fmoc מקבוצת האמין. שטפו את השרף עם דיכלורומתאן (DCM; 1 מ"ל) למשך דקה אחת, הסירו את ה-DCM ושטפו מחדש את השרף עם NMP (1 מ"ל) למשך דקה נוספת. לאחר מכן, להסיר את התמ"א ולשטוף מחדש את השרף עם DCM במשך 1 דקה.
    הערה: כל הליכי הכביסה מתבצעים תחת בעבוע N2 קל. ההליכים הנ"ל חוזרים על עצמם עד חומצת האמינו האחרונה.
  4. להוספת 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid (DOTA) לפפטיד, יש להפעיל מראש את DOTA עם N-(3-dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC· HCl) ו-N-hydroxysuccinimide (NHS). לדגור על מאגר המניות של DOTA/EDC· HCl/NHS ביחס מולארי של 1:1:1 בדימתיל סולפוקסיד (DMSO) למשך 3 שעות, עם ריכוז DOTA סופי של 1 M. לאחר מכן, הוסף את מאגר המניות (1 מ"ל) לשרף (100 מ"ג), ואפשר לתגובה להמשיך במשך שעתיים עם N2 עדין מבעבע.
    הערה: 1,4,7-triazacyclononane-1,4,7-triacetic acid (NOTA) יכול לשמש גם ככלטור עבור קומפלקס 68Ga. ניתן להשתמש באותם נהלים עבור צימוד NOTA.
  5. שטפו היטב את השרף מלמעלה באמצעות DCM והפעילו ואקום כדי להסיר את שאריות התגובה בו זמנית. שטפו את השרף 3x באמצעות DCM (1.5 מ"ל), ולאחר מכן שטפו עם MeOH (1.5 מ"ל) כדי לכווץ את השרף. שים את השרף תחת חנקן במשך הלילה, או תחת ואקום גבוה לפחות 4 שעות, עד שהשרף הופך יבש.
  6. מניחים את השרף המיובש המכיל פפטיד DPA במיכל פוליפרופילן בנפח 2 מ"ל עם מכסה בורג. הוסיפו את קוקטייל המחשוף המתאים (95/2.5/2.5 TFA/TIS/H2O בנפח; 1 מ"ל/100 מ"ג שרף) ואטמו היטב את המיכל באמצעות מכסה בורג. בעדינות לעורר את התגובה על שייקר מסלול במכסה אדים ב 20-25 ° C במשך 2 שעות.
    אזהרה: הכינו חומצה טריפלואורואצטית (TFA) במכסה אדים עם ביגוד מגן, בשל טבעה הקורוזיבי מאוד.
  7. הסר את רוב TFA על ידי אידוי תחת חנקן במכסה האדים. לזרז את הפפטידים על ידי הוספת אתר דיאתיל (~ 1.5 מ"ל / 100 מ"ג שרף).
  8. מערבבים את התערובת כדי לערבב את הפפטידים והצנטריפוגות בטמפרטורת החדר (10,000 × גרם, 5 דקות). בזהירות לשפוך את הממס מתוך המיכל. חזור על שלבים 1.7-1.8.
  9. יבשו באוויר את השאריות במיכל הפתוח למשך 10 דקות. הוסף 50% (vol/vol) אצטוניטריל מימי, ומערבול עבור 1-2 s כדי להמיס את המוצרים (1 מ"ל / 100 מ"ג שרף).
  10. הסר את השרף על ידי סינון התערובת, ולאחר מכן לשטוף את השרף 2x באמצעות 0.2 מ"ל של 50% (vol/vol) אצטוניטריל מימי. ערבבו את התסנין לטיהור כרומטוגרפיה נוזלית (HPLC) בעלת ביצועים גבוהים. השתמש בתנאי HPLC הבאים. עמודה: YMC-Triat-C18 (קוטר פנימי 4.6 מ"מ, 150 מ"מ, 5 מ"מ); שיפוע ממס: ממס מים A-deionized; ממס B-acetonitrile (0.1% TFA); זמן זרימה: 20 דקות, עם אצטוניטריל מ 10% ל 90%; קצב זרימה: 1 מ"ל/דקה.
  11. יש להקפיא את אלונטי HPLC שנאספו למשך הלילה בטמפרטורה של -80°C ולבצע ליופיליזציה (-50°C ו-<1 pa). עבור תיוג רדיו, להמיס את הפפטיד המוצק במאגר נתרן אצטט (100 mM, pH 5.0) בריכוז סופי של 1 mg/mL כחיץ מלאי.

2. תיוג רדיו 68Ga

הערה 68Ga נוצרה בבית החולים הראשון נאנג'ינג (נאנג'ינג, סין) באמצעות גנרטור 68Ge/68Ga.

  1. פיפטה 5 μL של מאגר מלאי לתוך מיכל פוליפרופילן 1.5 מ"ל עם מכסה בורג. הוסף 200 MBq [68Ga]GaCl3 (400 μL) למכל.
  2. מערבבים את התערובת במשך 5 שניות. מדוד את ה- pH באמצעות רצועות בדיקת pH. כוונן את ה- pH ל- 4-4.5 עם NaOH (0.1 M).
    הערה: pH מתאים הוא קריטי עבור מורכבות בין 68Ga ו- DOTA.
  3. לדגור על התמיסה בטמפרטורת החדר במשך 5-10 דקות. נושא את תערובת התגובה לרדיו-HPLC לצורך ניתוח תפוקת תיוג רדיו בתנאים הבאים: עמודה: YMC-Triat-C18 (4.6 מ"מ תעודת זהות, 150 מ"מ, 5 מ"מ); שיפוע ממס: ממס מים A-deionized; ממס B-acetonitrile (0.1% TFA); זמן זרימה: 20 דקות, עם אצטוניטריל מ 10% ל 90%; קצב זרימה: 1 מ"ל/דקה.
    הערה: כרומטוגרפיית רדיו בשכבה דקה (TLC) יכולה לשמש כגישה חלופית לבחינת תפוקת תיוג רדיו. חיץ האלוציה המוצע של TLC הוא 0.1 M Na3C6H5O7, pH 4.

3. בדיקת יציבות Tracer

  1. בדיקת יציבות Tracer ב- PBS
    1. הוסף [68Ga]DPA (10 μL, 3.7 MBq, ב- NaOAc) ל- PBS (990 μL). יש לדגור בטמפרטורה של 37°C למשך 1, 2 ו-4 שעות עם תסיסה קלה.
    2. אסוף 200 μL של התמיסה בכל נקודת זמן. הזריקו אותו לרדיו-HPLC לצורך ניתוח.
  2. יציבות Tracer בסרום עכבר
    1. הוסף [68Ga]DPA (10 μL, ~ 3.7 MBq, ב-NaOAc) לסרום העכבר (90 μL, מוכן טרי). יש לדגור בטמפרטורה של 37°C למשך 1, 2 ו-4 שעות עם תסיסה קלה.
    2. לאסוף 20 μL של הפתרון בכל נקודת זמן. מוסיפים MeCN ומים (100 μL, 1:1, v/v).
    3. צנטריפוגה את התערובת במשך 10 דקות (5,000 × גרם, 25 ° C). נתח את supernatant באמצעות רדיו-HPLC.

4. ניתוח ביטוי PD-L1 על ידי ציטומטריית זרימה

  1. הכינו מדיום תרבית על ידי תוספת RPMI-1640 בינוני עם 10% (vol/vol) נסיוב בקר עוברי ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין (vol/vol). השהה מחדש את תאי U87MG בתווך תרבית, וזרע בצלחות 12 בארות בצפיפות של 105 תאים / באר. מניחים את התאים באינקובטור (5% CO2, 37 מעלות צלזיוס), ותרבית לפחות 24 שעות מבלי להפריע.
  2. לשטוף את התאים עם 0.5 מ"ל של PBS ולהוסיף 250 μL של טריפסין-EDTA (0.25%). מחזירים את התאים לאינקובטור (5% CO2, 37°C) למשך 2 דקות.
  3. הוסף 1 מ"ל של מדיום תרבית כדי לעצור את הדיסוציאציה של התא. הוסיפו מדיום לתאים כדי לנתק אותם מהכלים על ידי פיפטינג למעלה ולמטה ואספו אותם בצינורות של 1.5 מ"ל. צנטריפוגה את התאים במשך 5 דקות (100 × גרם).
  4. הסר את supernatant ו resuspend את התאים ב 1 מ"ל של PBS. צנטריפוגה את התאים במשך 5 דקות (100 × גרם). חזור על שלב זה פעם נוספת.
  5. לדלל את נוגדן PD-L1 מצומד פלואורסצאין איזותיוציאנט (FITC) עם 3% אלבומין בסרום בקר (BSA) ל-20nmol/L. הוסף לתאים ודגור ב-4°C למשך שעה אחת.
  6. צנטריפוגה את התאים במשך 5 דקות (100 × גרם), ולאחר מכן שטיפה עם PBS קר פעמיים. נתח את התאים החיוביים PD-L1 באמצעות ציטומטר זרימה ותוכנת ניתוח.

5. אימונוציטוכימיה

  1. זרעו את תאי U87MG בצלחות תרבית תחתית זכוכית (35 מ"מ) בצפיפות של 2.5 × 105 תאים לכל באר. כאשר מגיעים למפגש של 60%, שואפים למדיום התרבות ומוסיפים 1 מ"ל של PBS. נערו בעדינות מספר פעמים ושאפו. בצעו את שלב הכביסה 3x.
  2. מוסיפים 500 μL של 4% paraformaldehyde למנות. מניחים את התאים בטמפרטורת החדר ומקבעים למשך 30 דקות.
  3. שטפו את התאים 3x עם PBS. הוסף 1 מ"ל של 3% BSA (wt/vol, ב-PBS) וחסום את התאים הקבועים למשך שעתיים בטמפרטורת החדר.
  4. הסר את 3% BSA ודגור ישירות על התאים עם נוגדן אנטי PD-L1 ראשוני (mAb,1:100, מדולל ב -3% BSA) למשך הלילה ב 4 ° C.
    הערה: לאחר חסימת התאים עם BSA, אין לשטוף עם PBS.
  5. שטפו את התאים פי 3 עם מאגר BSA של 3%. לדגור על התאים עם נוגדן משני IgG Fc אנטי-אנושי מצומד FITC (1:500, מדולל ב-PBS) למשך שעה אחת.
  6. שטפו את התאים 3x עם PBS. הוסף 0.5 מ"ל DAPI (1 מיקרוגרם/מ"ל) לתאים ודגור בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת. שטפו את התאים המוכתמים 3x עם PBS, והתבוננו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי קונפוקלי.

6. ניסוי קליטה ועיכוב של תאים

  1. ניסוי קליטה תאית
    1. תרבית את תאי U87MG בצלחות של 12 בארות עד שמגיעים למפגש של 80%. הסר את המדיום ולשטוף את התאים עם 0.5 מ"ל של PBS.
    2. יש לדלל את התר"מ [68Ga] בתווך טרי לריכוז של 74 KBq/mL. הוסף 0.5 מ"ל של חיץ DPA מדולל [68Ga] לכל באר.
    3. דגור על התאים עם [68Ga]DPA ב-37°C לפרקי זמן שונים (10, 30, 40 ו-120 דקות). שאפו את המדיום באמצעות פיפטה. לשטוף את התאים עם PBS (0.5 מ"ל) שלוש פעמים.
    4. הוסף תמיסת NaOH (0.5 M, 300 μL לכל באר) כדי ליזה את התאים. לאחר 30 שניות, לאסוף את התא צמיג lysates בצינורות 1.5 מ"ל.
    5. לשטוף את הצלחת עם 0.4 מ"ל של PBS פעמיים. אסוף את תמיסת הכביסה בצינור 1.5 מ"ל לעיל.
    6. הפעל את המחשב המובנה של מונה הגמא האוטומטי; הכניסו את הצינורות למדף המובנה. לאחר טעינת כל הדגימות על המסוע, לחץ על כפתור START. התוצאות מחושבות בתוכנה הפנימית. הקריאה מתעדת את הספירה לדקה (CPM) המתואמת לדעיכה של כל צינור.
  2. מבחן מחייב תחרותי
    1. תרבית את תאי U87MG בצלחות של 12 בארות עד שמגיעים למפגש של 80%. הסר את המדיום ולשטוף את התאים עם 0.5 מ"ל של PBS.
    2. לדלל [68Ga]DPA במדיום טרי לריכוז של 74 KBq/mL. יש להמיס כמות מתאימה של תרכובות BMS202 ב-10% DMSO כדי להפיק ריכוז של 10 מילימטר (400 מיקרוליטר).
    3. לדלל 4 μL של 10 mM BMS202 ב 396 μL של PBS כדי לקבל ריכוז של 100 μM. חזור על שלב זה כדי להניב ריכוזים שונים של BMS202 (1 μM, 10 nM, 100 pM, ו 1 pM).
    4. הוסף 0.5 מ"ל של חיץ DPA מדולל [68Ga] לכל באר (0.37 MBq לכל באר). הוסף 5 μL של תמיסות BMS202 לכל באר (שלוש בארות לכל ריכוז). לדגור את התאים באינקובטור תאים ב 37 ° C במשך 120 דקות.
    5. שאפו את המדיום באמצעות פיפטה. לשטוף את התאים עם 3 x 0.5 מ"ל של PBS.
    6. הוסף את תמיסת NaOH (0.5 M, 300 μL לכל באר) כדי lyse את התאים. לאחר 30 שניות, לאסוף את התא צמיג lysates לתוך צינורות 1.5 מ"ל. לשטוף את הצלחת עם 2 x 0.4 מ"ל של PBS.
    7. אסוף את תמיסת הכביסה בצינור 1.5 מ"ל לעיל. הכנס את הצינורות למדף המובנה של מונה הגמא האוטומטי.
    8. בצע את אותם הליכים כמו שלב 6.1.6.

7. הדמיית PET

הערה: בצע הדמיית PET של בעלי חיים קטנים, באמצעות סורק micro PET המספק 159 חתכים ציריים רוחביים במרווחים של 0.796 מ"מ זה מזה (ממרכז למרכז), עם שדה ראייה אופקי של 10 ס"מ ושדה ראייה צירי של 12.7 ס"מ. כל הנתונים שנאספו במצב הרשימה מאורגנים בסינוגרמות תלת מימדיות. לאחר מכן פורייה מורכב מחדש לסינוגרמות דו-ממדיות (מסגרת × דקות: 4 × 1, 8 × 2, 8 × 5).

  1. השתמשו בעכברי BALB/C עירומים זכרים בני 5-8 שבועות במחקר זה. אספו את תאי U87MG בעקבות שלבים 4.1-4.4 ושאפו את התאים לתוך מזרק 0.5 מ"ל. תת עורית להזריק את התאים לתוך העכברים (1 × 106 תאים לכל גידול, שני גידולים לכל עכבר). מעקב אחר צמיחת הגידול לאחר ההזרקה עד שנפח הגידול הוא 100-300 מ"מ3.
  2. מרדימים את העכברים באמצעות איזופלורן 1%-2% (v/v) (1 מ"ל/דקה). הפעל את מכשיר החימום ושמור על מיטת החיות של PET ב 37 ° C.
  3. הניחו את העכברים המורדמים במיקום הנכון על מיטת בעלי החיים של מכונת ה-PET. יש למרוח משחה אופתלמית על שתי העיניים למניעת יובש.
    אזהרה: יש לשמור את העכברים במצב נוטה כדי למנוע מוות במהלך הסריקה. במהלך כל תהליך ההדמיה, יש להזרים איזופלורן (1.0 מ"ל/דקה) דרך האף באמצעות צינור מותקן מראש.
  4. כוונן את מיקום מיטת החיות באמצעות לוח הבקרה. יש להזריק את הנותבים (10-17 MBq/100-200 μL) לווריד דרך צנתר וריד זנב מותקן מראש.
  5. יצירת זרימת עבודה של סריקה במחשב מארח באמצעות התוכנה שאליה מתבצעת הפניה (ראה רשימת חומרים) צור תיקיית לימוד והגדר את פרוטוקול הרכישה בהתאם לפרוטוקול היצרן. בצע סריקות דינמיות (60 דקות עבור כל עכבר) על כל העכברים במצב רשימה תלת-ממדית.
  6. הגדר פרוטוקול היסטוגרמה ופרוטוקול שחזור בהתאם לפרוטוקול היצרן. השתמשו בפילטר של Hanning עם חיתוך Nyquist של 0.5 מחזור/פיקסל כדי לשחזר תמונות דינמיות של PET (25-30 דקות ו-55-60 דקות) באמצעות הקרנה אחורית מסוננת. צרו תמונות הקרנה בעוצמה מרבית (MIP) לכל העכברים.
  7. שלב את הפרוטוקולים בזרימת עבודה והפעל את זרימת העבודה. נתח את התמונות התלת מימדיות המתקבלות באמצעות התוכנה, בהתאם לפרוטוקול היצרן.
    הערה: השתמש בתוכנת הסימולציה כדי לבחור את אמצעי האחסון של תחומי עניין. הרדיואקטיביות מתוקנת לזמן ההזרקה ומוצגת כאחוז מסך מינון ההזרקה/לגרם רקמה (% ID/g).

8. הפצה ביולוגית Ex vivo

  1. יש לתת [68Ga]DPA (1.85 MBq/100 μL) לעכברים העירומים נושאי U87MG BALB/C באמצעות הזרקת ורידי זנב. הרדימו את העכברים באמצעות איזופלורן של 1%-2% (v/v) (1 מ"ל/דקה), ולאחר מכן הקריבו שלושה עכברים באמצעות נקע צוואר הרחם לאחר ההזרקה למשך 5, 30, 60 ו-120 דקות.
    הערה: יש להכשיר את האנשים המדגימים הליך זה במיומנויות הטכניות של פריקת צוואר הרחם כדי להבטיח את אובדן ההכרה המושרה במהירות. זה יבטיח כי הליכי המתת החסד בניסוי זה מבוצעים כולם באופן הומני.
  2. לאחר המוות הוא אישר, לפתוח את קיר החזה של העכברים. לאחר מכן, פתחו את הלב. השתמש מזרק 1 מ"ל כדי לצייר דם; לסחוט את הדם מן המזרק לתוך צינור radioimmunoassay (RIA) (13 מ"מ קוטר) עבור מונה גמא.
  3. הבלו על האיברים העיקריים והגידולים ומניחים אותם בצינורות RIA (בקוטר 13 מ"מ) עבור מונה הגמא. האיברים העיקריים כוללים את סך הדם, הלב, בלוטת התימוס, הכבד, הטחול, העצם, הקיבה, הכליות, השרירים, בלוטת הלימפה של המעי, המעי הדק, הלבלב, האשכים, המוח והריאות. לשקול את כל האיברים.
  4. למדוד את הרדיואקטיביות בתוך האיברים שנאספו באמצעות מונה אוטוגמה ולתקן את הערכים. חשב את אחוז המינון המוזרק לגרם של רקמה רטובה (% ID/g).

9. אימונוהיסטוכימיה

  1. לאסוף את רקמות glioma ולשטוף אותם 3x עם PBS. שים את הרקמות הטריות 4% paraformaldehyde ולתקן לילה ב 4 ° C.
  2. הטמיעו את הרקמות הקבועות בפרפין וחתכו אותן לעובי של 10 מיקרומטר. מניחים את המקטעים באינקובטור (60 מעלות צלזיוס) ודגרים במשך שעתיים. יש ללחלח את החלקים על ידי דגירה במשך 10 דקות כל אחד בחלקים הבאים: קסילן (פעמיים), אלכוהול מוחלט, 95% אלכוהול, 90% אלכוהול, 80% אלכוהול, 75% אלכוהול.
  3. שים את החלקים 0.01 מ 'ציטראט נתרן ומחממים אותם ל 92-95 מעלות צלזיוס. שמור על הטמפרטורה במשך 40 דקות כדי להשיג אחזור אנטיגן.
  4. הוסף 200 μL של תמיסת H2O2 (3%) למקטעים והשבת את האנדופרוקסידאזות למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. חסום את האתרים הלא ספציפיים על ידי טיפול עם 3% BSA למשך שעתיים בטמפרטורת החדר.
  5. יש לדגור על החלקים בנוגדן הראשוני נגד PD-L1 (mAb, 1:100, מדולל ב-3% BSA) למשך הלילה ב-4°C.
    הערה: לאחר חסימה עם BSA, אין לשטוף עם PBS.
  6. שטפו את המקטעים 3x עם PBS. יש לדגור על המקטעים עם נוגדן משני נגד ארנב עז (1:500, מדולל ב-PBS) בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת.
  7. שטפו את התאים 3x עם PBS. הוסף 200 μL של 3,3-diaminobenzidine (DAB) פתרון עבודה (פתרון A: פתרון B: פתרון C = 1:1:18) לחלקים ודגור במשך 5 דקות בחושך.
  8. שטפו את המקטעים 3x עם PBS. מוסיפים 500 μL של תמיסת המטוקסילין (100%), ודגרים במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. לשטוף את החלקים עם מים במשך 30 שניות. הכניסו את החלקים לתמיסת בידול (75% אלכוהול:HCL = 99:1) למשך 30 שניות. שטפו את החלקים במים במשך דקה.
  9. יש לייבש את הדגימות על ידי דגירה רציפה עם 75% אלכוהול, 80% אלכוהול, 90% אלכוהול, 95% אלכוהול, אלכוהול מוחלט וקסילן (פעמיים) (10 דקות כל אחת). הרכיבו את כל החלקים באמצעות שרף נייטרלי והתבוננו בהם תחת מיקרוסקופ אופטי.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

[68Ga]תיוג רדיו DPA ויציבות
פפטיד המודל, DPA, הוא אנטגוניסט PD-L1 יעיל. DOTA-DPA הושג בטוהר של >95% ותשואה של 68%. המסה של DOTA-DPA נצפית בניסוי ב-1,073.3 ([M+2H]2+). 68גליום נחשב רדיונוקליד מתאים לסימון פפטידים להדמיית PET, ולכן נבחר למחקר זה. לתווית רדיו DPA עם 68Ga (זמן מ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

השלבים הקריטיים המתוארים בשיטה זו כוללים תיוג יעיל של 68Ga ל- DPA ובחירת חלון זמן מתאים להדמיית PET, אשר חייב להתאים באופן מושלם לדפוס הפרמקודינמי של DPA בגידול.

בניגוד ל-IHC, הדמיית PET מאפשרת זיהוי בזמן אמת של ביטוי PD-L1 בכל הגוף באופן לא פולשני, ומאפשרת הדמיה של כל אזור חיובי בג?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

לא מוצהרים אינטרסים מתחרים.

Acknowledgements

מחקר זה נתמך על ידי קרן מכון המחקר המרכזי ללא כוונת רווח של האקדמיה הסינית למדעי הרפואה (מס' 2022-RC350-04) וקרן החדשנות CAMS למדעי הרפואה (מס' 2021-I2M-1-026, 2022-I2M-1-026-1, 02120101, 02130101 ו-2022-I2M-2-002).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid (DOTA)Merck60239-18-168Ga  chelation
3,3-diaminobenzidine (DAB) KitSigma-AldrichD7304-1SETImmunohistochemistry
anti-PD-L1 monoclonal antibodyWuhan Proteintech17952-1-apImmunohistochemistry: primary antibody
BMS202Selleck1675203-84-5Competitive binding assay: inhibitor
BSAMerckV900933Immunofluorescent : blocking 
DAPIMerckD9542Immunofluorescent: staining of nucleus
Dichloromethane (DCM)Merck34856Solvent
DIPEAMerck3439Peptide coupling
EDC·HClMerckE6383Activation of DOTA
FBSGibco10099Cell culture: supplement
FITC-conjugated anti-human IgG Fc AntibodyBiolegend409310Immunofluorescent: secondary antibody
FITC-conjugated anti PD-L1 antibodyBiolegend393606Flow cytometry: direct antibody
HCTUEnergy ChemicalE070004-25gPeptide coupling
HRP labeled goat anti-rabbit antibodyServicebioGB23303Immunohistochemistry: secondary antibody
Hydroxysuccinimide (NHS)Merck130672Activation of DOTA
MeCNMerckPHR1551Solvent
MorpholineMerck8.06127Fmoc- deprotection
NMPMerck8.06072Solevent
ParaformaldehydeMerck30525-89-4Fixation of tissues
PBSGibco10010023Cell culture: buffer
Penicillin-streptomycin Gibco10378016Cell culture: supplement
RIA tubePolyLabP10301AAs tissue sample container
RPMI-1640 mediumGibco11875093Cell culture: basic medium
Sodium acetateMerck1.06264Salt for buffer
Trypsin-EDTAGibco25200056Cell culture: dissociation agent
U87MG cell lineProcell Life Science & Technology CoCL-0238Cell model
Equipment
68Ge/68Ga generatorIsotope Technologies Munich, ITMNot applicableGeneration of [68Ga]
Autogamma counterPerkin Elmer Wizard2Detection of radioactivity
Confocal fluorescent microscopyKeyenceObservation of immunofluorescent results
Flow cytometerBecton Dickinson, BDLSRIIMonitoring the PD-L1 positive cells
High-performance liquid chromatography (HPLC)SHIMAZULC-20AT Purification of DPA peptide
PET scannerSiemens Medical SolutionsInveon MultiModality SystemPET imaging
Optical microscopyNikon Eclipse E100Observation of immunohistochemistry results
Solid phase peptide synthesizerPromega Vac-Man Laboratory Vacuum ManifoldLOT#11101Synthesis of DPA-DOTA peptide
Software
ASIProSiemens Medical SolutionsNot applicableAnalysis of PET-CT results
FlowJoBecton Dickinson, BDFlowJo 7.6.1Analysis of the flow cytometer results
Inveon Acquisition Workplace (IAW)Siemens Medical SolutionsNot applicableManagement of PET mechine
PrismGraphpadPrism 8.0Analysis of the data 

References

  1. Doroshow, D. B., et al. PD-L1 as a biomarker of response to immune-checkpoint inhibitors. Natire Reviews Clinical Oncology. 18 (6), 345-362 (2021).
  2. Krutzek, F., Kopka, K., Stadlbauer, S. Development of radiotracers for imaging of the PD-1/PD-L1 axis. Pharmaceuticals. 15 (6), 747(2022).
  3. Topalian, S. L., Drake, C. G., Pardoll, D. M. Immune checkpoint blockade: a common denominator approach to cancer therapy. Cancer Cell. 27 (4), 450-461 (2015).
  4. Pardoll, D. M. The blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy. Nature Reviews Cancer. 12 (4), 252-264 (2012).
  5. Xiao, Z., et al. PEIGel: A biocompatible and injectable scaffold with innate immune adjuvanticity for synergized local immunotherapy. Materials Today Bio. 15, 100297(2022).
  6. Teng, M. W. L., Ngiow, S. F., Ribas, A., Smyth, M. J. Classifying cancers based on T-cell infiltration and PD-L1. Cancer Research. 75 (11), 2139-2145 (2015).
  7. Dolled-Filhart, M., et al. Development of a companion diagnostic for pembrolizumab in non-small cell lung cancer using immunohistochemistry for programmed death ligand-1. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 140 (11), 1243-1249 (2016).
  8. Meng, X. J., Huang, Z. Q., Teng, F. F., Xing, L. G., Yu, J. M. Predictive biomarkers in PD-1/PD-L1 checkpoint blockade immunotherapy. Cancer Treatment Reviews. 41 (10), 868-876 (2015).
  9. Hakozaki, T., Hosomi, Y., Kitadai, R., Kitagawa, S., Okuma, Y. Efficacy of immune checkpoint inhibitor monotherapy for patients with massive non-small-cell lung cancer. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 146 (11), 2957-2966 (2020).
  10. Haslam, A., Prasad, V. Estimation of the percentage of US patients with cancer who are eligible for and respond to checkpoint inhibitor immunotherapy drugs. Jama Network Open. 2 (5), 192535(2019).
  11. Willmann, J. K., van Bruggen, N., Dinkelborg, L. M., Gambhir, S. S. Molecular imaging in drug development. Nature Reviews Drug Discovery. 7 (7), 591-607 (2008).
  12. Zhang, L., et al. Recent developments on PET radiotracers for TSPO and their applications in neuroimaging. Acta Pharmaceutica Sinica B. 11 (2), 373-393 (2021).
  13. Sun, J., et al. Imaging-guided targeted radionuclide tumor therapy: From concept to clinical translation. Advanced Drug Delivery Reviews. 190, 114538(2022).
  14. Xu, M., et al. Preclinical study of a fully human Anti-PD-L1 antibody as a theranostic agent for cancer immunotherapy. Molecular Pharmaceutics. 15 (10), 4426-4433 (2018).
  15. Niemeijer, A. N., et al. Whole body PD-1 and PD-L1 positron emission tomography in patients with non-small-cell lung cancer. Nature Communications. 9 (1), 4664(2018).
  16. Mayer, A. T., et al. Practical immuno-PET radiotracer design considerations for human immune checkpoint imaging. Journal of Nuclear Medicine. 58 (4), 538-546 (2017).
  17. Lv, G., et al. PET Imaging of tumor PD-L1 expression with a highly specific nonblocking single-domain antibody. Journal of Nuclear Medicine. 61 (1), 117-122 (2020).
  18. Li, D., et al. Immuno-PET imaging of 89Zr labeled anti-PD-L1 domain antibody. Molecular Pharmaceutics. 15 (4), 1674-1681 (2018).
  19. Lesniak, W. G., et al. PD-L1 detection in tumors using [(64)Cu]Atezolizumab with PET. Bioconjugate Chemistry. 27 (64), 2103-2110 (2016).
  20. Kristensen, L. K., et al. CD4(+) and CD8a(+) PET imaging predicts response to novel PD-1 checkpoint inhibitor: studies of Sym021 in syngeneic mouse cancer models. Theranostics. 9 (26), 8221-8238 (2019).
  21. Christensen, C., Kristensen, L. K., Alfsen, M. Z., Nielsen, C. H., Kjaer, A. Quantitative PET imaging of PD-L1 expression in xenograft and syngeneic tumour models using a site-specifically labelled PD-L1 antibody. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 47 (5), 1302-1313 (2020).
  22. Bensch, F., et al. 89Zr-atezolizumab imaging as a non-invasive approach to assess clinical response to PD-L1 blockade in cancer. Nature Medicine. 24 (12), 1852-1858 (2018).
  23. Gonzalez Trotter, D. E., et al. In vivo imaging of the programmed death ligand 1 by 18F PET. Journal of Nuclear Medicine. 58 (11), 1852-1857 (2017).
  24. Lv, G., et al. Promising potential of a 18F-labelled small-molecular radiotracer to evaluate PD-L1 expression in tumors by PET imaging. Bioorganic Chemistry. 115, 105294(2021).
  25. Miao, Y., et al. One-step radiosynthesis and initial evaluation of a small molecule PET tracer for PD-L1 imaging. Bioorganic & Medicinal Chemical Letters. 30 (24), 127572(2020).
  26. Kumar, D., et al. Peptide-based PET quantifies target engagement of PD-L1 therapeutics. The Journal of Clinical Investigation. 129 (2), 616-630 (2019).
  27. Powles, T., et al. MPDL3280A (anti-PD-L1) treatment leads to clinical activity in metastatic bladder cancer. Nature. 515 (7528), 558-562 (2014).
  28. Herbst, R. S., et al. Predictive correlates of response to the anti-PD-L1 antibody MPDL3280A in cancer patients. Nature. 515 (7528), 563-567 (2014).
  29. Marciscano, A. E., Gulley, J. L. Avelumab demonstrates promise in advanced NSCLC. Oncotarget. 8 (61), 102767-102768 (2017).
  30. Vaddepally, R. K., Kharel, P., Pandey, R., Garje, R., Chandra, A. B. Review of indications of FDA-approved immune checkpoint inhibitors per NCCN guidelines with the level of evidence. Cancers. 12 (3), 738(2020).
  31. Antonia, S. J., et al. Durvalumab after chemoradiotherapy in stage III non-small-cell lung cancer. The New England Journal of Medicine. 377 (20), 1919-1929 (2017).
  32. Wang, D. Y., et al. Fatal toxic effects associated with immune checkpoint inhibitors: a systematic review and meta-analysis. JAMA Oncology. 4 (12), 1721-1728 (2018).
  33. Sgouros, G., Bodei, L., McDevitt, M. R., Nedrow, J. R. Radiopharmaceutical therapy in cancer: clinical advances and challenges. Nature Reviews Drug Discovery. 19 (9), 589-608 (2020).
  34. (US) M. M. M, et al. Macrocyclic inhibitors of the pd-1/pd-l1 and cd80(b7-1)/pd-l1 protein/protein interactions. United States patent. , US-2017260237-A1 (2014).
  35. Chatterjee, S., et al. Rapid PD-L1 detection in tumors with PET using a highly specific peptide. Biochemical and Biophysical Research Communications. 483 (1), 258-263 (2017).
  36. De Silva, R. A., et al. Peptide-based 68Ga-PET radiotracer for imaging PD-L1 expression in cancer. Molecular Pharmaceutics. 15 (9), 3946-3952 (2018).
  37. Lesniak, W. G., et al. Development of [18F]FPy-WL12 as a PD-L1 specific PET imaging peptide. Molecular Imaging. 18, 1536012119852189(2019).
  38. Zhou, X., et al. First-in-humans evaluation of a PD-L1-binding peptide PET radiotracer in non-small cell lung cancer patients. Journal of Nuclear Medicine. 63 (4), 536-542 (2022).
  39. Hu, K., et al. Developing native peptide-based radiotracers for PD-L1 PET imaging and improving imaging contrast by pegylation. Chemical Communications. 55 (29), 4162-4165 (2019).
  40. Liu, H., et al. A novel small cyclic peptide-based 68Ga-Radiotracer for positron emission tomography imaging of PD-L1 expression in tumors. Molecular Pharmaceutics. 19 (1), 138-147 (2022).
  41. Rabideau, A. E., Pentelute, B. L. A D-amino acid at the N-terminus of a protein abrogates its degradation by the N-end rule pathway. ACS Central Science. 1 (8), 423-430 (2015).
  42. Uppalapati, M., et al. A potent D-protein antagonist of VEGF-A is nonimmunogenic, metabolically stable, and longer-circulating in vivo. ACS Chemical Biology. 11 (4), 1058-1065 (2016).
  43. Garton, M., et al. Method to generate highly stable D-amino acid analogs of bioactive helical peptides using a mirror image of the entire PDB. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (7), 1505-1510 (2018).
  44. Jia, F. J., et al. D-amino acid substitution enhances the stability of antimicrobial peptide polybia-CP. Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 49 (10), 916-925 (2017).
  45. Carmona, G., Rodriguez, A., Juarez, D., Corzo, G., Villegas, E. Improved protease stability of the antimicrobial peptide Pin2 substituted with D-amino acids. Protein Journal. 32 (6), 456-466 (2013).
  46. Feng, Z., Xu, B. Inspiration from the mirror: D-amino acid containing peptides in biomedical approaches. Biomolecular Concepts. 7 (3), 179-187 (2016).
  47. Hu, K., et al. Whole-body PET tracking of a d-dodecapeptide and its radiotheranostic potential for PD-L1 overexpressing tumors. Acta Pharmaceutica Sinica. B. 12 (3), 1363-1376 (2022).
  48. Qiu, X. Y., et al. PD-L1 confers glioblastoma multiforme malignancy via Ras binding and Ras/Erk/EMT activation. Biochimica Et Biophysica Acta. Molecular Basis of Disease. 1864, 1754-1769 (2018).
  49. Hu, K., et al. Development of a stable peptide-based PET tracer for detecting CD133-expressing cancer cells. ACS Omega. 7 (1), 334-341 (2021).
  50. Jin, Z. -H., et al. Radiotheranostic agent 64Cu-cyclam-RAFT-c(-RGDfK-)4 for management of peritoneal metastasis in ovarian cancer. Clinical Cancer Research. 26 (23), 6230-6241 (2020).
  51. Hu, K., et al. Harnessing the PD-L1 interface peptide for positron emission tomography imaging of the PD-1 immune checkpoint. RSC Chemical Biology. 1 (4), 214-224 (2020).
  52. Hu, K., et al. PET imaging of VEGFR with a novel 64Cu-labeled peptide. ACS Omega. 5 (15), 8508-8514 (2020).
  53. Hu, K., et al. An in-tether chiral center modulates the helicity, cell permeability, and target binding affinity of a peptide. Angewandte Chemie International Edition. 55 (28), 8013-8017 (2016).
  54. Zhao, J., et al. Concurrent injection of unlabeled antibodies allows positron emission tomography imaging of programmed cell death ligand 1 expression in an orthotopic pancreatic tumor model. ACS Omega. 5 (15), 8474-8482 (2020).
  55. Moroz, A., et al. A preclinical assessment of 89Zr-atezolizumab identifies a requirement for carrier added formulations not observed with 89Zr-C4. Bioconjugate Chemistry. 29 (10), 3476-3482 (2018).
  56. Nedrow, J. R., et al. Imaging of programmed cell death ligand 1: impact of protein concentration on distribution of anti-PD-L1 SPECT agents in an immunocompetent murine model of melanoma. Journal of Nuclear Medicine. 58 (10), 1560-1566 (2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

1921PD 1PD L1IHCPETDD PD L1 68GaD DPA

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved