JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מתאר אסטרטגיה משולבת לחקר המטרות והמנגנונים העיקריים של Fructus Phyllanthi נגד היפרליפידמיה המבוססת על חיזוי פרמקולוגיה של הרשת ואימות מטבולומי.

Abstract

היפרליפידמיה הפכה לגורם סיכון מוביל למחלות לב וכלי דם ולפגיעה בכבד ברחבי העולם. פרוקטוס פילנטי (FP) היא תרופה יעילה נגד היפרליפידמיה ברפואה הסינית המסורתית (TCM) ובתיאוריות הרפואה ההודית, אולם המנגנון הפוטנציאלי דורש חקירה נוספת. המחקר הנוכחי נועד לחשוף את המנגנון של FP נגד היפרליפידמיה המבוסס על אסטרטגיה משולבת המשלבת חיזוי פרמקולוגיה ברשת עם אימות מטבולומי. מודל עכברים עם דיאטה עתירת שומן (HFD) הוקם על ידי הערכת רמות השומנים בפלזמה, כולל כולסטרול כולל (TC), טריגליצרידים (TG), כולסטרול ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה (LDL-C) וכולסטרול ליפופרוטאין בצפיפות גבוהה (HDL-C). פרמקולוגיה ברשת יושמה כדי לגלות את החומרים הפעילים של FP ומטרות פוטנציאליות נגד היפרליפידמיה. מטבולומיקה של פלזמה וכבד בוצעה כדי לזהות מטבוליטים דיפרנציאליים ואת המסלולים המתאימים להם בין הקבוצה הנורמלית, קבוצת המודל וקבוצת ההתערבות. הקשר בין פרמקולוגיה רשת ומטבולומיקה נבנה עוד יותר כדי לקבל מבט מקיף על תהליך FP נגד היפרליפידמיה. חלבוני המטרה העיקריים שהתקבלו אומתו על ידי עגינה מולקולרית. תוצאות אלה שיקפו כי FP שיפר את רמות השומנים בפלזמה ואת הפגיעה בכבד של היפרליפידמיה הנגרמת על ידי HFD. חומצה גאלית, קוורצטין ובטא-סיטוסטרול ב-FP הודגמו כתרכובות הפעילות העיקריות. בסך הכל 16 ושישה מטבוליטים דיפרנציאליים פוטנציאליים בפלזמה ובכבד, בהתאמה, נמצאו מעורבים בהשפעות הטיפוליות של FP נגד היפרליפידמיה על ידי מטבולומיקה. יתר על כן, ניתוח אינטגרציה הצביע על כך שהשפעות ההתערבות היו קשורות ל- CYP1A1, AChE ו- MGAM, כמו גם להתאמה של L-kynurenine, קורטיקוסטרון, אצטילכולין ורפינוז, בעיקר הקשורים למסלול חילוף החומרים של טריפטופן. עגינה מולקולרית הבטיחה כי המרכיבים הנ"ל הפועלים על מטרות חלבוניות הקשורות להיפרליפידמיה מילאו תפקיד מפתח בהורדת השומנים. לסיכום, מחקר זה סיפק אפשרות חדשה למניעה וטיפול בהיפרליפידמיה.

Introduction

היפרליפידמיה היא מחלה מטבולית נפוצה עם השפעות חמורות על בריאות האדם, והיא גם גורם הסיכון העיקרי למחלות לב וכלי דם1. לאחרונה, חלה מגמת ירידה הקשורה לגיל למחלה זו, ואנשים צעירים הפכו רגישים יותר בגלל אורח חיים לא סדיר לטווח ארוך והרגלי אכילה לא בריאים2. במרפאה נעשה שימוש בתרופות שונות לטיפול בהיפרליפידמיה. לדוגמה, אחת התרופות הנפוצות ביותר עבור חולים עם היפרליפידמיה והפרעות טרשת עורקים הקשורות היא סטטינים. עם זאת, לשימוש ארוך טווח בסטטינים יש תופעות לוואי שלא ניתן להזניח, אשר מובילות לפרוגנוזה גרועה, כגון חוסר סובלנות, עמידות לטיפול ותופעות לוואי 3,4. חסרונות אלה הפכו לכאבים נוספים עבור חולי היפרליפידמיה. לכן, יש להציע טיפולים חדשניים ליעילות יציבה להורדת שומנים ופחות תופעות לוואי.

הרפואה הסינית המסורתית (TCM) נמצאת בשימוש נרחב לטיפול במחלות בגלל יעילותה הטובה ומעט תופעות לוואי5. Fructus Phyllanthi (FP), הפרי היבש של Phyllanthus emblica Linn. (הידוע בכינויו אמלה ברי או דומדמניות הודיות), הוא חומר הומולוגי מפורסם של תרופות סיניות מסורתיות והודו 6,7. תרופה זו שימשה לניקוי חום, קירור דם וקידום העיכול, לפי תיאוריות TCM8. מחקרים פרמקולוגיים מודרניים הראו כי FP עשיר בתרכובות ביו-אקטיביות כגון חומצות גאליות, חומצות אלגיות וקוורצטין9, אשר אחראיות למגוון תכונות ביולוגיות מרובות פנים, על ידי פעולה כנוגד חמצון, אנטי דלקתי, הגנה על הכבד, אנטי היפוליפידמי, וכן הלאה10. מחקרים אחרונים הראו גם כי FP יכול לווסת ביעילות את שומני הדם של חולים עם היפרליפידמיה. לדוגמה, Variya et al.11 הוכיחו כי מיץ פירות FP והמרכיב הכימי העיקרי שלו של חומצה גאלית יכולים להפחית את הכולסטרול בפלזמה ולהפחית חדירת שמן בכבד ובאבי העורקים. היעילות הטיפולית הייתה קשורה לוויסות של FP בהגברת הביטוי של קולטן אלפא המופעל על ידי פרוליפרטור פרוליפרטור ובהפחתת הפעילות הליפוגנית בכבד. עם זאת, המנגנון הבסיסי של FP בשיפור היפרליפידמיה צריך להיחקר עוד יותר, כי המרכיבים הביו-אקטיביים שלה הם די נרחבים. ביקשנו לחקור את המנגנון הפוטנציאלי של היעילות הטיפולית של FP, אשר עשוי להועיל להמשך הפיתוח והשימוש של תרופה זו.

כיום, פרמקולוגיה של הרשת נחשבת לטכניקה הוליסטית ויעילה לחקר המנגנון הטיפולי של TCM. במקום לחפש גנים גורמי מחלה בודדים ותרופות המטפלות אך ורק במטרה בודדת, נבנית רשת שלמה של תרופות-מרכיבים-גנים-מחלות כדי למצוא את המנגנון הרב-תכליתי של התרופה מרובת המרכיבים בנוגע לטיפול המקיף שלהם12. טכניקה זו מתאימה במיוחד עבור TCM, כמו ההרכב הכימי שלהם הם מאסיביים. למרבה הצער, פרמקולוגיה של רשת יכולה לשמש רק כדי לחזות מטרות המושפעות מרכיבים כימיים בתיאוריה. מטבוליטים אנדוגניים במודל המחלה יש לראות כדי לאמת את האפקטיביות של פרמקולוגיה ברשת. שיטת המטבולומיקה, המתהווה עם התפתחות הביולוגיה של המערכות, היא כלי חשוב למעקב אחר השינויים במטבוליטים אנדוגניים13. השינויים במטבוליטים משקפים את שינויי המצב היציב של המארח, שהוא גם אינדיקטור חשוב לחקר המנגנון הפנימי. כמה חוקרים שילבו בהצלחה פרמקולוגיה רשת ומטבולומיקה כדי לחקור את מנגנון האינטראקציה בין תרופות ומחלות14,15.

מאמר זה בוחן את הבסיס המכניסטי של FP נגד היפרליפידמיה על ידי שילוב פרמקולוגיה רשת וטכניקות מטבולומיקה. פרמקולוגיה ברשת יושמה כדי לנתח את הקשר בין החומרים הפעילים העיקריים ב- FP לבין מטרות מולקולריות עבור היפרליפידמיה. לאחר מכן, metabolomics בוצע כדי לבחון את השינוי של מטבוליטים אנדוגניים במודל החי, אשר יכול להסביר את פעולות התרופה ברמה המטבולית. בהשוואה ליישום של פרמקולוגיה ברשת או מטבונומיה בלבד, ניתוח משולב זה סיפק מנגנון מחקר ספציפי ומקיף יותר. בנוסף, אסטרטגיית העגינה המולקולרית שימשה לניתוח האינטראקציה בין חומרים פעילים וחלבוני מפתח. באופן כללי, גישה משולבת זו יכולה לפצות על היעדר ראיות ניסיוניות לפרמקולוגיה רשתית והיעדר מנגנון אנדוגני לשיטת המטבולומיקה, וניתן להשתמש בה לניתוח המנגנון הטיפולי של הרפואה הטבעית. תרשים הזרימה הסכמטי הראשי של הפרוטוקול מוצג באיור 1.

Protocol

כל ההליכים הנוגעים לטיפול בבעלי חיים נערכו בהתאם למדריך הרפואה הסינית המסורתית של אוניברסיטת צ'נגדו לטיפול ושימוש בחיות מעבדה ואושרו על ידי ועדת האתיקה המוסדית של אוניברסיטת צ'נגדו לרפואה סינית מסורתית (פרוטוקול מספר 2020-36). עכברי C57BL/6 זכרים (20 ± 2 גרם) שימשו במחקר הנוכחי. העכברים התקבלו ממקור מסחרי (ראו טבלת חומרים).

1. חיזוי מבוסס פרמקולוגיה של הרשת

הערה: פרמקולוגיה הרשת משמשת לחיזוי החומרים הפעילים ואת המטרות העיקריות שלהם של FP נגד היפרליפידמיה.

  1. בחירת החומרים הפעילים ויעדים מרכזיים
    1. חפש את מילת המפתח "Phyllanthi Fructus" במסד הנתונים הפרמקולוגי של מערכת הרפואה הסינית המסורתית (TCMSP; http://tcmspw.com/tcmsp.php) כדי לקבל את רשימת החומרים הפעילים המועמדים והמטרות של FP.
      הערה: בדרך כלל, רק רכיבים עם זמינות ביולוגית פומית (OB) ≥30% וערכים דמויי תרופה (DL) ≥0.18 במסד הנתונים כלולים כמרכיבים פעילים.
    2. חפש את מילת המפתח "היפרליפידמיה" במסד הנתונים GeneCards (https://www.genecards.org/), במסד הנתונים המקוון של תורשה מנדליאנית באדם (OMIM; https://omim.org/), ובמסד הנתונים של המטרות הטיפוליות (TTD; http://db.idrblab.net/ttd/) כדי להשיג את המטרות המועמדות בהתאמה להיפרליפידמיה. הורד את הגיליונות האלקטרוניים של יעדי המחלה. מחק את המטרות החוזרות כדי לקבל את רשימת יעדי ההיפרליפידמיה.
    3. העתק רשימות אלה משלבים 1.1.1 ו- 1.1.2 לגיליון אלקטרוני חדש. השתמש בפונקציה "נתונים - זיהוי כפילויות" בסרגל הכלים כדי לקבל יעדי הצטלבות. ייבא את רשימת יעדי ההצטלבות ל- UniProtKB (http://www.uniprot.org/) כדי לתקנן את שמות הגנים והחלבונים.
      הערה: יעדים אלה קשורים הן ל-FP והן להיפרליפידמיה. לכן, לחזות מטרות הצטלבות אלה כמטרות של FP נגד היפרליפידמיה.
  2. בניית רשת אינטראקציה חלבון-חלבון
    1. פתח את מסד הנתונים STRING (https://string-db.org/) 11.5. הדבק את רשימת יעדי ההצטלבות של FP נגד היפרליפידמיה בתיבת הדו-שיח "רשימת שמות". בחר הומו ספיינס ב "אורגניזמים" ולחץ על החיפוש > המשך.
      הערה: לבני אדם ולעכברים יש גנים דומים מאוד. לכן, אימות ניסיוני נוסף מתבצע עם עכברים.
    2. כאשר התוצאות זמינות, סמן את הסתר צמתים מנותקים ברשת ב "הגדרות מתקדמות". הגדר את הביטחון הגבוה ביותר (0.900) ב"ציון אינטראקציה מינימלי נדרש", ולאחר מכן לחץ על כפתור UPDATE .
    3. לחץ על יצוא בשורת הכותרת והורד את הטקסט הטבלאי הקצר של רשת אינטראקציית חלבון-חלבון (PPI) בפורמט PNG ו- TSV.
  3. בניית רשת תרופות-רכיבים-מחלות-מטרה
    1. פתח את Cytoscape 3.9.1 (ראה טבלת חומרים). ייבא את הקובץ בפורמט TSV של שלב 1.2.3. מטב את הצבע, הגופן והצד של צמתי הרשת דרך סרגל הסגנון בלוח הבקרה.
    2. השתמש בפונקציה "ניתוח רשת" לניתוח טופולוגיית רשת. השגת גנים רכזת על ידי CytoHubba ב Cytoscape. להקים את רשת התרופות-מרכיבים-מטרה-מחלות.
  4. ניתוח העשרה של GO ו-KEGG
    1. פתח את DAVID Bioinformatics Resources (https://david.ncifcrf.gov/home.jsp). לחץ על התחל ניתוח והדבק את רשימת היעד בתיבת הדו-שיח השמאלית. בחר סמל גן רשמי ב"בחר מזהה". בחר הומו ספיינס ב"בחר מינים". סמן רשימת גנים ב"סוג רשימה". לחץ על שלח רשימה.
    2. כאשר התוצאות זמינות, לחץ על נתח מעל רשימת הגנים עם אחד מכלי DAVID. טיק GOTERM_BP_DIRECT, GOTERM_CC_DIRECT, GOTERM_MF_DIRECT ב"אונטולוגיה גנטית" לניתוח העשרת פונקציות GO. סמן KEGG_Pathway ב"נתיבים" לניתוח העשרת מסלול KEGG.
    3. לחץ על תרשים ביאור פונקציונלי כדי להציג את התוצאות.
      הערה: הגדר את סף המובהקות הסטטיסטית של ניתוח ההעשרה על p < 0.05.

2. תכנון ניסיוני

  1. הכנת תמצית מימית FP
    הערה: FP מעובד במעבדה של פרופסור לינה שיה באוניברסיטת צ'נגדו של TCM8.
    1. השרו את האבקה המיובשת של FP (90 גרם) ב-1 ליטר מים טהורים בצלוחית נפחית נקייה בנפח 2 ליטר. השתמש בטיפול קולי (באמבט מים 4 ° C, כוח: 250W, תדר: 35 קילוהרץ) כדי לעזור להתמוסס במשך 30 דקות. סנן את הפתרון כדי לקבל את התמצית עם שכבה כפולה, 1 מ"מ x 1 מ"מ גזה רפואית סטרילית. חזור על הפעולה לעיל שלוש פעמים כדי להבטיח פירוק מלא של FP.
    2. השתמש בשיטת האידוי הסיבובי לריכוז נוסף. הגדר את מהירות הסיבוב ל -50 סל"ד עם טמפרטורה של 60 ° C למשך 4 שעות. רכזים את התמצית המימית ל-100 מ"ל.
    3. מחלקים את התמצית הגולמי של FP (0.9 גרם/מ"ל) באופן שווה לשני חלקים (50 מ"ל). חלק אחד משמש כנוזל FP במינון גבוה (0.9 גרם / מ"ל). הוסף 50 מ"ל של מים טהורים לחלק אחר, ולשקול את זה כמו נוזל FP במינון נמוך (0.45 גרם / מ"ל). השתמש בתמיסות מימיות FP במינון גבוה ונמוך לניהול. יש לאחסן את הנוזל בטמפרטורה של -20°C עד לשימוש.
  2. הכנת בעלי חיים
    1. אכלסו 50 עכברי C57BL/6 זכרים (20 ± 2 גרם) בחדר מאוורר היטב בטמפרטורת החדר, עם מחזור אור-חושך של 12 שעות וגישה חופשית למזון ומים טהורים.
    2. הקצו את העכברים באופן אקראי לשתי קבוצות: האכילו 10 עכברים בתזונה רגילה ו-40 עכברים בתזונה עתירת שומן (ראו טבלת חומרים) כדי לגרום להיפרליפידמיה.
      הערה: לאחר האכלה במשך 8 שבועות, העכברים נבדקו להתערבות תרופתית נוספת.
    3. בשבוע השמיני, למשוך כ 200 μL של דם מכל מסלול עכבר. צנטריפוגה את הדם במשך 10 דקות ב 5,733 x גרם ב 4 ° C כדי לקבל דגימות פלזמה. קבע את רמות TC ו- TG באמצעות ערכות בדיקה זמינות מסחרית (ראה טבלת חומרים).
    4. בחר שישה עכברים עם רמות השומנים הנורמליות ביותר כקבוצת הבקרה ללא טיפול (NC). בחר 24 עכברים עם רמת שומנים גבוהה משמעותית כמו קבוצת דיאטה עתירת שומן, וחלק אותם באופן אקראי לארבע קבוצות: קבוצת דיאטה עתירת שומן (HFD), קבוצת FP במינון נמוך (FP_L), קבוצת FP במינון גבוה (FP_H) וקבוצת ביקורת חיובית (PC).
    5. מתן השקיית קיבה לקבוצות FP_L ו -FP_H עם שני מינונים של FP (מינון נמוך, 4.5 גרם / ק"ג ומינון גבוה, 9 גרם / ק"ג), בהתאמה; השקיית קיבה לקבוצת PC עם טבליות סימבסטטין (5 מ"ג/ק"ג; ראו טבלת חומרים); והשקיית קיבה לקבוצות NC ו- HFD עם אותו נפח של מלח פיזיולוגי פעם ביום במשך 4 שבועות.
      הערה: המחקר הנוכחי השתמש בתמיסות מימיות של FP וסימבסטטין לטיפול.
    6. בשבוע ה -12, לאחר הרדמה על ידי 1% נתרן pentobarbital (30 מ"ג / ק"ג), להקריב את העכברים של כל הקבוצות. אספו ~ 400 μL דגימות דם מהווריד האורביטלי של כל עכבר.
      הערה: לגרות את אצבעות הרגליים וכפות הרגליים של העכברים באמצעות פינצטה. אם אין תגובה, זה מוכיח הרדמה מספקת.
    7. צנטריפוגה את הדם במשך 10 דקות ב 5,733 x גרם ב 4 ° C כדי לקבל דגימות פלזמה, ולקבוע את רמות TC, TG, LDL-C, ו HDL-C עם ערכות בדיקה זמין מסחרית (ראה טבלה של חומרים). להשיג דגימות רקמת כבד16 ולהכפיף אותם ניתוח היסטופתולוגי. השתמש בדגימות הפלזמה והכבד הנותרות לניתוח מטבולומיקה (שלב 3).
      הערה: כל הדגימות מאוחסנות בטמפרטורה של -80°C עד לשימוש.
  3. בדיקה היסטופתולוגית של הכבד
    1. תקן רקמות כבד טריות עם תמיסת פרפורמלדהיד 4% למשך יותר מ -24 שעות. מוציאים את הרקמה מהקיבוע ומחליקים את רקמות היעד בעזרת אזמל. מניחים את הרקמה ואת התווית המתאימה לתוך המייבש.
    2. התייבשות בשיפוע אתנול: 75% אלכוהול למשך 4 שעות, 85% אלכוהול למשך שעתיים, 90% אלכוהול למשך שעתיים, 95% אלכוהול למשך שעה, אתנול מוחלט למשך שעה אחת, קסילן למשך 30 דקות. מניחים את קלטת הטישו בתבנית טישו בשעוות פרפין למשך שלוש כביסות, 30 דקות כלאחת 16.
    3. הכניסו את הרקמות ספוגות השעווה לתוך מוטמע הרקמה (ראו טבלת חומרים). לפני שהשעווה מתמצקת, הסר את הרקמות מהמייבש, הכנס אותן לקופסה המוטבעת וצרף את התווית המתאימה.
    4. מצננים את קוביות השעווה בטבלת הקפאה בטמפרטורה של -20°C, מוציאים אותן מהמסגרת המשובצת וחותכים את גוש השעווה.
    5. חתכו את גושי השעווה החתוכים למקטעים בעובי 3 מיקרומטר באמצעות מיקרוטום (ראו טבלת חומרים). צפים את החלקים במים של 40 מעלות צלזיוס, מוציאים אותם מהמגלשות ואופים בתנור של 60 מעלות צלזיוס. לאחר האפייה עם מים ושעווה יבשה, מוציאים ושומרים בטמפרטורת החדר.
    6. מניחים ברצף את החלקים בקסילן I למשך 10 דקות, קסילן II למשך 10 דקות, קסילן III למשך 10 דקות, אתנול מוחלט I למשך 5 דקות, אתנול מוחלט II למשך 5 דקות, 75% אלכוהול למשך 5 דקות, ושטף במים16.
    7. צובעים את החלקים בתמיסת צביעת המטוקסילין למשך 4 דקות, תמיסת אלכוהול 1% חומצה הידרוכלורית (75% אלכוהול) להבחנה, תמיסת מי אמוניה 1% חזרה כחולה, ושוטפים אותם במים.
    8. מכתימים את החלקים בתמיסת צביעת אאוסין למשך 2 דקות ושוטפים אותם במים.
    9. התבונן במקטעים באמצעות מיקרוסקופ אופטי עם הגדלה של 200x ו 400x.
  4. ניתוח כרומטוגרפיה נוזלית-ספקטרומטריית מסות (LC-MS)
    1. זיהוי רכיבים של FP
      הערה: הניתוח מבוצע באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים במיוחד בשילוב עם ספקטרומטריית מסה היברידית מרובעת-אורביטרפ ברזולוציה גבוהה (UPLC-Q-Orbirap HRMS, LC-MS; ראה טבלת חומרים).
      1. למדוד במדויק 1 גרם של אבקה יבשה של FP ולשים אותו נקי 50 מ"ל בקבוק נפחי.
      2. מוסיפים 25 מ"ל של 70% מתנול לבקבוק הנפחי ושוקלים במדויק. השתמש בטיפול קולי (באמבט מים 4 °C, כוח: 250 W, תדר: 35 קילוהרץ) במשך 30 דקות כדי לסייע בהמסה. שקול שוב במדויק כדי לקבוע במדויק את ההפסד לאחר פירוק, והשתמש 70% מתנול כדי להשלים את ההפסד.
        הערה: אל תמדוד את עוצמת הקול, מכיוון שקנה המידה של הבקבוק הנפחי אינו מדויק, במיוחד לאחר אמבט מים של 4 מעלות צלזיוס.
      3. נערו לערבוב מלא. השתמש בקרום מיקרונקבובי של 0.22 מיקרומטר כדי לסנן.
    2. הכנת דגימת פלזמה
      1. הוסף במדויק 100 μL של פלזמה (שלב 2.2.7) לתוך נפח כפול (200 μL) של acetonitrile בתוך צינור צנטריפוגה 1.5 מ"ל, ולערבב אותו עם ויברטור מערבולת במשך 30 שניות לפחות. בצע הליך זה עבור כל הדגימות.
      2. צנטריפוגה כל הדגימות ב 17,200 x גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C. מעבירים את הסופרנאטנטים לאחר הצנטריפוגה לצינור צנטריפוגה חדש בנפח 1.5 מ"ל. יבשו את הסופרנאטנטים תחת חנקן. צור מחדש עם 200 μL של ממס מיצוי (acetonitrile:water = 4: 1 [v/v]).
      3. מערבולת את הפתרון מחדש לפחות 30 s ולהשתמש בטיפול קולי במשך 10 דקות (באמבט מים 4 °C, כוח: 250 W, תדר: 35 קילוהרץ). צנטריפוגה ב 17,200 x גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C.
      4. סננו את הסופרנאטנטים עם קרומי מסנן של 0.22 מיקרומטר ושמרו אותם בטמפרטורה של 4°C לצורך ניתוח.
    3. הכנת דגימת כבד
      1. הומוגניזציה של 90 מ"ג רקמת כבד (שלב 2.2.7) למשך דקה אחת במי מתנול קרים כקרח (1:1, v/v, 1 מ"ל) וצנטריפוגה אותם במהירות של 21,500 x גרם למשך 10 דקות ב-4°C. מעבירים את הסופרנאטנט לצינורות צנטריפוגות בנפח 1.5 מ"ל. בצע הליך זה עבור כל הדגימות.
      2. חלצו את המשקעים שוב באותו הליך, ואגרו את הסופרנאטנטים יחד לצינורות צנטריפוגות חדשים בנפח 1.5 מ"ל. יבשו את הסופרנאטנטים תחת חנקן. צור מחדש עם 300 μL של ממס מיצוי (מתנול:מים = 4: 1 [v/v]).
      3. מערבולת את הפתרון מחדש לפחות 30 s ולהשתמש בטיפול קולי במשך 10 דקות (באמבט מים 4 °C, כוח: 250 W, תדר: 35 קילוהרץ). צנטריפוגה ב 17,200 x גרם במשך 15 דקות ב 4 ° C.
      4. סננו את הסופרנאטנטים עם קרומי מסנן של 0.22 מיקרומטר ושמרו אותם בטמפרטורה של 4°C לצורך ניתוח.
        הערה: דגימות בקרת האיכות המאוגמות (QC) הוכנו על ידי ערבוב של 10 μL aliquots מכל דגימת פלזמה וכבד (אחת לשש דגימות).
    4. פרמטרי ניתוח של LC-MS
      הערה: השלב הנייד מורכב מ-0.1% חומצה פורמית (ממס A) ואצטוניטריל (ממס B). העבירו את הממסים הללו לבקבוק זכוכית נקי וחברו אותם למערכת LC-MS.
      1. הגדר את תוכניות השיפוע של דגימות פלזמה ב"קובץ הכניסה" של מערכת LC-MS באופן הבא: 1% B (0-1.5 דקות), 1%-60% B (1.5-13.0 דקות), 60%-99% B (13.0-20.0 דקות), שמור על 99% B (20.0-25.0 דקות), 99%-1% B (25.0-25.1 דקות), ושמור על 1% B עד 27 דקות.
      2. הגדר את תנאי הדגימה האוטומטית של דגימות הפלזמה ב"קובץ הכניסה "של מערכת LC-MS כדלקמן: נפח ההזרקה, 2 μL; וקצב הזרימה, 0.3 מ"ל/דקה, עבור כל ניתוח.
      3. הגדר את תוכנית השיפוע של דגימות כבד ב"קובץ הכניסה" של מערכת LC-MS באופן הבא: 1% B (0-1 דקות), 1%-53% B (1-15 דקות), 53%-70% B (15-30 דקות), 70%-90% B (30-32 דקות), 90%-95% B (32-40 דקות), 95%-1% B (40-42 דקות), ושמור על 1% B עד 45 דקות.
      4. הגדר את תנאי הדגימה האוטומטית של דגימות הכבד ב"קובץ הכניסה "של מערכת LC-MS כדלקמן: נפח הזרקה, 5 μL; וקצב הזרימה, 0.3 מ"ל/דקה, עבור כל ניתוח.
      5. הגדר את תנאי זיהוי הטרשת הנפוצה הן של דגימות הפלזמה והן של דגימות הכבד בקובץ "MS tune" של מערכת LC-MS. בצע את רכישת הטרשת הנפוצה באמצעות מצבי יינון חיוביים ושליליים כאחד.
        הערה: הפרמטרים ליינון אלקטרוספריי מחומם הם כדלקמן: מתח ריסוס: 3.5 kV עבור יינון חיובי ו 3.8 kV עבור יינון שלילי; זרימת גז מעטפת: 55 ARB; זרימת גז עזר: 15 ARB; טמפרטורת מחמם בדיקה: 300 °C; וטמפרטורת נימים: 350 מעלות צלזיוס.
      6. יבא את הנתונים הגולמיים שנאספו לתוכנת Compound Discoverer והגדר את תבנית השיטה בהתאם להוראות היצרן (ראה טבלת חומרים).

3. אימות מטאבולומי

הערה: נתוני הפרופיל המטבולי של מטבוליטים של פלזמה וכבד מיובאים לתוכנת Compound Discoverer כדי לבצע את מיצוי התכונות המטבוליות על ידי אימוץ אלגוריתם מיצוי תכונות מולקולרי. הגדר את הפרמטרים כדלקמן: סטיית מסה, 5 x 10-6; טווח מסה, 100-1,500; סף יחס אות לרעש (SNR), 3; וסטיית זמן שמירה, 0.05. להעריך את היציבות והחזרתיות של מטבולומיקה לפי סטיית התקן היחסית (RSD) של אזורי שיא QC.

  1. השתמש בתוכנת SIMCA-P (ראה טבלת חומרים) לניתוח סטטיסטי רב-משתני של הערכים האינטגרליים המתקבלים מממצאי LC-MS. השתמש בניתוח דיסקרימיננטי אורתוגונלי חלקי לפחות ריבועים (OPLS-DA) עבור הנתונים הממוקדים בממוצע ומידול של מחלקות מדגם.
  2. לאחר מבחן OPLS-DA, שקול את המטבוליטים, עם אינטגרל עם חשיבות משתנה בערכי ההיטל (VIP) של >1 וערך p של <0.05 ממבחן t של סטודנט כמטבוליטים דיפרנציאליים פוטנציאליים.
  3. זהה את המטבוליטים והמסלולים המטבוליים המופרעים על ידי מקורות מסד נתונים פתוחים, כולל מטבוליזם אנושי (HMDB; http://www.hmdb.ca/), אנציקלופדיה קיוטו לגנים וגנומים (KEGG; https://www.kegg.jp/) ו- MetaboAnalyst5.0 (https://www.metaboanalyst.ca/).
  4. הצג באופן חזותי את תצוגות התוצאות על ידי MetaboAnalyst5.0 ופלטפורמת 'וו קונג' (https://www.omicsolution.com/wkomics/main/).

4. עגינה מולקולרית

  1. הורד את המבנה התלת-ממדי של רכיבי FP שנבחרו ממסד הנתונים TCMSP, בהתאמה. חפש את שמות המרכיבים בתיבת החיפוש 'שם כימי' והורד את קובצי המבנה התלת-ממדי המתאימים בפורמט mol2.
  2. הורד את המבנים הגבישיים של מטרות המפתח ממסד הנתונים של מבנה החלבונים AlphaFold (Alphafold DB;, https://alphafold.ebi.ac.uk/). חפש בשמות היעד בתיבת החיפוש והורד את קובצי מבני הגביש המתאימים בפורמט PDB.
  3. ייבוא רכיבים וקובץ מבני יעד לתוכנת AutoDockTools. לחץ על ערוך > מחק מים כדי למחוק מולקולות מים. לחץ על Edit > Hydrogens > Add כדי להוסיף מימן. הגדר את המרכיבים כ'ליגנד' ובצע עגינה עיוורת על ידי בחירת המטרות השלמות כ'קולטן'17.
  4. הזן ערך בתיבה מאחורי "מרכז" ו"גודל" כדי להתאים את החלל החדש שפותח, מה שמאפשר להקיף באופן מלא את הליגנד ואת הקולטן. שמור את קבצי הליגנד והקולטן בפורמט pdbqt.
  5. השתמש ב- AutoDock Vina כדי לבצע עגינה מולקולרית. הגדר את סרגל "קולטן" לשם 'receptor.pdbqt', ואת סרגל "Ligand" לשם 'ligand.pdbqt'. השג את המיקום האופטימלי לקשירת ליגנד לקולטן. רשום את ערך האנרגיה המחייבת במיקום האופטימלי.
    הערה: תהליך העגינה חושב על ידי האלגוריתם הגנטי14. כל אפשרויות הפעלת העגינה היו ערכי ברירת מחדל. מסגרות העגינה ידורגו אוטומטית מאנרגיית הקישור הגבוהה ביותר לנמוכה ביותר.
  6. ייבא את קבצי העגינה לתוך PILP (Protein-ligand Interaction Profiler' https://plip-tool.biotec.tu-dresden.de/plip-web/plip/index) כדי לקבל את מודל מערכת הראייה. הורד את קובצי המודל בפורמט pse וייבא אותם לתוכנת PyMOL (ראה טבלת חומרים) כדי לבנות תצוגה חזותית נוספת.

5. ניתוח סטטיסטי

הערה: השתמש בתוכנה סטטיסטית SPSS (ראה טבלת חומרים) לניתוח נתונים. שקול את הערך של p < 0.05 כמובהק סטטיסטית.

  1. בטא את הערכים כאמצעי ± סטיית תקן (SD).
  2. בצע ANOVA חד-כיווני ואחריו Post hoc least significant Difference (LSD), Dunnett (במקרה של שונות שווה), או T3 של Dunnett (במקרה של שונות לא שווה) כדי לבדוק מובהקות סטטיסטית בין קבוצות.

תוצאות

פרמקולוגיה רשתית
סך של 18 מרכיבים פוטנציאליים ב-FP נבדקו על פי התכונות הפרמקוקינטיות והפרמקודינמיות שלהם ממסד הנתונים ומניתוח LC-MS (סך כרומטוגרמות היונים מוצג באיור משלים 1). באמצעות ספרות רלוונטית, התוכן של חומצה גאלית הוא הרבה יותר גבוה מאשר מרכיבים אחרים והוא יעיל בהור...

Discussion

בשנים האחרונות שיעור ההיארעות של היפרליפידמיה נמצא במגמת עלייה, בעיקר בשל הרגלי אכילה לא בריאים ארוכי טווח. TCM ומרכיביו הכימיים יש פעילויות פרמקולוגיות שונות, אשר נחקרו רבות בשנים האחרונות37,38. FP הוא סוג של משאב פירות, המשמש הן כתרופה והן כמזון, ויש לו פוטנצי?...

Disclosures

כל המחברים מצהירים כי אין להם ניגוד עניינים.

Acknowledgements

מחקר זה נתמך על ידי צוות פיתוח המוצר והחדשנות של TCM Health Preservation and Rehabilitation (2022C005) ומחקר על שילוב חוצה גבולות של עסקים חדשים של "שימור בריאות ושיקום+".

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
101-3B OvenLuyue Instrument and Equipment Factory\
80312/80302 Glass SlideJiangsu Sitai Experimental Equipment Co., LTD\
80340-1630 Cover SlipJiangsu Sitai Experimental Equipment Co., LTD\
AccucoreTM C18 (3 mm × 100 mm, 2. 6 μm)Thermo Fisher Scientific\
AcetonitrileFisher ChemicalA998Version 1.5.6
ACQUITY UPLC HSS T3 Column (2.1 mm × 100 mm, 1.8 μm)Thermo Fisher Scientific\
AethanolFisher ChemicalA995Version 3.0
Ammonia SolutionChengdu Cologne Chemicals Co., LTD1336-21-6Version 3.9.1
AutoDockToolsScripps Institution of Oceanography\
BS-240VT Full-automatic Animal Biochemical Detection SystemShenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co., Ltd.\
Compound DiscovererThermo Fisher Scientific\
CytoscapeCytoscape Consortium\
DM500 Optical MicroscopeLeica\
DV215CD Electronic BalanceOhaus Corporation ., LtdT15A63
Ethyl AlcoholChengdu Cologne Chemicals Co., LTD64-17-5
Formic AcidFisher ChemicalA118
HDL-C Assay KitNanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA112-1-1
Hematoxylin Staining SolutionBiosharpBL700B
High Fat DietENSIWEIER202211091031
Hitachi CT15E/CT15RE CentrifugeHitachi., Ltd.\
HomogenizerOulaibo Technology Co., Ltd\
Hydrochloric AcidChengdu Cologne Chemicals Co., LTD7647-01-0
Image-forming SystemLIOO\
JB-L5 FreezerWuhan Junjie Electronics Co., Ltd\
JB-L5 Tissue EmbedderWuhan Junjie Electronics Co., Ltd\
JK-5/6 MicrotomeWuhan Junjie Electronics Co., Ltd\
JT-12S HydroextractorWuhan Junjie Electronics Co., Ltd\
KQ3200E Ultrasonic CleanerKun Shan Ultrasonic Instruments Co., Ltd\
LDL-C Assay KitNanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA113-1-1
Male C57BL/6 Mice SBF Biotechnology Co., Ltd.\Version 2.3.2
Neutral BalsamShanghai Yiyang Instrument Co., Ltd10021190865934
Pure WaterGuangzhou Watson's Food & Beverage Co., LtdGB19298
PyMOLDeLano Scientific LLC\Version 14.1
RE-3000 Rotary EvaporatorYarong Biochemical Instrument Factory ., Ltd\
RM2016 Pathological MicrotomeShanghai Leica Instruments Co., Ltd\Version 26.0
SIMCA-PUmetrics AB\
SimvastatinMerck Sharp & Dohme., Ltd14202220051
SPSSInternational Business Machines Corporation\
TC Assay KitNanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA111-1-1
TG Assay KitNanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA110-1-1
UPLC-Q-Exactive Quadrupole Electrostatic Field Orbital Hydrazine High Resolution Mass SpectrometryThermo Fisher Scientific\
Vortex VibratorBeijing PowerStar Technology Co., Ltd.LC-Vortex-P1
XyleneChengdu Cologne Chemicals Co., LTD1330-20-7

References

  1. Nelson, R. H. Hyperlipidemia as a risk factor for cardiovascular disease. Primary Care: Clinics in Office Practice. 40 (1), 195-211 (2013).
  2. Mach, F., et al. 2019 ESC/EAS Guidelines for the management of dyslipidaemias: lipid modification to reduce cardiovascular risk: the Task Force for the management of dyslipidaemias of the European Society of Cardiology (ESC) and European Atherosclerosis Society (EAS). European Heart Journal. 41 (1), 111-188 (2020).
  3. Oesterle, A., Laufs, U., Liao, J. K. Pleiotropic effects of statins on the cardiovascular system. Circulation Research. 120 (1), 229-243 (2017).
  4. Last, A. R., Ference, J. D., Menzel, E. R. Hyperlipidemia: drugs for cardiovascular risk reduction in adults. American Family Physician. 95 (2), 78-87 (2017).
  5. Wu, S., et al. Recent advances of tanshinone in regulating autophagy for medicinal research. Front Pharmacol. 13, 1059360 (2022).
  6. Mirunalini, S., Krishnaveni, M. Therapeutic potential of Phyllanthus emblica (amla): the ayurvedic wonder. Journal of Basic and Clinical Physiology and Pharmacology. 21 (1), 93-105 (2010).
  7. Zhao, H. J., et al. Fructus phyllanthi tannin fraction induces apoptosis and inhibits migration and invasion of human lung squamous carcinoma cells in vitro via MAPK/MMP pathways. Acta Pharmacologica Sinica. 36 (6), 758-768 (2015).
  8. Yan, X., et al. Current advances on the phytochemical composition, pharmacologic effects, toxicology, and product development of Phyllanthi Fructus. Frontiers in Pharmacology. 13, 1017628 (2022).
  9. Yang, F., et al. Chemical constituents from the fruits of Phyllanthus emblica L. Biochemical Systematics and Ecology. 92, 104122 (2020).
  10. Wu, L., et al. Phytochemical analysis using UPLC-MSn combined with network pharmacology approaches to explore the biomarkers for the quality control of the anticancer tannin fraction of Phyllanthus emblica L. habitat in Nepal. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2021, 6623791 (2021).
  11. Variya, B. C., Bakrania, A. K., Chen, Y., Han, J., Patel, S. S. Suppression of abdominal fat and anti-hyperlipidemic potential of Emblica officinalis: Upregulation of PPARs and identification of active moiety. Biomedicine & Pharmacotherapy. 108, 1274-1281 (2018).
  12. Gertsch, J. Botanical drugs, synergy, and network pharmacology: forth and back to intelligent mixtures. Planta Medica. 77 (11), 1086-1098 (2011).
  13. Nicholson, J. K., Wilson, I. D. Understanding 'global' systems biology: metabonomics and the continuum of metabolism. Nature Reviews Drug Discovery. 2 (8), 668-676 (2003).
  14. Li, T., et al. Integrated metabolomics and network pharmacology to reveal the mechanisms of hydroxysafflor yellow A against acute traumatic brain injury. Computational and Structural Biotechnology Journal. 19, 1002-1013 (2021).
  15. Wang, F., et al. Network pharmacology combined with metabolomics to investigate the anti-hyperlipidemia mechanism of a novel combination. Journal of Functional Foods. 87, 104848 (2021).
  16. Adams, J. M., Jafar-Nejad, H. Determining bile duct density in the mouse liver. Journal of Visualized Experiments. (146), e59587 (2019).
  17. Wang, J. Y., et al. Use of viral entry assays and molecular docking analysis for the identification of antiviral candidates against coxsackievirus A16. Journal of Visualized Experiments. (149), e59920 (2019).
  18. Wu, L. F., Liang, W. Y., Zhang, L. Z. Determination of main components of Tibetan medicine Phyllanthus emblica L. World Science and Technology-Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica. 22 (8), 2857-2863 (2022).
  19. El-Hussainy, E. H. M., Hussein, A. M., Abdel-Aziz, A., El-Mehasseb, I. Effects of aluminum oxide (Al2O3) nanoparticles on ECG, myocardial inflammatory cytokines, redox state, and connexin 43 and lipid profile in rats: possible cardioprotective effect of gallic acid. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 94 (8), 868-878 (2016).
  20. Huang, W. Y., et al. Quercetin, hyper, and chlorogenic acid improve endothelial function by antioxidant, antiinflammatory, and ACE inhibitory effects. Journal of Food Science. 82 (5), 1239-1246 (2017).
  21. Lu, T. M., et al. Hypocholesterolemic efficacy of quercetin rich onion juice in healthy mild hypercholesterolemic adults: a pilot study. Plant Foods for Human Nutrition. 70 (4), 395-400 (2015).
  22. Witkowska, A. M., et al. Dietary plant sterols and phytosterol-enriched margarines and their relationship with cardiovascular disease among polish men and women: The WOBASZ II cross-sectional study. Nutrients. 14 (13), 2665 (2022).
  23. Turini, E., et al. Efficacy of plant sterol-enriched food for primary prevention and treatment of hypercholesterolemia: a systematic literature review. Foods. 11 (6), 839 (2022).
  24. Alamro, S. A., et al. Fermented camel milk enriched with plant sterols improves lipid profile and atherogenic index in rats fed high-fat and-cholesterol diets. Heliyon. , e10871 (2022).
  25. Gao, P., Wen, X., Ou, Q., Zhang, J. Which one of LDL-C/HDL-C ratio and non-HDL-C can better predict the severity of coronary artery disease in STEMI patients. BMC Cardiovascular Disorders. 22 (1), 318 (2022).
  26. Sun, T., et al. Predictive value of LDL/HDL ratio in coronary atherosclerotic heart disease. BMC Cardiovascular Disorders. 22 (1), 273 (2022).
  27. Maegawa, K., et al. Dietary raffinose ameliorates hepatic lipid accumulation induced by cholic acid via modulation of enterohepatic bile acid circulation in rats. British Journal of Nutrition. 127 (11), 1621-1630 (2022).
  28. Antony, B., Merina, B., Sheeba, V. AmlamaxTM in the management of dyslipidemia in humans. Indian Journal of Pharmaceutical Sciences. 70 (4), 504 (2008).
  29. Antony, B., Benny, M., Kaimal, T. N. B. A pilot clinical study to evaluate the effect of Emblica officinalis extract (Amlamax™) on markers of systemic inflammation and dyslipidemia. Indian Journal of Clinical Biochemistry. 23 (4), 378-381 (2008).
  30. Nambiar, S. S., Shetty, N. P. Phytochemical profiling and assessment of low-density lipoprotein oxidation, foam cell-preventing ability and antioxidant activity of commercial products of Emblica officinalis fruit. Journal of Food Biochemistry. 39 (3), 218-229 (2015).
  31. Gopa, B., Bhatt, J., Hemavathi, K. G. A comparative clinical study of hypolipidemic efficacy of Amla (Emblica officinalis) with 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme-A reductase inhibitor simvastatin. Indian Journal of Pharmacology. 44 (2), 238 (2012).
  32. Jung, T. W., et al. Administration of kynurenic acid reduces hyperlipidemia-induced inflammation and insulin resistance in skeletal muscle and adipocytes. Molecular and Cellular Endocrinology. , 518 (2020).
  33. Dong, Y., Li, X., Liu, Y., Gao, J., Tao, J. The molecular targets of taurine confer anti-hyperlipidemic effects. Life Sciences. 278, 119579 (2021).
  34. Huang, B., Bao, J., Cao, Y. R., Gao, H. F., Jin, Y. Cytochrome P450 1A1 (CYP1A1) catalyzes lipid peroxidation of oleic acid-induced HepG2 cells. Biochemistry. 83 (5), 595-602 (2018).
  35. Xia, H., et al. Alpha-naphthoflavone attenuates non-alcoholic fatty liver disease in oleic acid-treated HepG2 hepatocytes and in high fat diet-fed mice. Biomedicine & Pharmacotherapy. 118, 109287 (2019).
  36. Dai, Z., et al. Protective effects of α-galacto-oligosaccharides against a high-fat/western-style diet-induced metabolic abnormalities in mice. Food & Function. 10 (6), 3660-3670 (2019).
  37. Wang, X., et al. Salidroside, a phenyl ethanol glycoside from Rhodiola crenulata, orchestrates hypoxic mitochondrial dynamics homeostasis by stimulating Sirt1/p53/Drp1 signaling. J Ethnopharmacol. 293, 115278 (2022).
  38. Hou, Y., et al. Salidroside intensifies mitochondrial function of CoCl(2)-damaged HT22 cells by stimulating PI3K-AKT-MAPK signaling pathway. Phytomedicine. 109, 154568 (2023).
  39. Noor, F., et al. Network pharmacology approach for medicinal plants: review and assessment. Pharmaceuticals. 15 (5), 572 (2022).
  40. Li, X., et al. Role of potential bioactive metabolites from traditional Chinese medicine for type 2 diabetes mellitus: An overview. Front Pharmacol. 13, 1023713 (2022).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

194

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved