פלואורו-רספירומטריה ברזולוציה גבוהה של שרירי השלד של סוסים

Summary

לסוסים יש יכולת פעילות אירובית יוצאת דופן, מה שהופך את שרירי השלד של הסוסים לרקמה חשובה הן לחקר הפיזיולוגיה של פעילות גופנית של סוסים והן לפיזיולוגיה של המיטוכונדריה של יונקים. מאמר זה מתאר טכניקות להערכה מקיפה של תפקוד המיטוכונדריה בשרירי השלד של סוסים.

Abstract

תפקוד המיטוכונדריה - זרחן חמצוני ויצירת מיני חמצן תגובתי - הוא קריטי הן לבריאות והן למחלות. לפיכך, מדידת תפקוד המיטוכונדריה היא בסיסית במחקר ביו-רפואי. שרירי השלד הם מקור חזק למיטוכונדריה, במיוחד אצל בעלי חיים עם יכולת אירובית גבוהה מאוד, כגון סוסים, מה שהופך אותם לנושאים אידיאליים לחקר הפיזיולוגיה של המיטוכונדריה. מאמר זה מדגים את השימוש ברספירומטריה ברזולוציה גבוהה עם פלואורומטריה בו-זמנית, עם מיטוכונדריה של שרירי השלד שזה עתה נקטפו, כדי לכמת את היכולת לחמצן מצעים במצבים מיטוכונדריאליים שונים ולקבוע את היכולות היחסיות של אלמנטים שונים של נשימה מיטוכונדריאלית. טטרמתילרודאמין מתילאסטר משמש להדגמת ייצור פוטנציאל קרום מיטוכונדריאלי הנובע מחמצון המצע, כולל חישוב היעילות היחסית של המיטוכונדריה על ידי חישוב פוטנציאל הממברנה היחסי שנוצר ליחידת זרם חמצן בו-זמני. ההמרה של ADP ל-ATP גורמת לשינוי בריכוז המגנזיום בתא התגובה, עקב זיקות שונות של האדנילטים למגנזיום. לכן, מגנזיום ירוק יכול לשמש למדידת קצב סינתזת ATP, המאפשר חישוב נוסף של יעילות הזרחן החמצוני (היחס בין זרחן לחמצון [P/O]). לבסוף, השימוש ב- Amplex UltraRed, המייצר מוצר פלואורסצנטי (resorufin) בשילוב עם מי חמצן, מאפשר לכמת את ייצור מיני החמצן הריאקטיבי במהלך נשימה מיטוכונדריאלית, כמו גם את הקשר בין ייצור ROS לנשימה בו-זמנית. טכניקות אלה מאפשרות כימות חזק של הפיזיולוגיה המיטוכונדריאלית במגוון תנאים מדומים שונים, ובכך שופכות אור על תרומתו של מרכיב תאי קריטי זה לבריאות ולחולי כאחד.

Introduction

המיטוכונדריה של תאים איקריוטים מייצרים את רוב ה-ATP המשמש את התאים לעבודה ולתחזוקה¹. שלב מפתח בייצור המיטוכונדריה של ATP הוא המרת חמצן למים, ולכן היכולת המטבולית של המיטוכונדריה והתאים הקשורים אליה מכומתת לעתים קרובות באמצעות מדידת צריכת חמצן². עם זאת, הפיזיולוגיה של המיטוכונדריה מורכבת יותר מהתהליך הפשוט של צריכת חמצן, והסתמכות על נקודת קצה זו מספקת הערכה חלקית בלבד של ההשפעה של תפקוד מיטוכונדריאלי ותפקוד לקוי על בריאות התאים. אפיון מלא של תפקוד המיטוכונדריה דורש הערכה לא רק של צריכת חמצן, אלא גם של ייצור ATP כמו גם מיני חמצן תגובתי (ROS).

מדדים נוספים של תפקודי מיטוכונדריה מרכזיים יכולים להתבצע במקביל למדידת הנשימה באמצעות שימוש בפלואורופורים ספציפיים. טטרמתילרודאמין מתילאסטר (TMRM) הוא פלואורופור קטיוני המצטבר במטריצה המיטוכונדריאלית ביחס לפוטנציאל המתח הטרנסממברנה המיטוכונדריאלית, וכתוצאה מכך ירידה בעוצמת הפלואורסצנטיות עקב הצטברות זו³. TMRM יכול לשמש כאינדיקטור לשינויים יחסיים בפוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית, או שניתן להשתמש בו כדי לכמת שינויים מדויקים במתח הטרנסממברנה באמצעות ניסויים נוספים לקביעת קבועים המאפשרים המרה של האות הפלואורסצנטי ל-mV. מגנזיום ירוק (MgG) הוא פלואורופור שמפליא כאשר הוא קשור ל-Mg²⁺, ומשמש למדידות של סינתזת ATP בהתבסס על הזיקה הדיפרנציאלית של ADP ו-ATP לקטיון דו-ערכי^{של מגנזיום 4}. החוקרים חייבים לקבוע את קבועי הזיקה/דיסוציאציה הספציפיים (Kd) הן עבור ADP והן עבור ATP בתנאים אנליטיים ספציפיים כדי להמיר את השינויים בפלואורסצנטיות של MgG לשינוי בריכוז ה-ATP. Amplex UltraRed (AmR) הוא פלואורופור המשמש למדידת הייצור של מי חמצן ו- ROS אחרים במהלך נשימה מיטוכונדריאלית⁵. התגובה בין H 2 O₂לבין AmR (אשר מזורז על ידי חזרת peroxidase) מייצרת resorufin, אשר ניתן לזהות באמצעות פלואורסצנטיות ב 530 ננומטר. ניתן להוסיף כל אחת מהבדיקות הללו בנפרד לבדיקות של נשימה מיטוכונדריאלית בזמן אמת, כדי לספק מדידות מקבילות של ההיבטים המתאימים של הפיזיולוגיה של המיטוכונדריה, ובכך לספק קשר ישיר בין נשימה לתפוקה מיטוכונדריאלית.

סוסים מסוגלים לשיעורים גבוהים מאוד של צריכת חמצן ספציפית למסה, בין השאר בשל התוכן המיטוכונדריאלי הגבוה מאוד של שרירי השלד של סוסים, מה שהופך את הרקמה הזו לרלוונטית מאוד לחקר הפיזיולוגיה של המיטוכונדריה. עם הפיתוח של רספירומטריה ברזולוציה גבוהה, מחקרים המשתמשים בטכנולוגיה חדשנית זו סייעו להגדיר את תרומתם של מיטוכונדריית שרירי השלד של סוסים הן ליכולת האימון יוצאת הדופן של סוסים והן לפתופיזיולוגיה של מחלות שרירי השלד 6,7,8,9,10,11,12,13,14 . מחקרים על תפקוד מיטוכונדריאלי של שרירי השלד של סוסים הם יתרון מיוחד, שכן השגת כמויות גדולות של רקמה זו אינה סופנית. לפיכך, נבדקי סוסים יכולים לא רק לספק רקמה מספקת לאפיון מלא של תפקוד המיטוכונדריה, אלא גם לשמש בקרות אורך למחקרים איכותיים ומכניסטיים בפיזיולוגיה של המיטוכונדריה. מסיבה זו פותחו בדיקות נוספות לכימות פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית, סינתזת ATP וייצור ROS המשלימים את מדידת צריכת החמצן ברקמה זו, על מנת לספק אפיון חזק יותר של הפיזיולוגיה המיטוכונדריאלית בשרירי השלד של סוסים.

Protocol

מחקר זה אושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת אוקלהומה סטייט. במחקר זה נעשה שימוש בארבעה ג'לדינגים מסוג ת'ורוברד (17.5 ± 1.3 שנים, 593 ± 45 ק"ג) כדי להפיק את התוצאות המייצגות.

1. השגת דגימת ביופסיה של שריר השלד

1. יש להשיג ביופסיות שריר השלד (בטכניקה סטרילית) ממרכז שריר הסמיטנדינוסוס (או שריר מעניין אחר), באמצעות מחט ביופסיה 12 G University College Hospital (UCH) (ראה טבלת חומרים) תחת טשטוש קל, ושימוש בהרדמה מקומית בעקבות דו"ח^{שפורסם בעבר 11}.
2. העבר את דגימות הביופסיה באופן מיידי לבקבוקונים עם תמיסת מדיה להובלת ביופסיה קרה כקרח (2.77 mM CaK 2-EGTA, 7.23 mM K 2-EGTA, 20 mM imidazole, 20 mM טאורין, 50 mM K-MES, 0.5 mM dithiothreitol, 6.56 mM MgCl₂, 5.77 mM ATP ו- 15 mM phosphocreatine, מותאם ל- pH 7.1; ראה טבלת חומרים). הובלה למעבדה לניתוח.
   הערה: עיין ב- Doerrier et ^al.15 לקבלת הוראות ספציפיות להכנת אמצעי הובלת הביופסיה.
3. בודדו את המיטוכונדריה מדגימות הביופסיה באמצעות ערכה מסחרית, בהתאם להוראות היצרן (ראו טבלת חומרים). מאגר האחסון הסופי לא צריך להכיל מצעים כגון ADP, ATP וסוקצינאט, שהם חלק מבדיקת הרספירומטריה.
4. יש להשהות מחדש את הגלולה האחרונה של המיטוכונדריה המבודדת באמצעות 80 מיקרוליטר של חומר תרחיף (225 מילימול מניטול, 75 מ"מ סוכרוז ו-1 מ"מ EGTA; ראו טבלת חומרים) לכל 100 מ"ג שריר המשמש לבידוד מיטוכונדריה.
5. מזערו את המרווח מרגע הליך הביופסיה ועד לבידוד המיטוכונדריה, ושמרו על הדגימות בטמפרטורה של 0-4 מעלות צלזיוס לאורך כל שלבי העיבוד עד להוספה לרספירומטרים ברזולוציה גבוהה.
   הערה: מחקרים ראשוניים מצאו כי מתלים של מיטוכונדריה מבודדים מתחילים לאבד את היכולת התפקודית לאחר כשעתיים כאשר נשמרים ב 0-4 ° C.

2. הגדרת רספירומטר ברזולוציה גבוהה

1. ספירומטרים ברזולוציה גבוהה משמשים לכימות נשימה מיטוכונדריאלית ותהליכים נלווים. השתמש בתוכנית בקרת התוכנה שסופקה על-ידי היצרן (ראה רשימת חומרים) כדי לשלוט ברספירומטר, לכייל את החיישנים ולאסוף נתונים גולמיים. נתח את הדגימות בכפילות עבור כל תנאי בדיקה.
   הערה: בכל המקרים, הטיטרציות המומלצות וריכוזי המגיבים הסופיים המתוארים בפרוטוקול זה מבוססים על תא ספירומטריה של 2 מ"ל.
2. קבע את הרקע O 2 שטף ונקודת האפס של חיישן O 2 כל_2-4 שבועות באמצעות הטיטרציה הטורית של דיתיוניט, בהתאם להוראות היצרן. שמור על קבועי כיול אלה עבור הבדיקות הבאות עד שהכיול יחזור על עצמו.
   הערה: בניגוד להליכים שפורסמו בעבר באמצעות סיבי שריר חדירתיים^11,12,13,16, שבהם היפראוקסיה (250-500 מיקרומטר) נחוצה כדי למנוע הגבלת דיפוזיה של O 2 למיטוכונדריה^, ניתן להעריך מיטוכונדריה מבודדים באמצעות טווח של 50-200 מיקרומטר O ₂. ניתן להשיג זאת פשוט על ידי מתן אפשרות למדיית הנשימה להתאזן עם אוויר החדר לפני הוספת המתלה המיטוכונדריאלי (כלומר, לאחר כיול יומי של נקודה אחת). באופן דומה, חמצון מחדש של תא הנשימה יכול להתבצע פשוט על ידי פתיחת החדר עד שמספיק חמצן סביבתי מומס לתוך מדיה respirometry כדי להעלות את ריכוז החמצן לרמה הרצויה.
3. מלאו את תאי הרספירומטר בחומרי הדפסה נטולי מגנזיום (0.5 mM EGTA, 60 mM K-לקטוביונט, 20 mM טאורין, 10 mM KH₂PO₄, 20 mM HEPES, 110 mM סוכרוז ואלבומין בסרום בקר 1 גרם/ליטר [BSA] נטול חומצות שומן בעיקרו, מותאם ל-pH 7.1; ראו טבלת חומרים).
   הערה: עיין ב- Komlodi et ^al.17 לקבלת הוראות ספציפיות להכנת אמצעי הנשימה.
   1. הגדר את טמפרטורת הדגירה של המכשיר ל- 38 מעלות צלזיוס כדי לייצג את הטמפרטורה הבסיסית של שרירי השלד של סוסים, והגדר את הערבוב של אמצעי הנשימה ל- 800 סל"ד באמצעות מערבל מגנטי המסתובב בתחתית תא הרספירומטר.
   2. כבו את תאורת התא כדי למנוע הפרעה לחיישני פלורסנט.
   3. הפעל את אלקטרודת החמצן עם מתח קיטוב של 800 mV, והגבר את האות המתקבל עם הגדרת רווח של 1.
   4. רשום את ריכוז החמצן כל 2 שניות, חשב את שטף החמצן כשיפוע השלילי של מדידת החמצן במהלך 40 השניות הקודמות (20 נקודות נתונים), ודווח כ- pmol x ^s-1 x mL של תמיסת הדגירה.
4. כייל את חיישן החמצן בכך שהוא מאפשר למדיה להתאזן עם אוויר החדר. חישוב הלחץ החלקי של חמצן הייחוס, בהתבסס על לחץ ברומטרי שנמדד על ידי רספירומטר ברזולוציה גבוהה וריכוז חמצן אטמוספרי סטנדרטי.

3. מדידת פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית באמצעות TMRM

1. השתמש בחיישנים פלואורסצנטיים "ירוקים" (אורך גל דומיננטי של 530 ננומטר) כדי לכמת את האות הפלואורסצנטי מתא הנשימה. הפעל את החיישנים ב- 400-500 mV; האות המתקבל מוגבר עם רווח של 1:1,000.
   הערה: יש למטב הגדרות ספציפיות עבור מכשירים בודדים כדי ללכוד את האות הצפוי בטווח הליניארי של החיישן.
2. יש להוסיף TMRM (4 μL של תמיסת 1 mM לריכוז סופי של 2 μM; ראו טבלת חומרים) לפני הוספת מיטוכונדריה.
3. כייל את האות הפלואורסצנטי באמצעות כיול פשוט של אות פלואורסצנטי (מתח) בשתי נקודות לעומת כמות הפלואורופור (mM) שנוספה לפני הוספת המיטוכונדריה.
   הערה: השתמש בפונקציית כיול האות הפלואורסצנטי בתוכנת בקרת ההתקן כדי לכייל אות זה. האות הגולמי מהגשושית הפלואורסצנטית יכול לדרוש 30 דקות או יותר כדי להתייצב על מנת להקליט את הנקודה השנייה של הכיול.
4. בצע את הכיול הסופי של אות TMRM לאחר השלמת פרוטוקול הטיטרציה של הספירומטריה על-ידי העברת מספר טיטרציות של חומר uncoupling (קרבוניל ציאניד m-chlorophenyl hydrazone; 2 μL לכל טיטרציה) עד שלא נצפו עליות נוספות באות הפלואורסצנטי של TMRM, דבר המצביע על קריסה מוחלטת של פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית (איור 1).
   הערה: ערך אות פלואורסצנטי זה נחשב שווה לפוטנציאל טרנסממברנה של 0 mV, ומשמש כנקודת ייחוס לערכים פוטנציאליים יחסיים של הממברנה שנרשמו במהלך פרוטוקול הטיטרציה של הספירומטריה.

4. מדידת ייצור ATP באמצעות מגנזיום ירוק (MgG)

1. השתמש בחיישנים פלואורסצנטיים "כחולים" (אורך גל דומיננטי של 465 ננומטר) כדי לכמת את האות הפלואורסצנטי מתא הנשימה. הפעל חיישנים אלה עבור מכשירים בודדים כדי ללכוד את האות הצפוי בטווח הליניארי של החיישן.
2. בצע את ההתקנה הכימית והכיול של האות הפלואורסצנטי MgG לאחר הוספת המיטוכונדריה, אך לפני הוספת מצעים כלשהם. הוסף 8 μL של 2 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) לתא הספירומטריה לקטיוני כלאט (במיוחד Ca 2+) שיתחרה עם Mg²⁺ על קשירה ל- MgG, ולאחר מכן הוסף 4 μL של 1 mM MgG (1.1 μM) לתא הנשימה.
3. כייל את האות הפלואורסצנטי הגולמי עם טיטרציות רציפות של 10 x 2 μL של 100 mM MgCl 2, מה שמאפשר דקה אחת בין טיטרציות לייצוב האות הפלואורסצנטי (איור 2).
   הערה: תהליך זה, אשר הושלם במצב לא מקוון לאחר השלמת הבדיקה ובאמצעות תבניות שסופקו על ידי יצרן המכונה והתוכנה המשויכת, מייצר עקומה מסדר שני של ריכוז מגנזיום לאות פלואורסצנטי (צפוי r² > 0.98), אשר ישמש עם כמות ידועה של ADP נוסף לתא הספירומטריה ואת ערכי K_d שנקבעו בעבר כדי לקבוע את הריכוז המתאים של ATP¹¹.
4. קבעו את קצב סינתזת ה-ATP, שהוא שיפוע ריכוז ה-ATP לאורך זמן לאורך כל הפרוטוקול (איור 3).

5. מדידת ייצור מיטוכונדריאלי של ROS באמצעות Amplex UltraRed (AmR)

1. השתמש בחיישנים פלואורסצנטיים "ירוקים" (אורך גל דומיננטי של 530 ננומטר) כדי לכמת את האות הפלואורסצנטי מתא הנשימה. הפעל את החיישנים ב- 300-400 mV; האות המתקבל מוגבר עם רווח של 1:1,000. מטב הגדרות ספציפיות עבור מכשירים בודדים כדי ללכוד את האות הצפוי בטווח הליניארי של החיישן.
   הערה: אם משתמשים באמצעי נשימה ללא MgCl 2, יש להוסיף אותו (20-60 μL של 100 mM MgCl 2 כדי לייצר 1-3 μM MgCl₂) לפני הוספת ריאגנטים לבדיקת AmR.
2. בצע את ההתקנה הכימית והכיול הראשוני של בדיקת AmR לפני הוספת המיטוכונדריה. הוסף 30 μmoles של DTPA (6 μL של תמיסת 5 mM) לקטיוני כלאט שעלולים להפריע לתגובה, ולאחר מכן הוסף סופראוקסיד דיסמוטאז (2 μL של תמיסת מלאי 5,000 U/mL כדי להמיר אניונים סופראוקסיד ל- H 2 O₂לזיהוי מקיף יותר של ייצור חמצן תגובתי), חזרת peroxidase (5 μL של תמיסת מלאי 500 U/mL), ו-Amplex UltraRed (2 μL של תמיסת מלאי של 10 מילימטר) (ראה טבלת חומרים) לייצור 5 U/mL, 1 U/mL ו-10 μM בתא הספירומטריה, בהתאמה.
3. אפשרו לאות הפלואורסצנטי להתייצב, ולאחר מכן הוסיפו 0.2 מיקרומול של מי חמצן (5 מיקרוליטר של תמיסת 40 מיקרומטר המיוצרת טרי מדי יום) פעמיים, בהפרש של כ-5 דקות זו מזו.
   הערה: האות הפלואורסצנטי לפני ואחרי שני הטיטרציות של H 2 O 2 מספק עקומת כיול ליניארית בת שלוש נקודות של המערכת (צפוי r 2 > 0.95), שהשיפוע שלה משקף את התגובה הכוללת של המערכת בדיווח על הקשר בין האות הפלואורסצנטי לבין הייצור (או התוספת) של H 2 O ². השתמש בפונקציית כיול האות הפלואורסצנטי בתוכנת בקרת ההתקן כדי לכייל אות זה.
4. בצע כיולים דו-נקודתיים נוספים (5 μL של תמיסה של 40 מיקרומטר הנעשית טרייה מדי יום) במהלך הבדיקה, כדי לאפשר התאמה של תגובת הבדיקה כאשר הכימיה של הספירומטריה משתנה לאורך הבדיקה, כאשר העיתוי הספציפי של נקודות כיול אלה נתון לשיקול דעתו של החוקר (איור 4).

6. מדידת נשימה מיטוכונדריאלית

1. הוסף 15 μL של תרחיף מיטוכונדריה מבודד (שלב 1.4) לכל תא דגירה של 2 מ"ל, כך שהתוצאות מייצגות את התפוקה המיטוכונדריאלית של 18.75 מ"ג שריר. אוטמים את תא הדגירה. מערבול הדגימה בין כל טיטרציה כדי לשמור על השעיה אחידה של הדגימה.
2. מדוד את צריכת החמצן השיורית (ROX) לפני הוספת מצעים כלשהם. חסר ערך זה (בדרך כלל פחות מ- 0.2 pmol O₂ x s-1 x ^mL-1) מערכי צריכת החמצן של כל שלב בפרוטוקול טיטרציית המצע/uncoupler/inhibitor (SUIT)¹¹ לאחר השלמת הפרוטוקול.
   הערה: זה קריטי שהאותות הן מחיישן החמצן והן מחיישן הפלואורסצנטיות יורשו להתייצב למשך דקה אחת לפחות (כפי שמוערך על ידי השיפוע המחושב היציב של אותות החיישן הראשי), מכיוון שמצב הנשימה הכולל משתנה על ידי הטיטרציות על מנת להשיג תוצאות אמינות. הדבר חל על כל שלבי הטיטרציה.
3. השתמש בחליפה לשימוש כללי המאפשרת אפיון ראשוני של תפקוד מיטוכונדריה של שרירי השלד של סוסים. התחל עם טיטרציות רציפות של פירובט (5 μL של תמיסה מימית של 2 M), גלוטמט (10 μL של תמיסה מימית של 2 M) ומלאט (10 μL של תמיסה מימית של 0.4 M) (ראה טבלת חומרים) לתוך כל תא כדי לייצר ניקוטין-אמיד אדנין די-נוקלאוטיד (NADH) ולעורר נשימה לא-זרחנית (דליפה) הנתמכת על-ידי NADH מחומצן באמצעות קומפלקס I (L_N) (איור 1, איור 3, ואיור 4).
4. הוסף ADP (20 μL של תמיסה מימית של 500 mM; ראה טבלת חומרים) כדי לעורר נשימה זרחנית באמצעות קומפלקס I (P_N).
5. הוסף סוקצינאט (20 μL של תמיסה מימית של 1 M; ראה טבלת חומרים) כדי לייצר נשימה זרחנית באמצעות שילוב של קומפלקס I וקומפלקס II (P_N+S).
   הערה: עם שילוב של נשימה דרך קומפלקס I וקומפלקס II, צריכת החמצן עשויה להיות גבוהה מספיק כדי לצרוך את רוב החמצן המומס באמצעי הדגירה. אם ריכוז O 2 יורד מתחת ל-50 מיקרומטר, יש לחמצן מחדש את אמצעי הדגירה על ידי פתיחת תא הדגירה עד שריכוז O 2 הנמדד יעלה מעל 150 מיקרומטר. חזור על שלב זה לפי הצורך כדי לשמור על כמות מספקת של O₂ לנשימה מיטוכונדריאלית.
6. הוסף רוטנון (2 μL של תמיסת אתנול 0.1 mM; ראה טבלת חומרים) כדי לחסום קומפלקס I. שטף החמצן שנוצר מייצג את היכולת של קומפלקס II לתמוך בצריכת חמצן מיטוכונדריאלית באמצעות חמצון של סוקצינט בלבד (P_S).
   זהירות: רוטנון הוא חומר רעיל. יש להשתמש בבטיחות מעבדה סטנדרטית ולהימנע מבליעה או שאיפה.
7. חישוב הערך הממוצע עבור מצב ניסוי נתון על פני תאי ספירומטריה בודדים המכילים aliquots של ביופסיה אחת.
   הערה: חישובים נגזרים, כגון יחסי בקרת שטף (FCR), הם בעלי ערך בזיהוי שינויים יחסיים במסלולים שונים, וכוללים_דליפת FCR (L N/P N), FCR N (P _N/P N+S) ו- FCR S (P_S/P _N+S). יעילות מחושבת של זרחן חמצוני (1-L_N/P_N+S) מספקת הערכה של ההשפעה הכוללת של נשימה דולפת המותאמת לקיבולת הנשימה הכוללת.

תוצאות

מצב הייחוס המוצע הוא של ת'ורוברד יושבני בריא (ללא כושר מוגבר עקב פעילות גופנית כפויה) ודגימת שריר טרייה שנאספה ממרכז שריר יציבה, המכילה אחוז גבוה של סיבי שריר שלד עשירים במיטוכונדריה מסוג I ומודגרת בתנאים הקרובים לחילוף חומרים במנוחה (כלומר, 38 מעלות צלזיוס ו- pH 7.0). בתנאים אלה, החוקר יכול לצפו...

Discussion

הוספת אותות פלואורסצנטיים לפלט הסטנדרטי של הרספירומטר ברזולוציה גבוהה מספקת מידע רב ערך בנוגע לפיזיולוגיה של המיטוכונדריה, אך כיול קפדני של האות הפלואורסצנטי הוא קריטי לאיכות הנתונים. הפרוטוקולים המקוריים לשימוש ב-MgG מציעים כי עקומות הכיול שנוצרו בעת חישוב קבועי דיסוציאציה של מגנזיום-א...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
ADP	Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)	A5285
Amplex UltraRed	Life Technologies	A36006
ATP	Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)	A2383
BSA	Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)	A6003
Calcium carbonate	Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)	C4830
CCCP	Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)	C2759
DatLab 7.0	Oroboros Inc		Software to operate O2K fluororespirometer
Dithiothreitol	Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)	D0632
DTPA	Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)	D1133
EGTA	Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)	E4378
Glutamate	Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)	G1626
HEPES	Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)	H7523
Horseradish peroxidase	Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)	P8250
Hydrogen peroxide	Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)	516813	Must be made fresh daily prior to assay
Imidazole	Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)	I2399
K-MES	Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)	M8250
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)	M9272
Magnesium Green	Thermo Fisher Scientific	M3733
Malate	Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)	M1000
Mannitol	Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)	M9647
Mitochondrial isolation kit	Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)	MITOISO1
O2K fluororespirometer	Oroboros Inc		Multiple units required to run full spectrum of assays concurrently.
Phosphocreatine	Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)	P7936
Potassium hydroxide	Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)	P1767
Potassium lactobionate	Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)	L2398
Potassium phosphate	Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)	P0662
Pyruvate	Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)	P2256	Must be made fresh daily prior to assay
Rotenone	Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)	R8875
Succinate	Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)	S2378
Sucrose	Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)	84097
Superoxide dismutase	Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)	S8160
Taurine	Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)	T0625
Titration pump	Oroboros Inc
Titration syringes	Oroboros Inc
TMRM	Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)	T5428
UCH biopsy needle	Millenium Surgical Corp	72-238067	Available in a range of sizes