שימוש בריאגנטים ייחוס כדי לאשר את החוסן של מבחני שחרור ציטוקינים לחיזוי בטיחות נוגדנים חד-שבטיים

Summary

השימוש בריאגנטים ייחוס לבדיקת שחרור ציטוקינים מאפשר פרופילי בטיחות במבחנה הניתנים לשחזור וסטנדרטיים יותר של נוגדנים חד-שבטיים אימונותרפיים. כאן אנו מתארים כיצד ניתן להשתמש במבחני שחרור ציטוקינים לצד פאנל ריאגנטים ייחוס כדי לחזות את בטיחותם של כמה נוגדנים חד-שבטיים טיפוליים.

Abstract

תרופות נוגדנים חיסוניות חדשות שנועדו לעורר ישירות תאים חיסוניים ספציפיים או להגביר בעקיפין את התגובה החיסונית על ידי חסימה או הפעלה של מווסת אנדוגני של מערכת החיסון הן בעלות פוטנציאל לגרום לתופעות לוואי חמורות הקשורות למערכת החיסון כגון תסמונת שחרור ציטוקינים (CRS). לכן חיוני להעריך את פרופיל הבטיחות של תרופות כאלה בשילוב של ניסויים in vivo ו-in vitro לפני מתן מנה ראשונה בבני אדם. מבחני שחרור ציטוקינים (CRAs), שבהם הנוגדנים המוצעים מתורבתים יחד עם תאי חיסון אנושיים (כגון תאים חד-גרעיניים בדם היקפי (PBMCs), דם מלא או אחר) ונמדדת כמות הציטוקינים הדלקתיים המיוצרים, הם קריטיים לזיהוי סכנה. עם זאת, מעבדות שונות המשתמשות בנוגדני בקרה שונים עלולות לאיים על ההרמוניזציה של CRAs, ובקרות רלוונטיות מבחינה קלינית (כגון TGN1412) יכולות להיות קשות להשגה, מה שעלול להוביל לתוצאות או נתונים פחות מדויקים או אמינים שקשה להשוות בין מעבדות. הכללת בקרות חיוביות ושליליות ב-CRA יכולה להבטיח את הדיוק והאמינות של התוצאות. המכון הלאומי לתקנים ובקרה ביולוגיים (NIBSC) ייצר פאנל של בקרות נוגדנים ליופיליים המיועדים לשימוש בפלטפורמות CRA שונות כדי לתאם את התוצאות במעבדות שונות ובשיטות בדיקה. קבוצה של שלושה נוגדנים חיוביים שונים כוללת אנטי-CD52, אנטי-CD3 ואנטי-CD28 סופראגוניסט (SA), הידועים כגורמים ל-CRS תלוי מינון בחולים. לכל נוגדן מסופק נוגדן בקרה שלילי תואם איזוטיפ. פאנל זה של ריאגנטים ייחוס הוכח בעבר כבעל יכולת שחזור בין-מעבדתית טובה והם בקרות מתאימות להגברת הביטחון והחוסן של נתוני בטיחות ממגוון פלטפורמות CRA.

Introduction

שחרור ציטוקינים מושרה יכול להיות השפעה צפויה ורצויה של כמה נוגדנים חד-שבטיים אימונומודולטוריים (mAbs). עם זאת, שחרור בלתי צפוי של ציטוקינים פרו-דלקתיים יכול לגרום לתסמונת שחרור ציטוקינים (CRS) בחולים המאופיינים בחום, עייפות ואפילו אי ספיקת איברים מרובים¹. לכן חיוני ש-mAbs חדשים ייבדקו במבחנה על הפוטנציאל שלהם לגרום ל-CRS על ידי מדידת שחרור ציטוקינים במבחן שחרור ציטוקינים (CRA).

TGN1412 הוא נוגדן חד שבטי שפותח כטיפול פוטנציאלי ללוקמיה לימפוציטית כרונית של תאי B על ידי פעולה כסופר-אגוניסט CD28 (CD28SA), המסוגל להפעיל לימפוציטים מסוג T על ידי קישור צולב של הקולטן CD28². בשנת 2006, שישה מתנדבים בריאים שקיבלו TGN1412 בניסוי קליני חוו תופעות לוואי חמורות, כולל CRS, תוך שעות מקבלת התרופה¹. זה הוביל להפסקת הניסוי והוצאת TGN1412 מהמשך פיתוח. נוגדנים אחרים הידועים כגורמים ל-CRS כתופעת לוואי כוללים את האנטי-CD52 mAb, Campath-1H³, והאנטי-CD3 mAb, Muromonab (OKT3)⁴. בהתחשב ביכולתם לגרום ל-CRS תלוי מינון בחולים, TGN1412, OKT3 ו-Campath-1H הם נוגדני בקרה חיוביים מתאימים ליצירת תוצאות חזקות ואמינות מ-CRA. עם זאת, נוגדנים אלה לא היו ניתנים להשגה בקלות בעבר בגלל עלויות גבוהות או זמינות מוגבלת.

עם זאת, פאנל ייחוס ליופילי מחודש של שלושת הנוגדנים^{הללו 5,6,7} לצד בקרות שליליות תואמות איזוטיפ הפך לאחרונה לזמין על ידי המכון הלאומי לתקנים ובקרה ביולוגיים (NIBSC). פאנל זה של ריאגנטים ייחוס הוכח בעבר כבעל יכולת שחזור בין-מעבדתית טובה⁸ ולכן הוא בקרה מתאימה להגברת הביטחון והחוסן של נתוני בטיחות ממגוון פלטפורמות CRA. לפיכך, הרציונל מאחורי השימוש בפרוטוקול זה לצד ריאגנטים אלה הוא לשפר את ההרמוניזציה של CRA, כאשר היתרון של ריאגנטים אלה אושר במחקר שיתופי בינלאומי⁸.

כאן אנו מתארים כיצד להשתמש בצורה הטובה ביותר בפאנל זה של ריאגנטים ייחוס ב-CRA של PBMC בשלב מוצק (SP) וב-CRA של דם מלא (WB) בשלב מימי (AQ) כדי לחזות CRS המושרה על ידי נוגדנים. שני פורמטי ה-CRA הללו משלימים בשל אופן הצגת הנוגדנים (עקיף לשלב המוצק לעומת ישיר לשלב הימי) ובשל העובדה שהם מכוונים לקבוצות שונות של תאי מגיבים. ניתן להתאים את אותו פרוטוקול לשימוש עם דם מלא מדולל (dWB) או עם אנדותל: תרביות PBMC.

Protocol

הפרוטוקול הבא עוקב אחר ההנחיות של ועדת האתיקה של המחקר NIBSC. בהתאם לתקנות ולהנחיות החלות, קבל הסכמה מדעת בכתב של תורם בריא או מטופלים. השתמש בטכניקות סטריליות כדי לבצע את כל שלבי ההכנה של הפרוטוקול במכסה המנוע של תרבית תאים בזרימה למינרית. ראה טבלת חומרים לפרטים על כל הריאגנטים והציוד.

1. הכנת צלחות מצופות עם mAb לבדיקת שלב מוצק (SP)

1. הרכיבו מחדש את תכולת אמפולות המגיב הייחוס עם 1 מ"ל מים מזוקקים סטריליים. אפשר 5-10 דקות להתייבשות לפני ערבוב תמיסת הנוגדנים והעברתו לצינור מכוסה סטרילי.
2. לאחר בנייה מחדש ב-1 מ"ל מים, ריכוז המלאי של הנוגדנים הרקומביננטיים הבאים יהיה 200 מיקרוגרם/מ"ל: אנטי-CD3 (15/162), אנטי-CD52 (15/178), בקרת איזוטיפ IgG1K (15/198) עבור אנטי-CD52, בקרת איזוטיפ IgG2a (15/218) עבור אנטי-CD3, בקרת איזוטיפ IgG4 (15/232) עבור אנטי-CD28SA.
3. לאחר בנייה מחדש ב-1 מ"ל מים, ריכוז המלאי של אנטי-CD28SA (15/144) יהיה 100 מיקרוגרם/מ"ל. לאחסון לטווח קצר עד 7 ימים, העבירו את החומר המחודש בצינור מכוסה סטרילי ל -4 מעלות צלזיוס.
4. לדלל את הנוגדנים המשוחזרים ולבדוק את הנוגדנים ל-10 מיקרוגרם/מ"ל ב-PBS סטרילי ולצפות את הבארות של צלחת מיקרוטיטר סטרילית שאינה מטופלת ב-U-bottom עם 100 מיקרוליטר של תמיסת נוגדנים מדוללת (1 מיקרוגרם/באר) ולדגור למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס.
   הערה: חשוב להשתמש בלוחות פוליפרופילן לספיגת חלבון, שכן אלה שימשו לאימות הריאגנטים הסטנדרטיים⁹.

2. הכנת PBMCs

1. אסוף לפחות 30 מ"ל של דם מלא היקפי (WB) לתוך צינורות המכילים הפרין/הפרין והפוך מספר פעמים כדי להבטיח תערובת נכונה עם נתרן הפרין.
2. העברת 15 מ"ל של WB בצינור נפרד לשימוש מאוחר יותר בהכנת בדיקת דם מלא בשלב מימי (שלב 3.1)
3. יש לדלל את 15 מ"ל הדם הנותרים ביחס נפח של 1:1 עם PBS או מדיה RPMI-1640 נטולת סרום ולשכב בעדינות את הדם המדולל על גבי 15 מ"ל של מדיום שיפוע צפיפות (למשל, לימפופרפ, Ficoll-Hypaque) בשפופרת של 50 מ"ל.
4. צנטריפוגה של הצינור ב-500 x גרם למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר ברוטור מתנדנד החוצה ללא בלם ועם תאוצה מופחתת להפרדת הדם למרכיביו השונים.
5. לאחר הצנטריפוגה, שיפוע הצפיפות ייפרד כשכבה עליונה של פלזמה ואחריה שכבה דקה של מעיל באפי המכילה PBMCs ושכבה תחתונה המכילה תאי דם אדומים (RBCs) וגרנולוציטים פולימורפו-גרעיניים כולל נויטרופילים ואאוזינופילים. קצרו בזהירות את ה-PBMCs על ידי החדרת פיפטה ישירות דרך שכבת הפלזמה העליונה ל-PBMCs. לחלופין, הסר את השכבה העליונה לפני איסוף התאים.
6. השהה בעדינות את שכבת האפי ב-10 מ"ל של PBS או מדיה RPMI-1640 ללא סרום. צנטריפוגה את הצינור שוב ב-500 x גרם למשך 10 דקות כדי לגלול את התאים. הסר את הסופרנטנט והשליך אותו.
7. חזור על שלב הכביסה 2.6. ולהשעות את הגלולה ב-2 מ"ל של RPMI עם 10% FCS (RPMI-1640 מלא, cRPMI)
8. ספירת תאים באמצעות המוציטומטר¹⁰.
9. התאם PBMCs לריכוז של 1 x 10⁶ תאים/מ"ל ב-cRPMI.

3. הכנת בדיקת שחרור ציטוקינים בשלב מימי (AQ) בדם מלא (WB)

1. הוסף 190 מיקרוליטר WB לבארות של צלחת פוליסטירן תחתונה U של 96 בארות. אם עדיין לא ב-100 מיקרוגרם/מ"ל, יש לדלל מראש את כל הנוגדנים לטיפול וריאגנטים ל-100 מיקרוגרם/מ"ל ב-PBS.
2. הוסף 10 מיקרוליטר של נוגדנים מדוללים ל-190 מיקרוליטר של WB כדי לתת ריכוז נוגדנים סופי של 5 מיקרוגרם/מ"ל נוגדן ב-95% WB.
3. דגירה של צלחת למשך 48 שעות בחממה לחה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.

4. הכנת בדיקת שחרור ציטוקינים PBMC בשלב מוצק (SP)

1. בעזרת פיפטה רב-ערוצית הסר והשליך את תמיסת הנוגדנים מהצלחות המצופות (המתואר בשלב 1), מלא מאגר ריאגנטים ב-PBS ושטוף את הצלחת פי 3 עם 200 מיקרוליטר PBS כדי להסיר mAbs לא קשורים.
2. הוסף 200 מיקרוליטר של תרחיף התאים משלב 2.8 לכל באר. דגרו את הצלחת למשך 48 שעות בחממה לחה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂.

5. איסוף סופרנטנט או פלזמה

1. לאחר הדגירה למשך 48 שעות עם mAbs בקרה ובדיקה, צלחות צנטריפוגה ב-400 x גרם למשך 5 דקות ואוספות את המדיום או הפלזמה הממוזגים בתא, תוך הקפדה לא להפריע לגלולת התא. הקפיאו את הסופרנטנט או הפלזמה שנאספו בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
   הערה: הקפד לא להפריע לכדור כדוריות הדם האדומות בעת איסוף הפלזמה.

6. ביצוע כימות של ציטוקינים בסופרנטנט או בפלזמה

1. באמצעות הסופרנטנט או הפלזמה שנאספו, בצע ניתוח ציטוקינים של ריכוזי IFN-γ, IL-2, TNF-α ו-IL-6 באמצעות אפשרות המולטיפלקס המועדפת. שיטה לדוגמה לניתוח ציטוקינים מרובים באמצעות בדיקת חרוז ציטומטרי פורסמה בעבר¹¹.
   הערה: אנא עיין בטבלת החומרים עבור ערכת המולטיפלקס ששימשה ביצירת התוצאות המייצגות.

תוצאות

תוצאות בדיקת ה-SP אמורות להדגים שחרור של IL-2, IFN-γ, IL-6 ו-TNF-α¹² בטווח pg/mL מכל נוגדני הבקרה החיוביים לאחר 48 שעות וצריכות להיות גדולות יותר באופן מובהק סטטיסטית מבקרות איזוטיפ תואמות. התוצאות המייצגות שלנו מדגימות כי נוגדני הבקרה החיוביים, αCD28, αCD3 ו-αCD28SA גורמים לרמות גבוהות משמעותית של IFN-γ , IL-6 ו-TNF-α בהשוואה לבקרות איזוטיפ תואמות, כאשר הם מופעלים במבחן PBMC SP (איור 1). בדיקה זו מאופיינת גם בשינוי קיפול גבוה של שחרור IL-2 מגירוי עם αCD28SA בהשוואה לאיזוטיפ התואם שלו (859.0). בעוד ש-αCD3 ו-αCD52, למרות שהם עדיין גורמים לביטוי IL-2, גורמים לשינויי קיפול נמוכים יותר מאשר αCD28SA (6.2 ו-3.3 עבור αCD3 ו-αCD52, בהתאמה, איור 2).

בבדיקת WB AQ (איור 3), רמת הציטוקינים הניתנים לזיהוי נמוכה באופן ניכר מאשר בבדיקת PBMC SP אך מאופיינת ברגישות גדולה יותר לגירוי על ידי נוגדן αCD52 (איור 2 ואיור 3) עם שינויי קיפול ממוצעים של IL-2, IFN-γ ו-IL-6 מעל 100.

נוגדן בדיקה שעבורו ניתן לצפות כי מינון עתידי ראשון בבני אדם לא יגרום לעלייה משמעותית בלתי צפויה בשחרור ציטוקינים בהשוואה לבקרות איזוטיפ רלוונטיות. אם כי, במקום לעצור את הפיתוח של mAb טיפולי חדש, יש לשקול תוצאה חיובית ב-CRA כחלק מניהול הסיכון/תועלת¹³. בעת פיתוח פלטפורמת CRA חדשה, יש לחזור על הבדיקה באמצעות קבוצה שונה של תורמים כדי להבטיח שחזור של הפלטפורמה. יש לתת חשיבות גם לשונות התגובה בין התורמים¹⁴, ולכן מומלץ ניסוי חזק^{היטב 15}. על מנת להבין את רוחב התגובות ולקבל ייצוג מלא של השונות שניתן לראות בתגובות התורם, יש לבצע את הבדיקה באופן אידיאלי עם מספר תורמים בודדים בנוסף לבדיקת הטיפול בניסויי שכפול.

איור 1: שחרור ציטוקינים מניסוי PBMC-SP. תוצאות מייצגות של שחרור IFN-γ, IL-2, IL-6 ו-TNF-α שהתקבלו ממבחני שחרור ציטוקינים PBMC-SP (3 ניסויים עצמאיים שכל אחד מהם מכיל 5-8 תורמים לניסוי; n=8, n=10, n=5 [מלמעלה למטה]) לאחר 48 שעות בעת שימוש בנוגדני ריאגנט ייחוס. קיצורים: PBMC = תאים חד-גרעיניים בדם היקפי; SP = שלב מוצק; IFN-γ = אינטרפרון-גמא; IL-2 = אינטרלוקין 2; IL-6 = אינטרלוקין 6; TNF-α = גורם נמק גידול אלפא. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: עלייה בשינוי קיפול הציטוקינים מניסויי PBMC-SP ו-WB-AQ. שינוי קיפול של שחרור IFN-γ, IL-2, IL-6 ו-TNF-α של ריאגנטים ייחוס נוגדנים מעוררי CRS ביחס לבקרות האיזוטיפ התואמות שלהם, המתקבלות ממבחני שחרור ציטוקינים PBMC-SP ו-WB-AQ לאחר 48 שעות. קיצורים: PBMC = תאים חד-גרעיניים בדם היקפי; SP = שלב מוצק; WB = דם מלא; AQ = מימי (פאזה); IFN-γ = אינטרפרון-גמא; IL-2 = אינטרלוקין 2; IL-6 = אינטרלוקין 6; TNF-α = גורם נמק גידול אלפא; CRS = תסמונת שחרור ציטוקינים. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: שחרור ציטוקינים מניסוי WB-AQ. תוצאות מייצגות של שחרור IFN-γ, IL-2, IL-6 ו-TNF-α שהתקבלו ממבחני שחרור ציטוקינים WB-AQ (3 ניסויים עצמאיים שכל אחד מהם מכיל 5-8 תורמים לניסוי; n=8, n=10, n=5 [מלמעלה למטה]) לאחר 48 שעות בעת שימוש בנוגדנים ריאגנטים ייחוס. קיצורים: WB = דם מלא; AQ = מימי (פאזה); IFN-γ = אינטרפרון-גמא; IL-2 = אינטרלוקין 2; IL-6 = אינטרלוקין 6; TNF-α = גורם נמק גידול אלפא. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

מתוארות כאן שיטות למדידת שחרור ציטוקינים מ-PBMCs ו-WB לאחר גירוי בתיווך נוגדנים מצלחת מצופה נוגדנים או עם נוגדן בתמיסה, באמצעות פאנל של ריאגנטים ייחוס לבקרה חיובית ושלילית. לכל אחת מהבדיקות הללו יש חוזקות וחולשות משלה. מבחני PBMC ו-WB משלימים מכיוון ששיעור התאים החיסוניים השונים כגון לימפוציטים, מונוציטים וגרנולוציטים שונה בשתי מטריצות הניסוי המשמשות ל-CRAs. מעניין לראות שלמרות שבדיקת WB עשויה לייצג טוב יותר את המצב in vivo בניגוד למונוקולטורה PBMC, הפלטפורמה הקודמת פחות מנבאת את הסיכון ל-CRS בתיווך תאי T מ-TGN1412 ו-OKT3¹⁵; תוצאה של גליקופורין A על RBCs המעכב התרחבות תאי T בתיווך IL-2¹⁶. עם זאת, חיזוי הסיכון ל-CRS מאנטי-CD52 נותר על כנו ב-WB CRA, עקב נוכחותם של נויטרופילים (שאבדו במהלך שיטות שיפוע צפיפות קונבנציונליות המתוארות בשלב 2, המשמשות לבידוד PBMC).

הפורמט של ה-CRA (מצגת SP או AQ) הוא קריטי לזיהוי מנגנון ספציפי של CRS. לדוגמה, הצגת פאזה מימית של ה-mAb ללימפוציטים אנושיים^17,18, שהופעלה במהלך בדיקות בטיחות פרה-קליניות במבחנה של TGN1412 לא הצליחה לזהות סיכון CRS ככל הנראה עקב היעדר אשכולות ומעורבות של קולטני תאים מקומיים¹⁹ וכתוצאה מכך הפעלת תאי T בתיווך נוגדנים בשלב מימי. למעשה, ניתן היה לזהות במדויק CRS בתיווך TGN1412 רק בפורמט SP המשכפל באופן מלאכותי קישור צולב של קולטן Fc-gamma (FcγR), כפי שמוצג כאן, או על ידי תחול תלוי מגע בתרבית PBMC בצפיפות גבוהה ואינטראקציה של Fc עם תאי חיסון CD32+ (כגון תאי B²⁰ ומונוציטים²¹).

בנוסף לפלטפורמות אלו, ישנן דרכים אחרות לבצע CRA עם מערכות קו-תרבותיות מורכבות יותר. דוגמה ל-CRA חלופי לאלה המתוארים בשיטות אלה היא תרבית משותפת של PBMCs עם תאי אנדותל צמיחת דם אוטולוגיים (BOECs)²². בדיקה זו תוארה ב-2015 כשיפור לבדיקת HUVEC:PBMC הקונבנציונלית של תורם מעורב על ידי הסרת אי ההתאמה המבלבלת של הרקמות. הוא מפגין רגישות טובה יותר ל-anti-CD28SA CRS מאשר מבחן WB, וגם מתגבר על המגבלה של בדיקת המונוקולטורה PBMC על ידי חיקוי השילוב של תאי אנדותל ולויקוציטים הקיימים in vivo, אך במחיר של שלבים פרוצדורליים ארוכים יותר הדורשים טכניקות תרבית תאים מיוחדות²².

יתר על כן, בעוד שפרוטוקול זה מתמקד באופן ספציפי בשחרור IFN-γ, IL-2, IL-6 ו-TNF-α, עמיתים ב-MHRA בחנו בעבר את IL-12 ואחרים במסגרת זו²³. ייצור IL-12 מוגבר על ידי נוגדני CRS חיוביים אלה, אם כי הוא אינו רגיש במיוחד, ולכן אולי אינו מנבא טוב ל-CRS בשיטה זו. ציטוקינים, כגון IL-15 בין היתר, מעולם לא נבדקו למרות ש-4 הציטוקינים שהוערכו בפרוטוקול שלנו מספקים אינדיקציה טובה לסיכון פוטנציאלי ל-CRS. כמובן, בהתאם לשיטה ולנוגדנים שנבדקו ניתן להעריך ציטוקינים אחרים.

ביחד, תצפיות אלה מדגישות את החשיבות של ציון שלמרות שהשימוש בריאגנטים ייחוס יכול לסייע בזיהוי סיכון CRS לנוגדנים חדשים, יש לנקוט בזהירות כדי להימנע מפלטפורמת CRA לא אופטימלית שעלולה להיכשל בזיהוי פוטנציאל CRS. באופן מכריע, מנגנון הפעולה החזוי של תרופה, בין אם באמצעות אזור ה-Fc שלו או פעולתו המשוערת על תאים המבטאים אנטיגן, חייב להתאים לביולוגיה של הבדיקה. לכן, בעוד שהבדלים במנגנון הפעולה של ריאגנטים טיפוליים וייחוס לבדיקה שנדונו במאמר זה עשויים להוות מגבלה פוטנציאלית באופן ש-CRA רלוונטי לנוגדני הבדיקה עשוי להיות לא תואם לביולוגיה של ריאגנטים הייחוס, הבדיקה מספקת פלטפורמה חזקה ואמינה לזיהוי סכנות. עם זאת, תוצאות ממספר פורמטים של CRA המכסים מנגנוני פעולה שונים ותת-קבוצות של תאים חיסוניים עשויות להיות נחוצות לביטחון אופטימלי בנתוני הערכת הבטיחות.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 ml  Microcentrifuge Tubes, Natural (Sterile)	Starlab	S1615-5510
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated	ThermoFisher	10500064
Heparinized tubes	ThermoFisher	12967676
Heracell 150i CO2 Incubator	ThermoFisher	16406639
MESO QuickPlex SQ 120 Human Proinflammatory Panel 1 V-PLEX kit	Meso Scale Discovery	K15049
MESO QuickPlex SQ 120MM	Meso Scale Discovery	AI1AA-0
Neubauer Improved Haemocytometer Counting Chamber	Hawksley	AS1000
Panel of lyophilized recombinant antibody controls for Cytokine Release Assays	NISBC	19/156
PBS	ThermoFisher	10010023
Polypropylene 96-well microtiter plate	Corning	3879
Polystyrene 96-well microtiter plate	Corning	3799
RPMI 1640	ThermoFisher	11875093
Sorvall ST 40 Centrifuge	ThermoFisher	75004525
Sterile water	ThermoFisher	15230162