הדמיית מיקרו-CT וניתוח מורפומטרי של מוחות יילודים בעכברים

Summary

מחקר זה מתאר את השלבים להשגת תמונות ברזולוציה גבוהה של מוחות עכבר בילודים על ידי שילוב טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת (micro-CT) וסוכן ניגוד בדגימות ex vivo . אנו מתארים ניתוחים מורפומטריים בסיסיים כדי לכמת את גודל המוח וצורתו בתמונות אלה.

Abstract

תמונות מוחיות הן כלי רב ערך לחקר מורפולוגיה של המוח בניסויים באמצעות מודלים של בעלי חיים. דימות תהודה מגנטית (MRI) הפך לשיטה הסטנדרטית עבור רקמות רכות, אם כי הרזולוציה המרחבית הנמוכה שלה מציבה מגבלות מסוימות עבור בעלי חיים קטנים. במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול לקבלת מידע תלת-ממדי (תלת-ממדי) ברזולוציה גבוהה על מוחות וגולגולות של עכברים באמצעות טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת (micro-CT). הפרוטוקול כולל את השלבים הדרושים כדי לנתח את הדגימות, להכתים ולסרוק את המוח, ולקבל מדידות מורפומטריות של כל האיבר ואזורי העניין (ROIs). ניתוח תמונה כולל פילוח מבנים ודיגיטציה של קואורדינטות נקודתיות. לסיכום, עבודה זו מראה כי השילוב של מיקרו-CT והפתרון של לוגול כחומר ניגוד הוא חלופה מתאימה להדמיית מוחות פרינטליים של בעלי חיים קטנים. לתהליך הדמיה זה יש יישומים בביולוגיה התפתחותית, ביו-רפואה ומדעים אחרים המעוניינים להעריך את ההשפעה של גורמים גנטיים וסביבתיים מגוונים על התפתחות המוח.

Introduction

הדמיית טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת (micro-CT) היא כלי רב ערך לתחומי מחקר שונים. בביולוגיה, הוא מתאים במיוחד לחקר העצם בגלל ספיגת קרני רנטגן ברקמות מינרליות. בשל תכונה זו, שאלות מגוונות לגבי התפתחות עצם¹, מטבוליזם², ואבולוציה ^3,4, בין נושאים אחרים, ניגשו בעזרת micro-CT. בשנת 2008, de Crespigny et ^al.5 הראו כי ניתן להשיג תמונות מיקרו-CT של מוחות עכברים וארנבים בוגרים באמצעות יוד כחומר ניגוד. עבודה זו פתחה יישום חדש לטכניקת הדמיה זו, שכן יוד איפשר רכישת תמונות מרקמות רכות שאחרת לא היו רגישות לקרני רנטגן. לפיכך, המטרה הכללית ....

Protocol

כל הליכי הניסוי פעלו בהתאם להנחיות המועצה הקנדית לטיפול בבעלי חיים.

1. איסוף דוגמאות והכנתן

1. הכינו 500 מ"ל של 4% פרפורמלדהיד (PFA).
   1. תחת שטף מיצוי בארון, הוסף 20 גרם של אבקת PFA ל 250 מ"ל של 1x פוספט חוצץ מלוחים (PBS) בכד זכוכית 1 L. מניחים את הכד עם מגנט על צלחת ערבוב מגנטית.
   2. יש לערבב תוך כדי חימום. עם מדחום, כל הזמן לבדוק את הטמפרטורה של הפתרון כדי לשמור אותו מתחת 60 ° C.
   3. עם פיפטה פסטר פלסטיק, להוסיף טיפות של 1 M NaOH לתמיסה כדי להמיס את PFA. לאחר שאבקת PFA התמוססה לחלוטין, קררו את התמיסה בטמפרטורת החדר (RT).
   4. כוונן את עוצמת הקול ל- 500 מ"ל עם PBS אחד. כוונן את ה- pH ל- 7.2-7....

תוצאות

כאן מוצג פרוטוקול בסיסי לקבלת תמונות ברזולוציה גבוהה של מוחות עכבר בילודים. הראשים נסרקו לאחר טבילה בתמיסה של לוגול. למרות גודלם הקטן, ניתן להבחין בין המבנים האנטומיים העיקריים במוח, כמו פקעות הריח, קליפת המוח, המוח האמצעי, המוח הקטן והמוח האחורי (איור 1).

נית?.......

Discussion

בעבודה זו מוצג פרוטוקול תמציתי לסריקת רקמות מוח יילודים של עכברים באמצעות מיקרו-CT עם חומר ניגוד. בנוסף, הוא כולל נהלים פשוטים להשגת תפוקות כמותיות ואיכותיות. בהתבסס על שיטות אלה, ניתן לבצע ניתוחים חלופיים או משלימים נוספים.

כפי שמוצג בפרוטוקול, ניתן לנתח תמונות מיקרו-CT בדרכ?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
µCT 35	Scanco Medical AG		Note that Scanco does not offer the  µCT 35 anymore. Their smallest scanner is now the  µCT 45
Avizo	Visualization Sciences Group, VSG
C57BL/6 Mice	Bioterio Facultad de Ciencias Veterinarias Universidad Nacional de La Plata
Conical tubes	Daigger	CH-CI4610-1856
Flux cabinet	Esco	AC2-458
Glass beaker	Glassco	GL-229.202.10
Glass bottle	Simax	CFB017
Glass funnel	HDA	VI1108
HCl	Carlo Erba	403872	Manipulate under a flux cabinet and use personal protective equipment (mask, glass and gloves)
I2	Cicarelli	804211	When preparing I2KI, manipulate under a flux cabinet and use personal protective equipment (mask, glass and gloves)
KI	Cicarelli	PA131542.1210	When preparing I2KI, manipulate under a flux cabinet and use personal protective equipment (mask, glass and gloves)
Magnetic stirring	Arcano	4925
NaOH	Cicarelli	1580110	Manipulate under a flux cabinet and use personal protective equipment (mask, glass and gloves)
Orbital shaker	Biomint	BM021
Paraformaldehyde	Biopack	2000959400	Manipulate under a flux cabinet and use personal protective equipment (mask, glass and gloves)
Paton spatula	Glassco	GL-377.303.01
PBS	Biopack	2000988800
Plastic Pasteur pipette	Daigger	9153
R	R Project		The package geomorph for R was used in the protocol (https://cran.r-project.org/web/packages/geomorph/index.html)
Scissors	Belmed
Sodium azide	Biopack	2000163500
Thermometer	Daigger	7650