A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
במסמך זה, אנו מדגימים פרוטוקול מותאם BODIPY 493/503 מבוסס פלואורסצנטיות לאפיון טיפות שומנים ברקמת הכבד. באמצעות שימוש בהקרנות אורתוגונליות ושחזורים תלת-ממדיים, הפלואורופור מאפשר הבחנה מוצלחת בין סטאטוזיס מיקרו-שלפוחית וסטאטוזיס מקרו-שלפוחית ועשוי לייצג גישה משלימה לפרוטוקולים ההיסטולוגיים הקלאסיים להערכת סטאטוזיס בכבד.
טיפות שומנים (LDs) הן אברונים מיוחדים המתווכים אחסון שומנים וממלאים תפקיד חשוב מאוד בדיכוי רעילות ליפוטוקסית ובמניעת תפקוד לקוי הנגרם על ידי חומצות שומן חופשיות (FAs). הכבד, בהתחשב בתפקידו הקריטי בחילוף החומרים של השומן בגוף, מאוים באופן מתמשך על ידי הצטברות תוך תאית של LDs בצורה של סטאטוזיס כבד microvesicular ו macrovesicular. האפיון ההיסטולוגי של LDs מבוסס בדרך כלל על צבעי דיאזו מסיסים בשומנים, כגון צביעת שמן אדום O (ORO), אך מספר חסרונות מעכבים באופן עקבי את השימוש בניתוח זה עם דגימות כבד. לאחרונה, פלואורופורים ליפופיליים 493/503 הפכו פופולריים להדמיה ואיתור LDs בשל קליטתם המהירה והצטברותם בליבת טיפת השומנים הניטרלית. למרות שרוב היישומים מתוארים היטב בתרביות תאים, יש פחות ראיות המוכיחות את השימוש האמין בבדיקות פלואורופור ליפופיליות ככלי הדמיה LD בדגימות רקמות. בזאת, אנו מציעים פרוטוקול אופטימלי מבוסס בורון דיפירומתין (BODIPY) 493/503 להערכת LDs בדגימות כבד ממודל בעלי חיים של סטאטוזיס כבד המושרה על ידי דיאטה עתירת שומן (HFD). פרוטוקול זה מכסה הכנת דגימות כבד, חתך רקמות, צביעת BODIPY 493/503, רכישת תמונה וניתוח נתונים. אנו מדגימים מספר מוגבר, עוצמה, יחס שטח וקוטר של LDs בכבד בעת הזנת HFD. באמצעות הקרנות אורתוגונליות ושחזורים תלת-ממדיים, ניתן היה לצפות בתוכן המלא של שומנים ניטרליים בליבת LD, שהופיעו כטיפות כמעט כדוריות. יתר על כן, עם פלואורופור BODIPY 493/503, הצלחנו להבחין בין microvesicles (1 מיקרומטר < d ≤ 3 מיקרומטר), שלפוחיות ביניים (3 מיקרומטר < d ≤ 9 מיקרומטר) ו macrovesicles (d > 9 מיקרומטר), המאפשר הבחנה מוצלחת של סטאטוזיס microvesicular ו macrovesicular. בסך הכל, פרוטוקול BODIPY 493/503 מבוסס פלואורסצנטיות זה הוא כלי אמין ופשוט לאפיון LD בכבד ועשוי לייצג גישה משלימה לפרוטוקולים ההיסטולוגיים הקלאסיים.
טיפות ליפידים (LDs), הנתפסות באופן קלאסי כמחסני אנרגיה, הן אברונים תאיים מיוחדים המתווכים אחסון שומנים, והן מהוות ליבת שומנים הידרופובית ניטרלית, המכילה בעיקר אסטרי כולסטרול וטריגליצרידים (TGs), עטופים בשכבה אחת פוספוליפידית 1,2,3.
ביוגנזה של LD מתרחשת ברשתית האנדופלסמית (ER), החל בסינתזה של טריאצילגליצרול (TAG) ואסטרי סטרול. שומנים ניטרליים מפוזרים בין העלעלים של השכבה הדו-שכבתית של חדר המיון בריכוזים נמוכים, אך מתמזגים לעדשות שמן שגדלות ונובטות לטיפות כמעט כדוריות מממברנת המיון כאשר הריכוז התוך-תאי שלהם עולה4. לאחר מכן, חל....
כל ההליכים בבעלי חיים שבוצעו במחקר זה אושרו על ידי מכון קוימברה למחקר קליני וביו-רפואי (iCBR) הגוף לרווחת בעלי חיים (ORBEA, #9/2018) ועמדו בהנחיות הלאומיות והאירופיות לטיפול בבעלי חיים ובהנחיות ARRIVE.
1. תכנון ניסיוני
הביצוע המוצלח של טכניקה זו אמור לגרום לצביעת טיפות שומנים ברורות לצורך אפיון סימולטני של מורפולוגיית LD (צורה וצפיפות ליבת שומנים בהתבסס על שחזור תלת-ממדי) יחד עם הפיזור המרחבי שלהם, מספר לשטח כולל וגודל ממוצע (מוערך עם הצינור המתואר לעיל, איור 1).
פרוטוקול BODIPY 493/503 מבוסס פלואורסצנטיות להערכת LD נועד לפתח גישת הדמיה חדשה להערכת סטאטוזיס בכבד. בהתחשב בקורלציה החזקה בין השמנת יתר למחלת כבד שומני, הדיאטה עתירת השומן בסגנון מערבי שימשה לביסוס מודל חייתי של סטאטוזיס כבד26. עלייה חזקה בתכולת TG בכבד אושרה על ידי ערכת בדיקה כמותי.......
למחברים אין מה לחשוף.
מחקר זה מומן על ידי קרנות לאומיות ואירופיות באמצעות קרן המדע והטכנולוגיה הפורטוגזית (FCT), הקרן האירופית לפיתוח אזורי (FEDER) ו- Programa Operacional Factores de Competitividade (COMPETE): 2020.09481.BD, UIDP/04539/2020 (CIBB) ו- POCI-01-0145-FEDER-007440. המחברים רוצים להודות על התמיכה של iLAB - Microscopy and Bioimaging Lab, מתקן של הפקולטה לרפואה של אוניברסיטת קוימברה וחבר בתשתית הלאומית PPBI-Portuguese Platform of BioImaging (POCI-01-0145-FEDER-022122), כמו גם תמיכה של FSE CENTRO-04-3559-FSE-000142.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
1.6 mm I.D. silicone tubing, I.V mini drip set | Fisher Scientific | ||
4,4-difluoro-1,3,5,7,8-pentametil-4-bora-3a,4a-diaza-s-indaceno (BODIPY 493/503) | Sigma-Aldrich, Lyon, France | D3922 | |
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Molecular Probes Inc, Invitrogen, Eugene, OR | D1306 | |
70% ethanol | Honeywell | 10191455 | |
Adobe Illustrator CC | Adobe Inc. | Used to design the figures | |
Automatic analyzer Hitachi 717 | Roche Diagnostics Inc., Mannheim, Germany | 8177-30-0010 | |
Barrier pen (Liquid blocker super pap pen) | Daido Sangyo Co., Ltd, Japon | _ | |
Blade | Leica | 221052145 | Used in the cryostat |
Cell Profiler version 4.2.5 | https://cellprofiler.org/releases/ | Used to analyse the acquired images | |
Coverslips | Menzel-Glaser, Germany | _ | |
Cryomolds | Tissue-Tek | _ | |
Cryostat (including specimen disc and heat extractor) CM3050 S | Leica Biosystems | _ | |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich, Lyon, France | D-8418 | Used to dissolve Bodipy for the 5 mg/mL stock solution. CAUTION: Toxic and flammable. Vapors may cause irritation. Manipulate in a fume hood. Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves, protective eye goggles. |
Dry ice container (styrofoam cooler) | Novolab | A26742 | |
Dumont forceps | Fine Science Tools, Germany | 11295-10 | |
Glass Petri dish (H 25 mm, ø 150 mm) | Thermo Scientific | 150318 | Used to weigh the liver after dissection |
Glycergel | DAKO Omnis | S303023 | |
GraphPad Prism software, version 9.3.1 | GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA | ||
High-fat diet | Envigo, Barcelona, Spain | MD.08811 | |
Ketamine (Nimatek 100 mg/mL) | Dechra | 791/01/14DFVPT | Used at a final concentration of 75 mg/kg |
Laser scanning confocal microscope (QUASAR detection unit; ) | Carl Zeiss, germany | LSM 710 Axio Observer Z1 microscope | |
Medetomidine (Sedator 1 mg/mL) | Dechra | 1838 ESP / 020/01/07RFVPT | Used at a final concentration of 1 mg/kg |
Needle | BD microlance | 300635 | |
No 15 Sterile carbon steel scalpel Blade | Swann-Morton | 205 | |
Objectives 10x (Plan-Neofluar 10x/0.3), 20x (Plan-Apochromat 20x/0.8) and 40x (Plan-Neofluar 40x/1.30 Oil) | Carl Zeiss, Germany | ||
Paint brushes | Van Bleiswijck Amazon B07W7KJQ2X | Used to handle cryosections | |
Peristaltic pump (Minipuls 3) | Gilson | 1004170 | |
Phosphate-buffered saline (PBS, pH ~ 7.4) | Sigma-Aldrich, Lyon, France | P3813 | |
Scalpel handle, 125 mm (5"), No. 3 | Swann-Morton | 0208 | |
Slide staining system StainTray | Simport Scientific | M920 | |
Standard diet | Mucedola | 4RF21 | |
Superfrost Plus microscope slides | Menzel-Glaser, Germany | J1800AMNZ | |
Tissue-Tek OCT mounting media | VWR CHEMICALS | 361603E | |
Triglycerides colorimetric assay kit | Cayman Chemical | 10010303 | |
Ultrasonic bath | Bandelin Sonorex | TK 52 | |
Vannas spring scissors - 3 mm cutting edge | Fine Science Tools, Germany | 15000-00 | |
ZEN Black software | Zeiss |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionExplore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved