ניתוח טיפות שומנים מוכתמות פלואורסצנטיות עם שחזור תלת ממדי להערכת סטאטוזיס בכבד

Summary

במסמך זה, אנו מדגימים פרוטוקול מותאם BODIPY 493/503 מבוסס פלואורסצנטיות לאפיון טיפות שומנים ברקמת הכבד. באמצעות שימוש בהקרנות אורתוגונליות ושחזורים תלת-ממדיים, הפלואורופור מאפשר הבחנה מוצלחת בין סטאטוזיס מיקרו-שלפוחית וסטאטוזיס מקרו-שלפוחית ועשוי לייצג גישה משלימה לפרוטוקולים ההיסטולוגיים הקלאסיים להערכת סטאטוזיס בכבד.

Abstract

טיפות שומנים (LDs) הן אברונים מיוחדים המתווכים אחסון שומנים וממלאים תפקיד חשוב מאוד בדיכוי רעילות ליפוטוקסית ובמניעת תפקוד לקוי הנגרם על ידי חומצות שומן חופשיות (FAs). הכבד, בהתחשב בתפקידו הקריטי בחילוף החומרים של השומן בגוף, מאוים באופן מתמשך על ידי הצטברות תוך תאית של LDs בצורה של סטאטוזיס כבד microvesicular ו macrovesicular. האפיון ההיסטולוגי של LDs מבוסס בדרך כלל על צבעי דיאזו מסיסים בשומנים, כגון צביעת שמן אדום O (ORO), אך מספר חסרונות מעכבים באופן עקבי את השימוש בניתוח זה עם דגימות כבד. לאחרונה, פלואורופורים ליפופיליים 493/503 הפכו פופולריים להדמיה ואיתור LDs בשל קליטתם המהירה והצטברותם בליבת טיפת השומנים הניטרלית. למרות שרוב היישומים מתוארים היטב בתרביות תאים, יש פחות ראיות המוכיחות את השימוש האמין בבדיקות פלואורופור ליפופיליות ככלי הדמיה LD בדגימות רקמות. בזאת, אנו מציעים פרוטוקול אופטימלי מבוסס בורון דיפירומתין (BODIPY) 493/503 להערכת LDs בדגימות כבד ממודל בעלי חיים של סטאטוזיס כבד המושרה על ידי דיאטה עתירת שומן (HFD). פרוטוקול זה מכסה הכנת דגימות כבד, חתך רקמות, צביעת BODIPY 493/503, רכישת תמונה וניתוח נתונים. אנו מדגימים מספר מוגבר, עוצמה, יחס שטח וקוטר של LDs בכבד בעת הזנת HFD. באמצעות הקרנות אורתוגונליות ושחזורים תלת-ממדיים, ניתן היה לצפות בתוכן המלא של שומנים ניטרליים בליבת LD, שהופיעו כטיפות כמעט כדוריות. יתר על כן, עם פלואורופור BODIPY 493/503, הצלחנו להבחין בין microvesicles (1 מיקרומטר < d ≤ 3 מיקרומטר), שלפוחיות ביניים (3 מיקרומטר < d ≤ 9 מיקרומטר) ו macrovesicles (d > 9 מיקרומטר), המאפשר הבחנה מוצלחת של סטאטוזיס microvesicular ו macrovesicular. בסך הכל, פרוטוקול BODIPY 493/503 מבוסס פלואורסצנטיות זה הוא כלי אמין ופשוט לאפיון LD בכבד ועשוי לייצג גישה משלימה לפרוטוקולים ההיסטולוגיים הקלאסיים.

Introduction

טיפות ליפידים (LDs), הנתפסות באופן קלאסי כמחסני אנרגיה, הן אברונים תאיים מיוחדים המתווכים אחסון שומנים, והן מהוות ליבת שומנים הידרופובית ניטרלית, המכילה בעיקר אסטרי כולסטרול וטריגליצרידים (TGs), עטופים בשכבה אחת פוספוליפידית ^1,2,3.

ביוגנזה של LD מתרחשת ברשתית האנדופלסמית (ER), החל בסינתזה של טריאצילגליצרול (TAG) ואסטרי סטרול. שומנים ניטרליים מפוזרים בין העלעלים של השכבה הדו-שכבתית של חדר המיון בריכוזים נמוכים, אך מתמזגים לעדשות שמן שגדלות ונובטות לטיפות כמעט כדוריות מממברנת המיון כאשר הריכוז התוך-תאי שלהם עולה⁴. לאחר מכן, חל....

Protocol

כל ההליכים בבעלי חיים שבוצעו במחקר זה אושרו על ידי מכון קוימברה למחקר קליני וביו-רפואי (iCBR) הגוף לרווחת בעלי חיים (ORBEA, #9/2018) ועמדו בהנחיות הלאומיות והאירופיות לטיפול בבעלי חיים ובהנחיות ARRIVE.

1. תכנון ניסיוני

1. זוג חולדות וויסטאר זכרים בני 13 שבועות בכלובים מאווררים בתנאים סביבתיים מבוקרים של טמפרטורה (22 מעלות צלזיוס ± 1 מעלות צלזיוס), לחות (50%-60%) ואור (מחזור אור-חושך של 12 שעות) ועם גישה למי ברז וצ'או מכרסמים סטנדרטי.
2. לאחר תקופה של שבועיים של התאקלמות, הקצו את החולדות באופן שרירותי לשתי קבוצות.
3. האכילו את קבוצת הביקורת (CTRL, n = 6) ואת קבוצות הדיאטה עתירות השומן (HFD, n = ....

תוצאות

הביצוע המוצלח של טכניקה זו אמור לגרום לצביעת טיפות שומנים ברורות לצורך אפיון סימולטני של מורפולוגיית LD (צורה וצפיפות ליבת שומנים בהתבסס על שחזור תלת-ממדי) יחד עם הפיזור המרחבי שלהם, מספר לשטח כולל וגודל ממוצע (מוערך עם הצינור המתואר לעיל, איור 1).

Discussion

פרוטוקול BODIPY 493/503 מבוסס פלואורסצנטיות להערכת LD נועד לפתח גישת הדמיה חדשה להערכת סטאטוזיס בכבד. בהתחשב בקורלציה החזקה בין השמנת יתר למחלת כבד שומני, הדיאטה עתירת השומן בסגנון מערבי שימשה לביסוס מודל חייתי של סטאטוזיס כבד²⁶. עלייה חזקה בתכולת TG בכבד אושרה על ידי ערכת בדיקה כמותי.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.6 mm I.D. silicone tubing, I.V mini drip set	Fisher Scientific
4,4-difluoro-1,3,5,7,8-pentametil-4-bora-3a,4a-diaza-s-indaceno (BODIPY 493/503)	Sigma-Aldrich, Lyon, France	D3922
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Molecular Probes Inc, Invitrogen, Eugene, OR	D1306
70% ethanol	Honeywell	10191455
Adobe Illustrator CC	Adobe Inc.	Used to design the figures
Automatic analyzer Hitachi 717	Roche Diagnostics Inc., Mannheim, Germany	8177-30-0010
Barrier pen (Liquid blocker super pap pen)	Daido Sangyo Co., Ltd, Japon	_
Blade	Leica	221052145	Used in the cryostat
Cell Profiler version 4.2.5	https://cellprofiler.org/releases/	Used to analyse the acquired images
Coverslips	Menzel-Glaser, Germany	_
Cryomolds	Tissue-Tek	_
Cryostat (including specimen disc and heat extractor) CM3050 S	Leica Biosystems	_
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich, Lyon, France	D-8418	Used to dissolve Bodipy for the 5 mg/mL stock solution. CAUTION: Toxic and flammable. Vapors may cause irritation. Manipulate in a fume hood. Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves, protective eye goggles.
Dry ice container (styrofoam cooler)	Novolab	A26742
Dumont forceps	Fine Science Tools, Germany	11295-10
Glass Petri dish (H 25 mm, ø 150 mm)	Thermo Scientific	150318	Used to weigh the liver after dissection
Glycergel	DAKO Omnis	S303023
GraphPad Prism software, version 9.3.1	GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA
High-fat diet	Envigo, Barcelona, Spain	MD.08811
Ketamine (Nimatek  100 mg/mL)	Dechra	791/01/14DFVPT	Used at a final concentration of 75 mg/kg
Laser scanning confocal microscope  (QUASAR detection unit; )	Carl Zeiss, germany	LSM 710 Axio Observer Z1 microscope
Medetomidine (Sedator 1 mg/mL)	Dechra	1838 ESP / 020/01/07RFVPT	Used at a final concentration of 1 mg/kg
Needle	BD microlance	300635
No 15 Sterile carbon steel scalpel Blade	Swann-Morton	205
Objectives 10x (Plan-Neofluar 10x/0.3), 20x (Plan-Apochromat 20x/0.8) and 40x (Plan-Neofluar 40x/1.30 Oil)	Carl Zeiss, Germany
Paint brushes	Van Bleiswijck Amazon B07W7KJQ2X	Used to handle cryosections
Peristaltic pump (Minipuls 3)	Gilson	1004170
Phosphate-buffered saline (PBS, pH ~ 7.4)	Sigma-Aldrich, Lyon, France	P3813
Scalpel handle, 125 mm (5"), No. 3	Swann-Morton	0208
Slide staining system StainTray	Simport Scientific	M920
Standard diet	Mucedola	4RF21
Superfrost Plus microscope slides	Menzel-Glaser, Germany	J1800AMNZ
Tissue-Tek OCT mounting media	VWR CHEMICALS	361603E
Triglycerides colorimetric assay kit	Cayman Chemical	10010303
Ultrasonic bath	Bandelin Sonorex	TK 52
Vannas spring scissors - 3 mm cutting edge	Fine Science Tools, Germany	15000-00
ZEN Black software	Zeiss