A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

מתנול יכול לשמש כמדיום עזר קבוע עבור תכשירים ברשתית שלמות הר אחסון לטווח ארוך, אשר שימושי לחקירה של תאי גנגליון ברשתית.

Abstract

תאי גנגליון ברשתית (RGCs), שהם נוירוני ההקרנה של הרשתית, מפיצים מידע חזותי חיצוני למוח. לשינויים פתולוגיים ב- RGCs יש קשר הדוק עם מחלות ניווניות רבות ברשתית. Whole-mount retinal immunostaining משמש לעתים קרובות במחקרים ניסיוניים על RGCs כדי להעריך את התנאים ההתפתחותיים והפתולוגיים של הרשתית. בנסיבות מסוימות, ייתכן שיהיה צורך לשמור כמה דגימות רשתית יקרות ערך, כגון אלה מעכברים טרנסגניים, לתקופה ארוכה מבלי להשפיע על המורפולוגיה או על מספר RGCs. לקבלת תוצאות ניסוי אמינות וניתנות לשחזור, שימוש במדיום שימור יעיל הוא חיוני. כאן, אנו מתארים את ההשפעה של מתנול כאמצעי עזר קבוע עבור תכשירים רשתית מלאה ואחסון לטווח ארוך. בקצרה, במהלך תהליך הבידוד, מתנול קר (-20 ° C) הוא pipeted על פני השטח של הרשתית כדי לעזור לתקן את הרקמות ולהקל על החדירות שלהם, ולאחר מכן הרשתית ניתן לאחסן מתנול קר (-20 ° C) לפני להיות immunostained. פרוטוקול זה מתאר את זרימת העבודה של בידוד הרשתית ואת פרוטוקול אחסון דגימות הרקמות, שהוא שימושי ומעשי לחקירת RGCs.

Introduction

תאי גנגליון ברשתית (RGCs) הם נוירוני ההקרנה היחידים ברשתית, והם משתלבים ומעבירים מידע חזותי חיצוני למוח1. מחלות נוירודגנרטיביות רבות כגון גלאוקומה ונוירופתיה אופטית טראומטית מאופיינות בנזק בלתי הפיך ואובדן RGCs 2,3. ניתוח השינויים המורפולוגיים והכמותיים של RGCs הוא צעד מכריע בקביעת האופן שבו מחלות נוירודגנרטיביות מתפתחות ומתקדמות 4,5.

בדיקת אימונופלואורסנציה עקיפה היא שיטה מקובלת לניטור התפלגות החלבונים וספירת התאים. במעבדה, אימונוסטיין רשתית מלאה משמש בדרך כלל במחקרים ניסיוניים על RGCs כדי להעריך את ....

Protocol

כל השלבים מבוצעים בטמפרטורת החדר, אלא אם צוין אחרת. כל עכברי C57BL/6J שנעשה בהם שימוש התקבלו ממרכז חיות המעבדה של אוניברסיטת ווהאן, וכל הניסויים הקשורים אושרו על ידי הוועדה לאתיקה של ניסויים בבעלי חיים באוניברסיטת ווהאן. כל המאמצים נעשו כדי למזער את סבלם של העכברים.

1. חינוך וקיבוע העיניים

  1. הרדימו את העכברים בחנק פחמן דו חמצני, והפעילו את גלגל העין בעדינות באמצעות פינצטה חסרת שיניים.
  2. יש לשטוף את גלגל העין פעם אחת במי מלח חוצצים פוספט (PBS).
  3. נקבו את גלגל העין עם מחט מזרק בקרנית תחת מיקרוסקופ (עינית WF: 10x/22; יעד הגדלה רציפה: 0.67x-4.5x) כדי להאיץ את הקיבוע לתוך גלגל העין ולשפר את יעילות הקיבוע.....

תוצאות

לאחר נתיחה, הרשתית צריכה להיראות כמו תלתן שטוח בעל ארבעה עלים. במחקר זה, על-ידי שימוש בפרוטוקול שתואר לעיל, הרשתית הפכה לבנה לאחר הוספת מתנול (איור 1). בינתיים, הרשתית השתנתה מרכה לגמישה ושטוחה. לאחר מכן, RGCs היו מסומנים עם anti-RBPMS8. ארבעה שדות תמונה צולמו ברשתית כולה.......

Discussion

קיבוע הוא צעד חיוני לשימור הרשתית, אשר יכול להשפיע על כל חקירות RGC הבאות המבוססות על מורפולוגיה. קיבוע מוצלח לוכד במהירות את המבנה והמצב של הרשתיות ברגע חשיפתן למדיום הקיבוע, שהוא קריטי לניתוח נוסף. למרות שפורמלדהיד נחשב לאחד מסוכני הקיבוע הנפוצים ביותר לקיבוע ושימור רקמות ותאים, פורמלדהי.......

Disclosures

המחברים אינם מודעים להשתייכות, חברות, מימון או אחזקות פיננסיות שעשויים להשפיע על האובייקטיביות של מחקר זה.

Acknowledgements

עבודה זו מומנה על ידי פרויקט פתיחת מעבדות מפתח חוביי (מענק מס '2021KFY055), הקרן למדעי הטבע של מחוז חוביי (מענק מס '2020CFB240), וקרנות מחקר בסיסיות עבור האוניברסיטאות המרכזיות (מענק מס '2042020kf0065).

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
24-well cell culture clusterCostarEyeball fixation
24-well hemagglutination plateLabedit CompanyIncubation antibody
Adhesion microscope slidesCitotestOr similar
Anti-fluorescent quenching mountantServicebioG1401Slow down fluorescence quenching
BSA (bovine serum albumin)ServicebioGC305010Blocking reagent
Confocal microscopeOLYMPUSApply 40x objective lens
Curved scissorsJiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd.Dissecting tools
Dissecting microscopeRWD Life science Co.,LTD 77001SDissecting tools
ForcepsJiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd.Dissecting tools
MethanolSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.20210624GC≥99.5%
Nail polishSecheViteSealing agent
Needles Shanghai Kindly Enterprises Development Group Co., Ltd.Accelerate the fixation
Paraformaldehyde solutionServicebioG1101Eyeball fixation
PBS (phosphate buffered saline pH 7.4)ServicebioG0002Rinse the eyeball 
Primary antibody: guinea pig anti-RNA-binding protein with multiple splicing (RBPMS)PhosphoSolutionsCat. #1832-RBPMSFor immunofluorescence. Used at 1:400
Secondary antibody: Cy3 affiniPure donkey anti-guinea pig IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch706-165-148For immunofluorescence. Used at 1:400
Straight scissorsJiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd.Dissecting tools

References

  1. Sanes, J. R., Masland, R. H. The types of retinal ganglion cells: Current status and implications for neuronal classification. Annual Review of Neuroscience. 38, 221-246 (2015).
  2. Almasieh, M., Wilson, A. M., Morquette, B., Cueva Vargas, J. L., Di Polo, A.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

194

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved