A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
מתנול יכול לשמש כמדיום עזר קבוע עבור תכשירים ברשתית שלמות הר אחסון לטווח ארוך, אשר שימושי לחקירה של תאי גנגליון ברשתית.
תאי גנגליון ברשתית (RGCs), שהם נוירוני ההקרנה של הרשתית, מפיצים מידע חזותי חיצוני למוח. לשינויים פתולוגיים ב- RGCs יש קשר הדוק עם מחלות ניווניות רבות ברשתית. Whole-mount retinal immunostaining משמש לעתים קרובות במחקרים ניסיוניים על RGCs כדי להעריך את התנאים ההתפתחותיים והפתולוגיים של הרשתית. בנסיבות מסוימות, ייתכן שיהיה צורך לשמור כמה דגימות רשתית יקרות ערך, כגון אלה מעכברים טרנסגניים, לתקופה ארוכה מבלי להשפיע על המורפולוגיה או על מספר RGCs. לקבלת תוצאות ניסוי אמינות וניתנות לשחזור, שימוש במדיום שימור יעיל הוא חיוני. כאן, אנו מתארים את ההשפעה של מתנול כאמצעי עזר קבוע עבור תכשירים רשתית מלאה ואחסון לטווח ארוך. בקצרה, במהלך תהליך הבידוד, מתנול קר (-20 ° C) הוא pipeted על פני השטח של הרשתית כדי לעזור לתקן את הרקמות ולהקל על החדירות שלהם, ולאחר מכן הרשתית ניתן לאחסן מתנול קר (-20 ° C) לפני להיות immunostained. פרוטוקול זה מתאר את זרימת העבודה של בידוד הרשתית ואת פרוטוקול אחסון דגימות הרקמות, שהוא שימושי ומעשי לחקירת RGCs.
תאי גנגליון ברשתית (RGCs) הם נוירוני ההקרנה היחידים ברשתית, והם משתלבים ומעבירים מידע חזותי חיצוני למוח1. מחלות נוירודגנרטיביות רבות כגון גלאוקומה ונוירופתיה אופטית טראומטית מאופיינות בנזק בלתי הפיך ואובדן RGCs 2,3. ניתוח השינויים המורפולוגיים והכמותיים של RGCs הוא צעד מכריע בקביעת האופן שבו מחלות נוירודגנרטיביות מתפתחות ומתקדמות 4,5.
בדיקת אימונופלואורסנציה עקיפה היא שיטה מקובלת לניטור התפלגות החלבונים וספירת התאים. במעבדה, אימונוסטיין רשתית מלאה משמש בדרך כלל במחקרים ניסיוניים על RGCs כדי להעריך את ....
כל השלבים מבוצעים בטמפרטורת החדר, אלא אם צוין אחרת. כל עכברי C57BL/6J שנעשה בהם שימוש התקבלו ממרכז חיות המעבדה של אוניברסיטת ווהאן, וכל הניסויים הקשורים אושרו על ידי הוועדה לאתיקה של ניסויים בבעלי חיים באוניברסיטת ווהאן. כל המאמצים נעשו כדי למזער את סבלם של העכברים.
1. חינוך וקיבוע העיניים
לאחר נתיחה, הרשתית צריכה להיראות כמו תלתן שטוח בעל ארבעה עלים. במחקר זה, על-ידי שימוש בפרוטוקול שתואר לעיל, הרשתית הפכה לבנה לאחר הוספת מתנול (איור 1). בינתיים, הרשתית השתנתה מרכה לגמישה ושטוחה. לאחר מכן, RGCs היו מסומנים עם anti-RBPMS8. ארבעה שדות תמונה צולמו ברשתית כולה.......
קיבוע הוא צעד חיוני לשימור הרשתית, אשר יכול להשפיע על כל חקירות RGC הבאות המבוססות על מורפולוגיה. קיבוע מוצלח לוכד במהירות את המבנה והמצב של הרשתיות ברגע חשיפתן למדיום הקיבוע, שהוא קריטי לניתוח נוסף. למרות שפורמלדהיד נחשב לאחד מסוכני הקיבוע הנפוצים ביותר לקיבוע ושימור רקמות ותאים, פורמלדהי.......
המחברים אינם מודעים להשתייכות, חברות, מימון או אחזקות פיננסיות שעשויים להשפיע על האובייקטיביות של מחקר זה.
עבודה זו מומנה על ידי פרויקט פתיחת מעבדות מפתח חוביי (מענק מס '2021KFY055), הקרן למדעי הטבע של מחוז חוביי (מענק מס '2020CFB240), וקרנות מחקר בסיסיות עבור האוניברסיטאות המרכזיות (מענק מס '2042020kf0065).
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
24-well cell culture cluster | Costar | Eyeball fixation | |
24-well hemagglutination plate | Labedit Company | Incubation antibody | |
Adhesion microscope slides | Citotest | Or similar | |
Anti-fluorescent quenching mountant | Servicebio | G1401 | Slow down fluorescence quenching |
BSA (bovine serum albumin) | Servicebio | GC305010 | Blocking reagent |
Confocal microscope | OLYMPUS | Apply 40x objective lens | |
Curved scissors | Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd. | Dissecting tools | |
Dissecting microscope | RWD Life science Co.,LTD | 77001S | Dissecting tools |
Forceps | Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd. | Dissecting tools | |
Methanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 20210624 | GC≥99.5% |
Nail polish | SecheVite | Sealing agent | |
Needles | Shanghai Kindly Enterprises Development Group Co., Ltd. | Accelerate the fixation | |
Paraformaldehyde solution | Servicebio | G1101 | Eyeball fixation |
PBS (phosphate buffered saline pH 7.4) | Servicebio | G0002 | Rinse the eyeball |
Primary antibody: guinea pig anti-RNA-binding protein with multiple splicing (RBPMS) | PhosphoSolutions | Cat. #1832-RBPMS | For immunofluorescence. Used at 1:400 |
Secondary antibody: Cy3 affiniPure donkey anti-guinea pig IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 706-165-148 | For immunofluorescence. Used at 1:400 |
Straight scissors | Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd. | Dissecting tools |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionExplore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved