הליך עבור עכבר שורש גבי גנגליון Cryosectioning

Summary

מוצג כאן הפיתוח לרכישה עקבית של קטעי קריוסטט גנגליון שורש גבי באיכות גבוהה.

Abstract

קטעי קריוסטט איכותיים של גנגליון שורש גבי של עכבר (DRG) חיוניים לצביעת אימונוכימיה נכונה ולמחקרי RNAscope בחקר כאב דלקתי ונוירופתי, גירוד, כמו גם מצבים נוירולוגיים היקפיים אחרים. עם זאת, זה עדיין אתגר להשיג באופן עקבי קטעי קריוסטט איכותיים, שלמים ושטוחים על שקופיות זכוכית בגלל גודל הדגימה הזעיר של רקמת DRG. עד כה, אין מאמר המתאר פרוטוקול אופטימלי עבור קריוסקציה DRG. פרוטוקול זה מציג שיטה שלב אחר שלב לפתרון הקשיים הנפוצים הקשורים להקפאת DRG. המאמר המוצג מסביר כיצד להסיר את הנוזל שמסביב מדגימות רקמת DRG, למקם את קטעי DRG על השקופית הפונים לאותו כיוון, ולשטח את החלקים במגלשת הזכוכית מבלי להתעקל כלפי מעלה. למרות פרוטוקול זה פותח עבור cryosectioning דגימות DRG, זה יכול להיות מיושם עבור cryosectioning של רקמות רבות אחרות עם גודל מדגם קטן.

Introduction

גנגליון השורש הגבי (DRG) מכיל את נוירוני החישה הראשוניים, את המקרופאגים הרקמתיים, ואת תאי הלוויין המקיפים את נוירוני החישה הראשוניים 1,2,3,4. זהו מבנה אנטומי מרכזי בעיבוד אותות מזיקים ומזיקים, וממלא תפקידים קריטיים בכאב, גירוד והפרעות עצביות היקפיות שונות 5,6,7,8,9,10,11,12,13.....

Protocol

עבור המחקר הנוכחי, הניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של UCSF ונערכו בהתאם למדריך NIH לטיפול ושימוש בחיות מעבדה. עכברים בוגרים בני 8-12 שבועות C57BL/6 זכרים ונקבות (גזע ביתי) שימשו כאן.

1. הכנת מדגם DRG

1. מרדימים את העכברים עם 2.5% אברטין (ראו טבלת חומרים). להבטיח הרדמה נאותה על ידי חוסר תגובה לגירוי כואב. יש לערבב את בעלי החיים באופן טרנסקרדילי עם 1x מלוחים חוצצי פוספט (PBS) ואחריו 4% פורמלדהיד, כפי שתואר קודם לכן^14,15,16.
2. לנתח רקמת DRG מחוט השדרה, כפי שתואר ....

תוצאות

המחקר הנוכחי אסף כ -16 קטעי DRG רציפים ואיכותיים מעכבר אחד L4 DRG. הקטעים שהתקבלו היו ללא כל עיוות. איור 1 מתאר את ההליך שלב אחר שלב עבור ההקפאה. סילוק נוזלים עודפים מחלקי הרקמה מוצג באיור 2. תהליך הטמעת OCT של הרקמות מודגש באיור 3. איור 4

Discussion

פרוטוקול זה מספק הליך קל שלב אחר שלב עבור חתך קריוסטט של DRG העכבר כדי להשיג קטעי DRG באיכות גבוהה על שקופיות בצורה אמינה. ישנם ארבעה שלבים קריטיים בפרוטוקול זה. ראשית, דגימת DRG והפינצטה חייבות להיות יבשות לפני העברת דגימת DRG לבסיס OCT. כל נוזל המקיף את דגימת DRG ייצור קליפת קרח סביבה, וכתוצאה מכך ק.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Avertin	Sigma-Aldrich	T48402-25G	Anesthetize animal
Epredia Cryotome Cryostat Cryocassettes, 25 mm dia. Crosshatched	Fisherbrand	1910	Hold the OCT section at the bottom
Ergo Tweezers	Fisherbrand	S95310	Using the end of a tweezer to gently touch the bottom (6 o’clock) of the section so that it sticks to the platform surface to prevent the section from curving back in a roll
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides	Fisherbrand	1255015	To collect the DRG section
Marking pens	Fisherbrand	133794	Mark the orientation of base OCT
Scigen Tissue-Plus O.C.T. Compound	Fisherbrand	23730571	Embedding medium for frozen tissue specimens to ensure optimal cutting temperature (O.C.T.).