A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Summary

פרוטוקול זה מתאר שיטה המשתמשת במהדק טלאי כדי לחקור את התגובות החשמליות של נוירונים מוטוריים לגירוי חוט השדרה (SCS) ברזולוציה מרחבית-זמנית גבוהה, אשר יכולה לסייע לחוקרים לשפר את כישוריהם בהפרדת חוט השדרה ובשמירה על קיום התא בו זמנית.

Abstract

גירוי חוט השדרה (SCS) יכול לשחזר ביעילות את תפקוד המנוע לאחר פגיעה בחוט השדרה (SCI). מאחר שהנוירונים המוטוריים הם היחידה האחרונה לביצוע התנהגויות סנסומוטוריות, לימוד ישיר של התגובות החשמליות של נוירונים מוטוריים באמצעות SCS יכול לעזור לנו להבין את ההיגיון הבסיסי של אפנון מוטורי בעמוד השדרה. כדי לתעד בו זמנית מאפייני גירוי מגוונים ותגובות תאיות, מהדק טלאי הוא שיטה טובה לחקור את המאפיינים האלקטרופיזיולוגיים בקנה מידה של תא יחיד. עם זאת, ישנם עדיין כמה קשיים מורכבים בהשגת מטרה זו, כולל שמירה על כדאיות התא, הפרדה מהירה של חוט השדרה מהמבנה הגרמי, ושימוש ב- SCS כדי לגרום בהצלחה לפוטנציאלי פעולה. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט באמצעות מהדק טלאי כדי לחקור את התגובות החשמליות של נוירונים מוטוריים ל- SCS עם רזולוציה מרחבית-זמנית גבוהה, אשר יכול לעזור לחוקרים לשפר את כישוריהם בהפרדת חוט השדרה ושמירה על כדאיות התא בו זמנית לחקור בצורה חלקה את המנגנון החשמלי של SCS על נוירון מוטורי ולהימנע מניסוי וטעות מיותרים.

Introduction

גירוי חוט השדרה (SCS) יכול לשחזר ביעילות את תפקוד המנוע לאחר פגיעה בחוט השדרה (SCI). אנדריאס רווואלד ועמיתיו דיווחו כי SCS מאפשר תפקוד של מנוע הגפיים התחתונות ותא המטען בתוך יום אחד1. חקר המנגנון הביולוגי של SCS להתאוששות מוטורית הוא תחום מחקר קריטי וטרנדי לפיתוח אסטרטגיית SCS מדויקת יותר. לדוגמה, הצוות של גרגואר קורטין הראה כי נוירונים מעוררים Vsx2 ונוירונים Hoxa10 בחוט השדרה הם תאי העצב העיקריים לתגובה ל-SCS, ונוירומודולציה ספציפית לתא אפשרית כדי לשחזר את יכולת ההליכה של חולדה לאחר SCI2. עם זאת, מחקרים מעטים מתמקדים במנגנון החשמלי של SCS בקנה מידה של תא יחיד. אף על פי שידוע היטב כי גירוי הזרם הישר העל-גבי יכול לעורר את....

Protocol

הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים אישרה את כל הניסויים בבעלי חיים והמחקרים נערכו בהתאם לתקנות הרלוונטיות לרווחת בעלי חיים.

1. הכנת בעלי חיים

  1. חיות
    1. מידע על דיור: חולדות Sprague-Dawley זכרים (10-14 ימים לאחר הלידה, P10-P14) בסביבה ספציפית נטולת פתוגנים.
      הערה: תנאי החדר נשמרו ב 20 ° C ± 2 ° C, לחות: 50%-60%, עם מחזור אור / כהה של 12 שעות. לבעלי החיים הייתה גישה חופשית למזון ולמים.
    2. תייגו את הנוירונים המוטוריים בנסיגה לאחור: הזריקו פלואורו-זהב (FG) לשריר הטיביאליס הקדמי ושריר הגסטרוקנמיוס הדו-צדדי (2% במי מלח סטריליים, 50 מיקרוליטר לשריר) כדי לתייג את הנוירונים המוטוריים יומיים לפני ההקרבה.

תוצאות

הודות לתחזוקה הקפדנית בטמפרטורה נמוכה במהלך הפעולה העדינה (איור משלים 1, איור משלים 2 ואיור 1), יכולת הקיום של התא הייתה טובה מספיק כדי לבצע רישומים אלקטרופיזיולוגיים עוקבים. כדי לדמות את התרחיש הקליני ככל האפשר, השתמשנו במיקרומניפולציה כדי למקם את הקתודה והאנודה ש.......

Discussion

מידע התנועה המווסת על ידי SCS מתכנס לבסוף לנוירונים המוטוריים. לכן, לקיחת הנוירונים המוטוריים כיעד המחקר עשויה לפשט את תכנון המחקר ולחשוף את מנגנון הנוירומודולציה של SCS באופן ישיר יותר. כדי לתעד בו זמנית מאפייני גירוי מגוונים ותגובות תאיות, מהדק טלאי הוא שיטה טובה לחקור את המאפיינים האלקטר?.......

Disclosures

ללא

Acknowledgements

מחקר זה מומן על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין לחוקרים צעירים (52207254 ו-82301657) והקרן למדע פוסט-דוקטורט בסין (2022M711833).

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Adenosine 5’-triphosphate magnesium saltSigmaA9187
Ascorbic AcidSigmaA4034
CaCl2·2H2OSigmaC5080
Choline ChlorideSigmaC7527
Cover slide tweezersVETUS36A-SAClip a slice
D-GlucoseSigmaG8270
EGTASigmaE4378
Fine scissorsRWD Life ScienceS12006-10Cut the diaphragm
Fluorescence Light SourceOlympus U-HGLGPS
Fluoro-GoldFluorochromeFluorochromeLabel the motor neuron
Guanosine 5′-triphosphate sodium salt hydrateSigmaG8877
HEPESSigmaH3375
infrared CCD cameraDage-MTIIR-1000E
KClSigmaP5405
K-gluconateSigmaP1847
Low melting point agaroseSigmaA9414
MgSO4·7H2OSigmaM2773
Micromanipulator Sutter Instrument MP-200
Micropipette pullerSutter instrumentP1000
Micro-scissors Jinzhongwa1020Laminectomy
Microscope for anatomyOlympus SZX10
Microscope for ecletrophysiologyOlympus BX51WI
Micro-toothed tweezersRWD Life ScienceF11008-09Lift the cut vertebral body
NaClSigmaS5886
NaH2PO4SigmaS8282
NaHCO3SigmaV900182
Na-PhosphocreatineSigmaP7936
Objective lens for ecletrophysiologyOlympus LUMPLFLN60XWworking distance 2 mm 
Osmometer Advanced FISKE 210
Patch-clamp amplifier Axon Multiclamp 700B
Patch-clamp digitizerAxon Digidata 1550B
pH meter Mettler Toledo FE28
Slice AnchorMultichannel systemSHD-27H
Spinal cord stimulatiorPINST901
Toothed tweezerRWD Life ScienceF13030-10Lift the xiphoid
VibratomeLeicaVT1200S
Wide band ultraviolet excitation filterOlympus U-MF2

References

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

This article has been published

Video Coming Soon

We use cookies to enhance your experience on our website.

By continuing to use our website or clicking “Continue”, you are agreeing to accept our cookies.

Learn More