אלקטרופיזיולוגיה של פעילות קליפת המוח הלמינרית במרמוסט המשותף

Summary

מיקרו-כוננים מותאמים אישית מאפשרים מיקוד תת-מילימטרי של אתרי הקלטה בקליפת המוח באמצעות מערכי סיליקון ליניאריים.

Abstract

קוף המרמוסט מספק מודל אידיאלי לבחינת מעגלים קליפתיים למינריים בשל פני השטח הקורטיקליים החלקים שלו, המאפשרים הקלטות עם מערכים ליניאריים. המרמוסט גדל לאחרונה בפופולריות בשל הארגון התפקודי העצבי הדומה שלו לפרימטים אחרים ויתרונותיו הטכניים להקלטה והדמיה. עם זאת, נוירופיזיולוגיה במודל זה מציבה כמה אתגרים ייחודיים בשל הגודל הקטן וחוסר gyri כמו ציוני דרך אנטומיים. באמצעות מיקרו-כוננים שנבנו בהתאמה אישית, חוקרים יכולים לתפעל את מיקום המערך הליניארי לדיוק תת-מילימטרי ולהקליט באופן אמין באותו מיקום ממוקד רטינוטופית לאורך ימי ההקלטה. פרוטוקול זה מתאר את הבנייה שלב אחר שלב של מערכת מיקום המיקרו-כונן ואת טכניקת ההקלטה הנוירופיזיולוגית עם מערכי אלקטרודות ליניאריות מסיליקון. עם בקרה מדויקת של מיקום האלקטרודות בין מפגשי הקלטה, חוקרים יכולים לחצות בקלות את קליפת המוח כדי לזהות אזורי עניין בהתבסס על הארגון הטינוטופי שלהם ותכונות הכוונון של תאי העצב המוקלטים. יתר על כן, באמצעות מערכת אלקטרודות מערך למינרי זה, ניתן ליישם ניתוח צפיפות מקור זרם (CSD) כדי לקבוע את עומק ההקלטה של נוירונים בודדים. פרוטוקול זה מדגים גם דוגמאות של הקלטות למינריות, כולל צורות גל ספייק שבודדו בקילוסורט, המשתרעות על פני ערוצים מרובים במערכים.

Introduction

המרמוסט הנפוץ (Callithrix jacchus) גדל במהירות בפופולריות כמודל לחקר תפקוד המוח בשנים האחרונות. הפופולריות הגוברת הזו נובעת מהנגישות של קליפת המוח החלקה של המרמוסט, הדמיון בארגון התפקודי העצבי עם בני אדם ופרימטים אחרים, והגודל הקטן וקצב הרבייה המהיר¹. ככל שאורגניזם מודל זה גדל בפופולריות, חלה התפתחות מהירה בטכניקות הנוירופיזיולוגיות המתאימות לשימוש במוח המרמוסט. שיטות אלקטרופיזיולוגיות נמצאות בשימוש נרחב במדעי המוח כדי לחקור את הפעילות של נוירונים בודדים בקליפת המוח של מכרסמים ופרימטים כאחד, וכתוצאה מכך רזולוציה זמנית חסרת תקדים וגישה למיקום. בשל החידוש היחסי של קוף המרמוסט כמודל של מדעי המוח החזותיים, האופטימיזציה של טכניקות אלקטרופיזיולוגיות של התנהגות ערה עדיין מתפתחת. מחקרים קודמים הראו ביסוס פרוטוקולים חזקים לאלקטרופיזיולוגיה בתכשירים מורדמים², ומחקרים נוירופיזיולוגיים מוקדמים המתנהגים ערים הראו את האמינות של אלקטודות טונגסטן חד-ערוציות³. בשנים האחרונות, חוקרים ביססו את השימוש במערכי מיקרואלקטרודות מבוססי סיליקון עבור נוירופיזיולוגיה של התנהגות ערה⁴. עם זאת, המרמוסט מציב אתגרי מיקוד ייחודיים בשל גודל המוח הקטן שלו והיעדר ציוני דרך אנטומיים. פרוטוקול זה מתאר כיצד לבנות ולהשתמש במערכת הקלטה מיקרו-דרייב המתאימה למרמוסט המאפשרת הקלטה של אוכלוסיות גדולות של נוירונים עם מערכים ליניאריים סיליקון תוך יצירת נזק מינימלי לרקמות.

העבודה עם המרמוסט מציבה אתגר בשל קנה המידה הקטן יותר של מפות רטינוטופיות בקליפת המוח הראייתית בהשוואה לפרימטים גדולים יותר. תזוזה קלה של האלקטרודות ב-1 מ"מ בלבד יכולה לגרום לשינויים משמעותיים במפות. יתר על כן, חוקרים לעתים קרובות צריכים לשנות את המיקום של האלקטרודות בין מפגשי ההקלטה כדי לקבל טווח רחב יותר של מיקומים רטינוטופיים בקליפת המוח הראייתית. התכשירים הסמי-כרוניים הנוכחיים אינם מאפשרים התאמה יומית של מיקום האלקטרודה או בדיוק מספיק כדי לכוון למיקומים ספציפיים בסקאלות תת-מילימטריות⁵. בהתחשב בכך, מערכת המיקרו-כונן המוצעת משתמשת בשלב אלקטרודות X-Y המרכיב מיקרו-כונן קל משקל לתא הקלטה ומאפשר מיקוד תת-מילימטרי של אתרים בקליפת המוח. רכיבי שלב X-Y הניתנים להזזה מאפשרים תנועה אנכית ואופקית של המערך הליניארי על מנת לחצות את אזורי קליפת המוח באופן שיטתי, הנדרש לזיהוי אזורי עניין (באמצעות רטינוטופיה ותכונות כוונון). במהלך הקלטות, החוקרים יכולים גם להתאים ידנית את שלב X-Y כדי להזיז את אתרי היעד בתוך האזור. זהו יתרון מרכזי על פני טכניקות חלופיות המשתמשות בתכשירי הקלטה כרוניים למחצה, שאין להם מנגנוני מיקוד אלקטרודות קלים.

המיקרו-כונן הוא כלי רב-תכליתי המאפשר חיבור של מערכי סיליקון שונים לצורך הורדה לתוך קליפת המוח. בפרוטוקול זה, גשושית מותאמת אישית עם שני מערכים ליניאריים של 32 ערוצים במרווחים של 200 מיקרומטר זה מזה שימשה לחקר מעגלים למינריים המשתרעים על עומק קליפת המוח. רוב השיטות לחקירת המעגלים העצביים בדרך כלל דוגמות את הפוטנציאלים החשמליים או יחידות בודדות בממוצע על פני כל שכבות קליפת המוח. עם זאת, מחקר שנערך לאחרונה חשף ממצאים מסקרנים על microcircuits למינרי קליפת המוח⁶. על ידי שימוש במיקרו-כונן, חוקרים יכולים להשתמש בבדיקות למינריות ולבצע התאמות עדינות לעומק ההקלטה כדי להבטיח דגימה מקיפה בכל השכבות.

מערכת זו יכולה להיבנות עם רכיבים זמינים מסחרית והיא שונה בקלות עבור טכניקות ניסוי שונות או גשושיות. היתרונות העיקריים של הכנה זו הם היכולת לשנות את מיקום ההקלטה X-Y בדיוק תת-מילימטרי ולשלוט בעומק ההקלטה בתוך קליפת המוח. פרוטוקול זה מציג הוראות שלב אחר שלב לבניית טכניקות הקלטה של מיקרו-כונן ונוירופיזיולוגיה בשלב X-Y.

Protocol

הליכי הניסוי בוצעו בהתאם למדריך המכונים הלאומיים לבריאות לטיפול ושימוש בחיות מעבדה. הפרוטוקולים להליכים הניסיוניים וההתנהגותיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת רוצ'סטר.

1. בניית מיקרו-כונן המכיל את האלקטרודה להקלטה (איור 1)

הערה: שלבי X-Y מותאמים אישית המחזיקים מערכי סיליקון ליניאריים רב-ערוציים מאפשרים מיקוד תת-מילימטרי של אתרי ההקלטה.

1. אסוף את כל חלקי המיקרו-כונן המתוארים באיור 1. השתמש בפלסטיק אקרילוניטריל בוטאדיאן סטירן (ABS) שקוף כדי להדפיס בתלת-ממד את החלקים המותאמים אישית. זה כולל את שרוול המגן, הבסיס, שלב X ושלב Y. עיצובים עבור חלקים תלת ממדיים זמינים באינטרנט (https://marmolab.bcs.rochester.edu/resources.html). בנוסף, אסוף את האלקטרודה, פלטפורמה מלבנית מפלסטיק, רשת, מיקרומניפולטור, צינורות פלדה ושישה ברגי נירוסטה (גודל בורג: 00).
   1. באמצעות כלי סיבובי עם חיבור חיתוך גלגל יהלום, חתך קטע של 4 מ"מ x 3 מ"מ x 3 מ"מ של רשת הפלסטיק עם מרווח חורים של 1 מ"מ x 1 מ"מ.
   2. השתמש באפוקסי כדי לקבע את מקטע הרשת הקטן החתוך לראש שלב Y. לאחר מכן, הכנס את כונן המיקרו מעל רשת זו באמצעות בורג. מוסיפים אפוקסי בבסיסו ליציבות.
   3. חבר את הפלטפורמה המלבנית הקטנה המודפסת בתלת-ממד לצינור פלדה 28 G עם אפוקסי. זה ישמש בצעדים עתידיים כדי להחזיק את אלקטרודת הסיליקון.
   4. השחיל צינור מדריך 23 G דרך הרשת. לאחר מכן, השחילו את צינור הפלדה המחובר לפלטפורמת הפלסטיק דרך צינור המדריך 23 G. הכנס את צינור הפלדה 28 G לאחד החריצים של כונן המיקרו.
   5. לאחר מכן, הרכיבו את החלקים התלת-ממדיים (בסיס, שלב X, שלב Y) באמצעות ברגי hex מנירוסטה (גודל: 00, אורך: 1/8 אינץ') כדי לבנות את הבסיס לכונן.
      1. ראשית, השתמש בכלי הקשה ידנית כדי להקיש על חורי הבורג המוכנים מראש הן בשלב הבסיס והן בשלב X. לאחר מכן, התחל על ידי החדרת ארבעה ברגים דרך החריצים הארוכים בשלב X ואבטחתם לחורי הבורג המתאימים שהוכנו מראש בבסיס.
      2. לאחר ששלב X הניתן להזזה מאובטח לבסיס, הכנס שני ברגים דרך החריץ הארוך בשלב Y, וחבר אותם לחורי הבורג המוכנים מראש בשלב X.
         הערה: גם שלב X וגם שלב Y צריכים להישאר ניתנים להזזה עד להידוק מלא של הברגים.
2. ודא שכונן המיקרומניפולטור מצויד בפלטפורמת פלסטיק לחיבור מחבר האלקטרודה, כמו גם צינור פולימיד מורחב להחזקת האלקטרודה. חבר את מחבר 64 הפינים לפלטפורמה במיקרומניפולטור באמצעות קלטת.
3. הניחו בזהירות טפיחה של בציטרסין (משחה סטרילית) על צינור הפלסטיק במיקרומניפולטור, וחברו את האלקטרודה המחוברת למחבר 64 הפינים באמצעות כבל סרט גמיש.
4. השתמש בכונן המיקרומניפולטור כדי להחזיק את אלקטרודת הסיליקון ואת המחבר שלה תוך השחלת צינור הפלסטיק דרך חור בשלב Y. האלקטרודה תהיה תלויה מתחת לשלב הגשושית, ממתינה לחיבור לפלטפורמה המלבנית הפלסטית (שלב 7, סעיף 1).
5. נתק את מחבר 64 הפינים מכונן המיקרומניפולטור, והשתמש בג'ל דבק כדי לאבטח את המחבר לפלטפורמה על במת X. ניתן להוסיף אפוקסי נוסף כדי לחזק את הקשר של המחבר ברגע שהדבק מחזיק אותו במקומו. השאירו למשך הלילה לייבוש.
6. נתק בזהירות את האלקטרודה מצינור הפלסטיק, והסר את כונן המיקרומניפולטור מההרכבה.
   הערה: בשלב זה, הכונן מוחזק רק עם תפס התנין של ידיים מסייעות, והאלקטרודה אינה מאובטחת בתוך מבנה הכונן.
7. הזז בזהירות את תפס התנין כדי להפוך את הכונן כדי לראות את האלקטרודה הלא מאובטחת. בעזרת מלקחיים קהים, הניחו את האלקטרודה על מחזיק הפלסטיק מתחת לשלב Y, והדקו אותה עם כמות קטנה של אלסטומר סיליקון (סילסטי). המתן 5 דקות עד שהדבק נרפא.
8. השתמש בבקרת הבורג בכונן המיקרו כדי למשוך את האלקטרודה.
9. הנח את שרוול המגן מעל האלקטרודה בכונן המיקרו. שרוול מגן זה זהה בגודלו לתאי ההקלטה המודפסים בהתאמה אישית ומתאים היטב לבסיס מכלול הכונן.
10. באמצעות מברג שטוח, הדקו את שלושת הברגים הממוקמים בצד על רכיב הבסיס של המיקרו-כונן כדי לאבטח את שרוול המגן במקומו. חבר את במת הראש המשמשת להקלטות למחבר 64 הפינים.

2. ציפוי פוליטרוד של אלקטרודות כדי להפחית את העכבה הכוללת (איור 2)

הערה: לקבלת איכות ההקלטה הטובה ביותר, כדאי לחבר אלקטרודות למערכי אלקטרודות הסיליקון בתמיסת פולי(3,4-אתילאנדיוקסיתיופן) (PEDOT). שיטה זו הוכחה כמגדילה את יחס האות לרעש ^7,8.

1. כדי ליצור את תמיסת PEDOT, ערבבו 0.075 מ"ל של 3,4-אתילאנדיוקסיתופן (EDOT) ו-1.4 גרם של פולי(נתרן 4-סטירנסולפונט) (PSS) ב-70 מ"ל מים מזוקקים. מערבולת פתרון זה בקצרה כדי להבטיח פירוק מלא של הרכיבים. יש לערבב תמיסה זו יום לפני השימוש לקבלת המסה מיטבית.
2. לאחר הפעלת תוכנת בודק העכבה (ראה טבלת חומרים), הכן את ההגדרות עם הכנת האלקטרודה שנבחרה. באמצעות התפריט הנפתח העליון בפינה השמאלית העליונה של חלון התוכנה, בחר את המתאם שבו נעשה שימוש (N2T A32). באמצעות התפריט הנפתח השני, בחר את האלקטרודה שבה נעשה שימוש (NLX-EIB-36). אם האלקטרודה אינה מופיעה בתפריט הנפתח, עיין במדריך להגדרת אלקטרודה חדשה. ודא שמספר הערוצים נכון.
3. חבר את הגשושית למערכת בודק העכבה באמצעות המחבר, והורד את הגשושית לתמיסת מלח מוארקת כדי לקבל קריאת קו בסיס.
   1. במערכת בודק העכבה, לחץ על הלחצן Test Impedances בצד שמאל, וודא את ההגדרות הנכונות (הגדרות: תדירות בדיקה: 1,004 הרץ, מחזורים: 100, השהיה: 0). לאחר מכן, לחץ על לחצן Test probe בפינה השמאלית התחתונה.
   2. חלון דוח בדיקה יופיע כאשר בודק העכבה יפעל, ויאחסן תוצאות בגיליון אלקטרוני. שמרו את התוצאות האלה להתייחסות עתידית עבור שני השוקיים של האלקטרודה (הרכבת האלקטרודה לתוך לשימוש עם בודק העכבה מתוארת באיור 2D). אם אתם משתמשים בבדיקה עם מספר שוקיים, ודאו ששלב 3 חוזר על עצמו עבור כל שוק.
4. הסר את הגשושית מהמלח על ידי הורדת הכן (כלומר, שקע מעבדה) המחזיק את הכד. החליפו את נוזל הכד במים מזוקקים. הרימו את שקע המעבדה כדי לטבול את האלקטרודה, שטפו את תמיסת המלח שנותרה ואז הורידו שוב את שקע המעבדה.
5. החליפו את המים המזוקקים בכד בתמיסת PEDOT, והגביהו את שקע המעבדה עד שהאלקטרודה שקעה בתמיסה.
6. בחר בלחצן DC Electroplate בצד שמאל של חלון התוכנה וודא שנעשה שימוש בהגדרות הנכונות (הגדרות: לוחית אוטומטית: 0.004 μA, 350 הרץ, משך: 5, השהיה: 1). לאחר מכן, לחץ על הלחצן Autoplate בפינה השמאלית התחתונה. שוב, יופיע חלון דוח בדיקה עם תוצאות הציפוי החשמלי. שמור תוצאות אלה לעיון עתידי. אם אתם משתמשים בבדיקה עם מספר שוקיים, ודאו ששלב זה חוזר על עצמו עבור כל שוק.
7. הסר את הבדיקה מתמיסת PEDOT על ידי הורדת שקע המעבדה, ושטוף את הבדיקה במים מזוקקים כפי שבוצע בעבר (שלב 4). לאחר השטיפה, מלאו את הכד בתמיסת מלח, והגביהו את שקע המעבדה עד שהאלקטרודה שקועה במים.
8. לחץ על לחצן Test Impedances בצד שמאל של חלון התוכנה וודא שנעשה שימוש בהגדרות הנכונות (הגדרות: תדירות בדיקה: 1,004 הרץ, מחזורים: 100, השהיה: 0). לחץ על לחצן Test Probe בפינה השמאלית התחתונה. שמור תוצאות אלה לעיון עתידי. אם אתם משתמשים בבדיקה עם מספר שוקיים, ודאו ששלב זה חוזר על עצמו עבור כל שוק.
   הערה: השווה את הערכים שלאחר הציפוי החשמלי לערכים שלפני הציפוי החשמלי. צריכה להיות ירידה בערכי העכבה.
9. בשימוש מתמשך, הגשושיות עשויות להראות עליות בערכי העכבה לאחר 6 חודשים. אם קיים חשש לגבי ערכי העכבה מאות ההקלטה, בדוק שוב את עכבות הבדיקה לאחר שלב 3. אם ערכי העכבה גדלו מהערכים הראשוניים, חזור על הציפוי החשמלי (שלב 6).

3. מיקום כירורגי של כובע הראש, החדרים והקרניוטומיה (איור 3A-C)

הערה: בעבודה זו, בסיום המחקר, בעל החיים הורדם תחת איזופלורן וקיבל זריקות תוך שריריות (IM) של קטמין, ולאחר מכן זריקה תוך צפקית (IP) של אוטזול. המוח הופק לאחר זילוח טרנסקרדיאלי עם מי מלח ואחריו 10% פורמלין.

1. לאמן את המרמוסטים (לפחות 1.5 שנים) לשבת בכיסא פרימטים קטן על פי שיטות שתוארו קודם לכן 3,9,10,11 חודשיים לפני הניתוח.
2. ביום הניתוח, יש לזרז את הנבדקים עם זריקה תוך שרירית (i.m.) של קטמין (5-15 מ"ג/ק"ג)/דקסדומיטור (0.02-0.1 מ"ג/ק"ג) (ומידזולאם ב-0.25 מ"ג/ק"ג כמרפה שרירים), ולאשר הרדמה נאותה בהתבסס על קצב הלב, הנשימה ורפלקס צביטת הבוהן. יש לבצע אינטובציה לבעלי החיים לצורך מתן איזופלורן רציף (0.5%-2% ב-100% חמצן) במהלך הניתוח תוך ניטור חיוניותם. יש להשתמש במשחה וטרינרית על העיניים במהלך הניתוח כדי למנוע יובש בזמן הרדמה.
3. לאחר שהמנתחים לבשו PPE סטרילי, הכינו שדה כירורגי סטרילי באמצעות וילונות סטריליים לכיסוי המשטחים ושדה הניתוח. באמצעות טכניקות אספטיות, בקשו מהמנתחים להשתיל כובע ראש אקרילי עם עמודי טיטניום וברגים כדי לייצב את הראש בשיטות שתוארו בפירוט קודם לכן על ידי Nummela et ^al.11.
4. במהלך ניתוח השתל, תכננו את מיקומי תאי ההקלטה על פני אזורי העניין (למשל, אזורי הראייה, האזור הרקתי האמצעי [MT], וקליפת המוח הראייתית הראשונית [V1]) בהתבסס על קואורדינטות סטריאוטקסיות¹².
5. מניחים חוט הארקה.
   1. התחל על ידי קידוח חור בור 1.1 מ"מ לתוך הגולגולת ליד האזור של תא ההקלטה המתוכנן. כופפו חוט נירוסטה 36 G כ-0.075-1 מ"מ מהקצה והחליקו את החלק הכפוף של החוט בין הגולגולת לדורה בתחתית חור הבור.
   2. בתחילה לאטום את החוט ואת החור עם שעווה עצם ולאחר מכן עם מלט אקריליק בעת הנחת החדרים. הקפידו להשאיר חלק בחוץ ליד התא לחיבור להארקה.
6. לאחר הנחת שכבת בסיס של מלט הדבקה מהירה לכיסוי כל שטח אתר ההקלטה וחוט ההארקה, הדביקו את תאי ההקלטה (המורכבים מחלקים מודפסים בתלת ממד בהתאמה אישית) לגולגולת באמצעות מלט הדבקה מהירה, וחזקו באקריליק בעת בניית שתל הראש.
7. אטמו את התאים עם מכסה תא מודפס בתלת-ממד שנועד להתאים היטב לתוך התא (ולא ניתן להסירו על ידי חברים לכלוב ששוכנו בזוג עם הנבדק).
   1. יש לפזר כמות קטנה של אלסטומר סיליקון (סילסטי) סביב הקצוות הפנימיים של התא באמצעות קצות הערבוב המצורפים, ולאחר מכן להכניס את מכסה התא עד לשטיפה עם דפנות התא החיצוניות.
   2. התאים מתוכננים עם חורי גישה (קוטר 1 מ"מ) משני צדי התא כדי להבטיח שניתן יהיה להסיר את מכסה התא בקלות. השתמשו בסילסטיקה כדי לאטום את חורי הגישה הללו, והתוצאה היא אטם לתא אטום.
      הערה: כדי להסיר את מכסי התא, השתמש בפינצטה כדי להסיר תחילה את האטימה הסילסטית של חורי הגישה כדי לשבור את האטם האטום של התא. לאחר מכן, ניתן להשתמש בסיכה כדי למנף את מכסה התא אל מחוץ לתא.
8. לשחזר את בעלי החיים מן ההרדמה, ולא להשאיר אותם ללא השגחה עד שהם חזרו להכרה מספקת כדי לשמור על עצם החזה. לטפל בבעלי החיים לאחר ניתוח עם אנטיביוטיקה (חומצה amoxicillin-clavulanic ב 13.75 מ"ג / ק"ג) במשך 7 ימים ואנטי דלקתיות (meloxicam ב 0.1 מ"ג / ק"ג) במשך 3 ימים. יש לתת תרופות נגד כאבים בשחרור איטי לפני ההחלמה למשך 72 שעות לאחר הניתוח, ולשכן את בעלי החיים באופן עצמאי עד להחלמה מלאה.
9. שבועיים-שלושה לאחר הניתוח, מתחילים לאמן ריסון ראש והתנהגות חזותית. הניחו את המרמוסט על כיסא פרימטים, ואפשרו הסתגלות לריסון הראש. ברגע שנוח לכם, מאמנים את המרמוסט לבצע מספר משימות בסיסיות, כולל קיבוע חזותי מרכזי¹³, ומשימת סקאדה לעבר סורג גאבור שזוהה באופן היקפי, המשמש למדידת חדות הראייה שלהם¹¹.
10. לאחר אימון התנהגותי מספיק, לבצע craniotomy בתוך תא ההקלטה. בטכניקות סטריליות, בצע ניתוח שני ליצירת קרניוטומיה (בקוטר 2-3 מ"מ) בתא ההקלטה מעל אזור העניין (למשל, שטח MT). לאטום את craniotomy עם יישום עבה של silastic של כ 1 מ"מ או את עומק craniotomy כדי להגן על המוח מפני זיהום ולהפחית את הצמיחה granulation¹⁴. ודאו שלאיטום הסילסטי יש קצוות הנאחזים לפחות ב-2 מ"מ או יותר של מלט השיניים מכל הצדדים. החלף את מכסה התא כמתואר בשלב 7.
11. אם מתרחש דימום כלשהו או שהאטם הסילסטי דולף נוזלים צלולים בימים שלאחר הניתוח, יהיה צורך לנקות את החדר.
    1. אם האטם הסילסטי שלם, השתמשו בטכניקות סטריליות לניקוי עם 10% בטאדין, ושטפו במי מלח סטריליים לפני הסרת האטם. אם האטם הסילסטי אינו שלם, נקו אותו רק במי מלח סטריליים בטכניקות סטריליות.
    2. לאחר הסרת הסילסטיק, שוטפים את הדורה במי מלח סטריליים מספר פעמים, ומייבשים עם מוליך קצה כותנה. יש לייבש את החדר ביסודיות באמצעות אפליקטור קצה כותנה לפני מריחת שכבה חדשה של סילסטיק. בדרך כלל, החדר מתייצב ונשאר יבש עם אטימה הדוקה לאחר מספר ימים עד שבוע.
12. לאחר שהקרניוטומיה התייצבה ולא מראה סימני דימום, בצעו גירוד דוראלי כדי להסיר רקמה עודפת מעל הדורה. לאחר מכן, מרחו שכבה דקה (<1 מ"מ) של סילסטית (דקה מספיק כדי לאפשר מעבר של האלקטרודות להקלטות), והשתמשו במקדח של 1/4 בור כדי לנדף את הסילסטיקה מעל דפנות הקרניוטומיה, כפי שמוצג באיור 3C, לרכישה מכנית.
    הערה: הדבר יאפשר גם הסרה קלה יותר למטרות ניקוי. הסילסטיקה יכולה להישאר במקומה למשך המחקר וניתן לנקב אותה באלקטרודות מערך ליניארי לצורך הקלטה.

4. מערך הקלטה של נוירופיזיולוגיה (איור 3D-F)

הערה: שלבי הטיפול בבעלי חיים ישתנו בהתאם למעבדה ולניסוי. השלבים הבאים ספציפיים למיקום המיקרו-כונן ולחדירת הדורה להקלטות.

1. הסר את המכסה מתא ההקלטה (המתואר בסעיף 3, שלב 7.2). מניחים את הפקק ב-91% אלכוהול איזופרופיל להשריה במהלך ההקלטה. ודאו שקצוות החדר נקיים מסילסטי. אם נשאר silastic על הקצוות של החדר, micro-drive לא יישב כראוי.
2. הבסיס של כונן מיקרו יש שלושה ברגים להידוק אותו לתא על החיה. בדרך כלל, ברגים אלה מהודקים במקומם סביב שרוול מגן בגודל זהה לזה של התא כדי לשמור על גשושית הסיליקון שבתוכו מוגנת מפני פגיעה.
   1. ראשית, השתמשו במברג כדי לשחרר את שלושת הברגים המחזיקים את שרוול המגן מעל בדיקת הסיליקון, והסירו בזהירות את השרוול. חברו את המיקרו-כונן לתא ההקלטה, תוך זהירות שלא לפגוע באלקטרודות הסיליקון שעל דפנות התא (איור 3D, E).
   2. בנוסף, ודא שהאלקטרודות נמצאות במצב נסוג לחלוטין לפני הנחת הכונן על התא, כך שהן יושבות הרבה מעל קליפת המוח במיקום הראשוני.
3. לאחר ההצבה, השתמשו במברג כדי להדק כל בורג בצד המיקרו-כונן (איור 3F). בחר הזמנה להידוק הברגים, והשתמש בה בכל פעם כדי לשמור על יציבות המיקום. החוקרים עשויים גם לרצות לספור את מספר הסיבובים כאשר בתחילה לשחרר את הברגים כדי להדק אותם בכמות דומה. בדקו אם הבדיקה רופפת, והדקו אותה לפי הצורך, אך היזהרו שלא לפשוט את חוטי הבורג בפלסטיק על ידי הידוק יתר.
4. לאחר שהמיקרו-כונן מאובטח לתא, מקם את כל חוטי ההארקה הדרושים.
   הערה: השאר את במת הראש מוכנסת למחבר למשך הלילה, והכנס רק את כבל הממשק ההיקפי הטורי (SPI) לשלב הראש לצורך הקלטות מכיוון שקשה להכניס את במת הראש למחבר בזמן שהוא על החיה.
5. חבר בזהירות את כבל ה- SPI לשלב הראש (שכבר מחובר לבדיקה). הקפד לא לכופף את החוט. הגבר והפוך את כל הנתונים הנוירופיזיולוגיים משלב הראש לדיגיטליים במהירות של 30 קילוהרץ באמצעות ממשק המשתמש הגרפי Open-Ephys (https://github.com/open-ephs/plugin-GUI). סינון במעבר גבוה את אות הפס הרחב משלב הראש ב- 0.1 הרץ. נכון עבור שינויי הפאזה מסינון זה, כפי שתואר קודם לכן¹⁵. עבור מערכים ליניאריים, עבד מראש את העקבות המתקבלות על-ידי הפניה ממוצעת משותפת.
6. הזן את מפת הערוצים עבור מערך האלקטרודות המסוים המשמש במערכת ההקלטה, כך שהערוצים המשורטטים במהלך ההקלטה מסודרים לפי עומק בתצוגת אות ההקלטה המסונן במעבר גבוה. תצוגה זו תשמש בעת התקדמות ונסיגה של האלקטרודה.

5. ביצוע ניסוי רישום נוירופיזיולוגיה (איור 4)

הערה: כאן מתוארת השיטה להנמכת מערכי האלקטרודות לתוך קליפת המוח; שיטה זו הותאמה כדי למנוע פצעון מוגזם של הרקמה הבסיסית. עלייה ברעש ברישומים האלקטרופיזיולוגיים מספקת אינדיקציה טובה לפצעונים לפני חדירה למוח וכניסה למוח. ברגע שיש במוח, אם יש יותר מדי פצעונים, החוקר עשוי להבחין ביחידות הנעות על הגשושית גם ללא מניפולציה של הכונן (יחידות הנעות בהדרגה בין ערוצים לעומק), או לחילופין, החוקר עשוי להבחין בדיכוי הפעילות העצבית, במיוחד באתרים שטחיים על הגשושית. בתנאים אלה, הכונן נסוג כדי להקל על פצעונים ולהקל על הקלטות טובות יותר.

1. באמצעות בקרת הבורג במיקרו-כונן, הנמיכו את בדיקת הסיליקון, ובצעו סיבוב אחד (250 מיקרומטר) כל 1-2 שניות עד לצפייה ביחידות בקצה המערך.
   הערה: ניתן להבחין בעלייה קלה ברעש במהלך חדירת הסילסטיקה הממוקמת מעל הדורה. השוקיים יגודמו את הסילסטיקה לפני שיקפצו דרכם, מה שעלול להגביר את הרעש על הגשוש. ירידה מהירה עד לסימן הראשון של יחידות מסייעת לחדירת השכבה הסילסטית.
2. ברגע שהנוירונים הראשונים נצפים, נסוגה סיבוב אחד של המיקרו-כונן (250 מיקרומטר) כדי להפחית את מהירות הכניסה כאשר האלקטרודה מתחילה לקפוץ דרך הסילסטיקה והדורה לתוך רקמת קליפת המוח. אם נראה שהאלקטרודה ממשיכה להתקדם לתוך הרקמה לאורך זמן ללא מיקרומניפולציה, נסוגה סיבוב נוסף כדי להקל על הלחץ מהגשושית הדוחפת את הסילסטיקה ואת הרקמה שמתחתיה.
   הערה: אמורה להיות אפשרות לעקוב אחר מיקומם של תאי עצב אם מפת הערוצים הנכונה עבור המערך הליניארי נטענה (הערוצים ייראו מסודרים לפי עומקם ביחס לקליפת המוח).
3. המשיכו להניע את המערך לתוך קליפת המוח לאט מאוד, והתקדמו בכארבעה עד שישה סיבובים (1-1.5 מ"מ) במשך 20-30 דקות עד שתאי העצב מפוזרים באופן שווה לאורך הגשוש.
4. משוך את המערך באיטיות בסיבוב אחד או שניים (0.25-0.5 מ"מ) כדי להפחית את הלחץ על הרקמה לפני תחילת ההקלטות.
   הערה: תאי עצב בדרך כלל אינם מזיזים את מיקום התעלה במערך הליניארי במהלך נסיגה זו, דבר המצביע על כך שהוא פועל בעיקר להפחתת הלחץ על הרקמה. ללא נסיגה, ניתן לראות שינוי מערך מתמשך במהלך ההקלטה כאשר הרקמה נרגעת, ובכך לשבש את יציבות ההקלטה (איור 4C).
5. לאחר הביטול, המתן 20 דקות לפני תחילת ההקלטות. פעולה זו תגביל את כמות התנועה הנראית בהקלטה. נצלו את הזמן הזה כדי להתכונן להקלטה (כלומר, לכייל את המעקב אחר העיניים ולהכין את מערכות הצגת הגירויים).
6. בחר הקלט בתוכנת ההקלטה.
7. לאחר השלמת הניסוי, בחר שוב בלחצן ההקלטה. פעולה זו תיצור את קובץ ההקלטה המלא ביעד שנבחר. ודא שהקובץ נשמר כראוי לפני שתמשיך.
8. התחילו לאט לאט להוציא את המערך מקליפת המוח במהירות דומה לקודמת (ארבעה עד שישה סיבובים במשך 20-30 דקות). דמיינו את הגשושית נסוגה על ידי צפייה בתאי העצב נעים לאורך הגשושית. לאחר נסיגה במספר הסיבובים מאז שראו לראשונה תאי עצב וכאשר לא נצפים תאי עצב נוספים על הגשוש, המשיכו לסגת מהר יותר עד לחזרה למצב ההתחלה הנסוג במלואו.
9. כדי להוציא את הבדיקה מתא ההקלטה, בצע את שלבים 1-3 בסעיף 4 בסדר הפוך (כלומר, בצע תחילה את שלב 3, לאחר מכן שלב 2 ולאחר מכן שלב 1).
10. לאחר הוצאת הבדיקה מתא ההקלטה, השרו אותה בתמיסת עדשות מגע למשך 20 דקות כדי להסיר רקמות או דם מהאלקטרודה. לאחר מכן, הניחו את הבדיקה באלכוהול למשך דקה אחת כדי להסיר את תמיסת עדשות המגע, והניחו לאלקטרודה להתייבש.
11. השתמש ב- Kilosort2 כדי למיין את נתוני המערך לאחר הסינון הפנימי ממערכת ההקלטה (כמתואר קודם לכן בסעיף 4, שלב 5).
    1. תייג ידנית את הפלטים מאלגוריתמי מיון הדוקרנים באמצעות ממשק המשתמש הגרפי (https://github/kwikteam/phy "phy"). לסווג את היחידות עם צורות גל זעירות או בלתי סבירות מבחינה פיזיולוגית כרעש, ולא לכלול אותן.
    2. אם אתם משתמשים בבדיקות למינריות, צפו בצורות גל הספייק בכל ערוץ כדי לוודא שיחידות בודדות מסומנות בערוץ עם צורת הגל הגבוהה ביותר (איור 5A). כוללות רק יחידות בעלות צבירים ברורים במרחב PCA, פחות מ-1% הפרות מרווחי ספייק בין ספייקים וצורות גל ספייק דו-פאזיות (שיש למקם לערוצים סמוכים במערך הלינארי). יחידה בודדת לדוגמה מוצגת באיור 5B, אשר מציג אשכולות ברורים במרחב PCA (למעלה מימין) ויציבות לאורך זמן (למטה מימין).

תוצאות

פרוטוקול זה מתאר כיצד לבנות שלב אלקטרודות X-Y (איור 1) המאפשר מיקוד תת-מילימטרי של אתרים ושומר על מיקום אמין בסשנים נפרדים של הקלטה. האמינות של מיקום X-Y מודגמת באיור 6, אשר מראה כי שני סבבי הקלטה שנערכו בהפרש של שבוע הראו חפיפה של 70.8% במיקום ה-RF הממוצע שלהם (

Discussion

מספר שיטות (למשל, כרוניות, חצי כרוניות, חריפות) זמינות כיום לביצוע ניסויים נוירופיזיולוגיים בפרימטים שאינם אנושיים. המרמוסט המצוי מציב אתגרים ייחודיים לניסויים נוירופיזיולוגיים בשל גודלו הקטן וחוסר הגירי כציוני דרך אנטומיים. זה דורש מהחוקרים להשתמש בציוני דרך נוירופיזיולוגיים כגון רטי?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1/4 Hp burr drill bit	McMaster & Carr	Cat# 43035A32	Carbide Bur with 1/4" Shank Diameter, Rounded Cylinder Head, trade Number SC-1, single Cut(https://www.mcmaster.com/products/bur-bits/burs-7/?s=1%2F4%22+bur+bits)
1x1mm Crist Grid	Crist Instruments	1 mm x 1 mm Grid	https://www.cristinstrument.com/products/implant-intro/grids
91% isopropyl alcohol	Medline	N/A	https://www.medline.com/product/Medline-Isopropyl-Rubbing-Alcohol/Bulk-Alcohol/Z05-PF03807?question=91%25%20isopropyl%20alcohol
Acquisition Board	Open-Ephys	N/A	https://open-ephys.org/acquisition-system/eux9baf6a5s8tid06hk1mw5aafjdz1
Bacitracin Ointment	Medline: Cosette Pharmaceuticals Inc	N/A	https://www.medline.com/product/Bacitracin-Ointment/Antibiotics/Z05-PF86957?question=bacitr
Blunt straight Forceps	Medline	N/A	https://www.medline.com/category/Central-Sterile/Surgical-Instruments/Forceps/Z05-CA16_02_20/products
Bone wax	Medline	ETHW31G	https://www.medline.com/product/Ethicon-Bone-Wax/Bone-Wax/Z05-PF61528?question=bonewax
C&B Metabond Quick Adhesive Cement System	Parkell, Inc.	SKU: S380	https://www.parkell.com/C-B-Metabond-Quick-Adhesive-Cement-System
Clavamox	MWI Animal Health	N/A
Contact lens solution	Bausch and lomb		Various sources available
Custom Printed 3D printed parts	ProtoLab		https://marmolab.bcs.rochester.edu/resources.html
DB25-G2 25 Pin Male Plug Port Signal Connector	Various Sources	DB25-G2 25	DB25-G2 25 Pin Male Plug Port Signal 2 Row Terminal Breakout Board Screw Nut Connector
diamond saw attachment for dremel	Dremel	545 Diamond Wheel	https://www.dremel.com/us/en/p/545-26150545ab
Digitizing Head-stages	Intan	RHD 32channel (Part #C3314)	https://intantech.com/RHD_headstages.html?tabSelect=RHD32ch&yPos=120.80 000305175781
EDOT	Sigma Aldrich	Product # 483028	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/483028
Helping Hands	Harbor Freight	N/A	https://www.harborfreight.com/helping-hands-60501.html
Hook Electrical Clips	Various Sources	N/A	Hook test Cable wires
Interface Cables (RHD 3-ft (0.9 m) ultra thin SPI cable)	Intan	Part #C3213	https://intantech.com/RHD_SPI_cables.html
Lab jack	Various Sources	N/A	https://www.amazon.com/Stainless-Steel-Scissor-Stand-Platform/dp/B07T8FM85H/ref=asc_df_B07T8FM85H/?tag=&linkCode=df0&hvadid=366343 827267&hvpos=&hvnetw=g&hvrand =2036619536500717246&hvpone =&hvptwo=&hvqmt=&hvdev=c&hv dvcmdl=&hvlocint=&hvlocphy=900 5674&hvtargid=pla-795933567991& ref=&adgrpid=71496544770&th=1
Meloxicam	MWI Animal Health	N/A
Micro-drive	Crist Instrument	3-NRMD	https://www.cristinstrument.com/products/microdrives/miniature-microdrive-3-nrmd
Multi-channel linear silicon arrays with 64 channel connector	NeuroNexus	A1x32-5mm-25-177	https://www.neuronexus.com/products/electrode-arrays/up-to-10-mm-depth/
NanoZ Omentics Adapter- 32 Channel	NeuraLynx	ADPT-NZ-N2T-32	https://neuralynx.com/hardware/adpt-nz-n2t-32
NanoZ System	Plexon	NanoZ Impedance Tester	https://plexon.com/products/nanoz-impedance-tester/
Narishige Micromanipulator	Narishige	Stereotaxic Micromanipulator	https://usa.narishige-group.com/
Open-Ephys GUI	Open-Ephys		https://open-ephys.org/
Polyimide Tubing (OD(in): 0.021 / ID(in) 0.018 )	Various Sources (Chamfr)	Chamfr Cat#HPC01895	https://chamfr.com/sellers/teleflex-medical-oem-llc/
Primate Chair	Custom made by University of Rochester Machine Shop	Designs online	https://marmolab.bcs.rochester.edu/resources.html
Poly(sodium 4-styrenesulfonate) (PSS)	Sigma Aldrich	Product # 243051	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/243051
RHD USB Interface board	Intan	RHD2000 Evaluation Board Version 1.0	https://intantech.com/RHD_USB_interface_board.html
Silastic gel	World Precision Instruments	# KWIK-SIL	Low Toxicity Silicone Adhesive ((https://www.wpiinc.com/kwik-sil-low-toxicity-silicone-adhesive)
Slow release buprenorphine	Compounding Pharmacy
Stainless steel wire 36 gauge	McMaster & Carr	Cat# 6517K11	Round Bend-and-Stay Multipurpose 304 Stainless Steel Wire, Matte Finish, 1-Foot Long, 0.008" Diameter
Stanley 6-Piece Precision Screwdriver Set	Stanley	1.4mm flathead screwdriver	https://www.amazon.com/Stanley-Tools-6-Piece-Precision-Screwdriver/dp/B076621ZGC/ref=sr_1_3?crid=237VSK5FNFP9N&keywords= stanley+66-052&qid=1672764369&sprefix= stanley+66-052%2Caps%2C90&sr=8-3
Steel Screws	McMaster & Carr	type 00 stainless steel hex screws and 1/8” in length	https://www.mcmaster.com/
Steel Tube	McMaster & Carr	28 gauge stainless steel tubing	https://www.mcmaster.com/tubing/multipurpose-304-stainless-steel-6/id~0-055/
Superglue	Loctite	SuperGlue Gel Control	https://www.loctiteproducts.com/en/products/fix/super-glue/loctite_super_gluegelcontrol.html