בדיקת תעלות יונים בתאים סרטניים

Summary

המיקוד הפרמקולוגי של תעלות יונים הוא גישה מבטיחה לטיפול בגידולים מוצקים. פרוטוקולים מפורטים ניתנים לאפיון תפקוד תעלות היונים בתאים סרטניים ולהערכת ההשפעות של אפנון תעלות יונים על כדאיות הסרטן.

Abstract

תעלות יונים הן קריטיות להתפתחות התא ולשמירה על הומאוסטזיס התא. ההפרעה בתפקוד תעלת היונים תורמת להתפתחות מגוון רחב של הפרעות או תעלות. תאים סרטניים מנצלים תעלות יונים כדי להניע את התפתחותם, כמו גם כדי להשתפר כגידול ולהיטמע במיקרו-סביבה הכוללת תאים לא סרטניים שונים. יתר על כן, עלייה ברמות גורמי הגדילה וההורמונים בתוך המיקרו-סביבה של הגידול יכולה לגרום לביטוי משופר של תעלות יונים, מה שתורם להתרבות תאים סרטניים ולהישרדותם. לפיכך, מיקוד פרמקולוגי של תעלות יונים הוא גישה מבטיחה לטיפול בממאירויות מוצקות, כולל סרטן מוח ראשוני וגרורתי. להלן מתוארים פרוטוקולים לאפיון תפקודן של תעלות יונים בתאים סרטניים וגישות לניתוח מודולטורים של תעלות יונים כדי לקבוע את השפעתם על כדאיות הסרטן. אלה כוללים צביעת תא(ים) עבור תעלות יונים, בדיקת המצב המקוטב של מיטוכונדריה, ביסוס תפקוד תעלת יונים באמצעות אלקטרופיזיולוגיה, וביצוע בדיקות כדאיות כדי להעריך את עוצמת התרופה.

Introduction

חלבוני הובלת ממברנות הם קריטיים לתקשורת בין תאים, כמו גם לשמירה על הומאוסטזיס תאי. בין חלבוני הובלת הממברנה, תעלות יונים משמשות להנעת גדילה והתפתחות של תאים ולשמירה על מצב התאים בסביבות מאתגרות ומשתנות. כמו כן, דווח כי תעלות יונים מניעות ותומכות בהתפתחות גידולים מוצקים, הן מערכתית והן במערכת העצבים המרכזית (CNS)^1,2. לדוגמה, תעלות KCa3.1 אחראיות על ויסות פוטנציאל הממברנה ובקרת נפח התא, דבר חשוב בוויסות מחזור התא. תעלות KCa3.1 פגומות דווחו כתורמות להתרבות חריגה של תאי גידול³. יתר על כן, תעלות יונים עשויות לתרום להפצה גרורתית של סרטן. ערוצי פוטנציאל קולטן חולף (TRP), למשל, מעורבים בזרם Ca ....

Protocol

1. תיוג חיסוני של תעלות יונים בתאים בתרבית

1. הכנת התאים ומערך הניסוי
   1. לשמור על התאים כתרבות גידול פעיל ב 75 ס"מ² צלוחיות תרבית. עברו את התאים פעם אחת עד שהם הופכים ל-50%-90% נפגשים, תלוי בזמן ההכפלה של קו התא בו משתמשים.
      הערה: במחקר הנוכחי נעשה שימוש בתאי D283, קו תאי מדולובלסטומה מקבוצה 3.
   2. אספו את התאים מבקבוק התרבית לתוך צינור צנטריפוגה (15 מ"ל או 50 מ"ל), והוסיפו 2 מ"ל של 0.25% טריפסין-EDTA כדי לנתק תאים דבקים. יש לדגור במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT). לאחר 5 דקות, הקש על הבקבוק שלוש עד חמש פעמים כדי לעזור לנתק את התאים. לאסוף את התאים ב 10 מ"ל של בינוני עם 10% FBS כדי לעצור את הפעולה של טריפסין.
   3. צנטריפוגה ב 480 x <....

תוצאות

למעלה ישנם הליכים נבחרים שניתן להשתמש בהם כדי לאפיין תעלות יונים בתאים סרטניים. הפרוטוקול הראשון מדגיש את הצביעה של תעלת יונים. כפי שמפורט, ישנם אתגרים רבים בעת צביעת תעלת יונים או, לצורך העניין, כל חלבון שנמצא בקרום החוץ תאי. באיור 1 מוצגת צביעה עבור תת-יחידה של קולטן GABA_A<.......

Discussion

שינויים בתפקוד תעלות היונים משנים את מפל האיתות התוך-תאי, מה שיכול להשפיע על התפקוד הכללי של התא. במהלך העשור האחרון, התברר יותר ויותר כי תעלות יונים חשובות לצמיחת תאים סרטניים וגרורות. חשוב לציין, תעלות יונים רבות הן מטרות עיקריות לטיפולים מאושרים המכוונים למגוון רחב של הפרעות^24<.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
ABS SpectraMax Plate Reader	Molecular Devices	ABS
Accutase	Invitrogen	00-4555-56
Alexa Flor 488	Invitrogen	A32723	Goat Anti-Rabbit
Antibiotic-Antimycotic	Gibco	15240-062	100x
B27 Supplement	Gibco	12587-010	Lacks vitamin A
Biosafety Cabinet	LABCONCO	302381101	Class II, Type A2
Bovine Serum Albumin	Fisher Scientific	BP1606-100
CO2 Incubator	Fisher Scientific	13-998-211	Heracell VIOS 160i
Calcium Chloride	Fisher Scientific	C7902	Dihydrate
Cell Culture Dishes, 150 mm	Fisher Scientific	12-600-004	Cell culture treated
Cell Culture Flasks, 75 cm2	Fisher Scientific	430641U	Cell culture treated
Cell Culture Plates, 6 well	Fisher Scientific	353046	Cell culture treated
Cell Culture Plates, 96 well	Fisher Scientific	353072	Cell culture treated
Centrifuge	Eppendorf	EP-5804R	Refrigerated
Corning CoolCell	Fisher Scientific	07-210-0006
Coverslips, 22 x 22 mm	Fisher Scientific	12-553-450	Corning brand
D283 Med	ATCC	HTB-185
DABCO Mounting Media	EMS	17989-97
D-Glucose	Sigma Life Sciences	D9434
Dimethyl Sulfoxide	Sigma Aldrich	D2650	Cell culture grade
DMEM/F12, base media	Fisher Scientific	11330-032	With phenol red
DMEM/F12, phenol red free	Fisher Scientific	21041-025
EGTA	Sigma Aldrich	E4378
Epidermal Growth Factor	STEMCELL	78006.1
FCCP	Abcam	AB120081
Fetal Bovine Serum, Qualified	Gibco	10437-028
Fibroblast Growth Factor, Basic	Millipore	GF003
GARBA5 Antibody	Aviva	ARP30687_P050	Rabbit Polyclonal
Glutamax	Gibco	35050-061
Glycerol Mounting Medium	EMS	17989-60	With DAPI+DABCO
Hemocytometer	Millipore Sigma
Heparin	STEMCELL	7980
HEPES	HyClone	SH3023701	Solution
HEPES	Fisher Scientific	BP310-500	Solid
ImageJ	Open platform		With Fiji plugins
Immuno Mount DAPI	EMS	17989-97
KRM-II-08			experimental compounds not available from a commercial source
Leica Application Suite X	Leica Microsystems
Leukemia Inhibitory Factor	Novus	N276314100U
L-Glutamine	Gibco	25030-081
Magnesium Chloride	Sigma Aldrich	M9272	Hexahydrate
Microscope, Confocal	Leica	SP8
Microscope, Light	VWR	76382-982	DMiL Inverted
MTS - Promega One Step	Promega	G3581
Multi-channel pipette, 0.5-10 µL	Eppendorf	Z683914
Multi-channel pipette, 10-100 µL	Eppendorf	Z683930
Multi-channel pipette, 30-300 µL	Eppendorf	Z683957
Nest-O-Patch	Heka
Neurobasal-A Medium	Gibco	10888022	Without vitamin A
Neurobasal-A Medium	Gibco	12348-017	Phenol red free
Non-Essential Amino Acids	Gibco	11140-050
NOR-QH-II-66			experimental compounds not available from a commercial source
Parafilm	Fisher Scientific	50-998-944	4 inch width
Paraformaldehyde	EMS	RT-15710
PATHCHMASTER	Heka
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122
Perfusion System	Nanion	4000120
PFA	EMS	RT-15710
Phosphate Bufered Saline	Fisher Scientific	AAJ75889K2	Reagent grade
Poly-D-Lysine	Fisher Scientific	A3890401
Poly-L-Lysine	Sigma Life Sciences	P4707
Port-a-Patch	Nanion	21000072
Potassium Chloride	Sigma Life Sciences	P5405
Primary Antibody	Invitrogen	MA5-34653	Rabbit Monoclonal
Prism	GraphPad
Propofol	Fisher Scientific	NC0758676	1 mL ampule
QH-II-66			experimental compounds not available from a commercial source
Reagent Reservoirs	VWR	89094-664	Sterile
Slides, 75 x 25 mm	Fisher Scientific	12-544-7	Frosted one side
Sodium Bicarbonate	Corning	25-035-Cl
Sodium Chloride	Fisher Scientific	S271-3
Sodium Pyruvate	Gibco	11360-070
Synth-a-Freeze Medium	Gibco	R00550	Cryopreservation
TMRE	Fisher Scientific	50-196-4741	Reagent
TMRE Kit	Abcam	AB113852	Kit
Triton X-100	Sigma Aldrich	NC0704309
Trypan Blue	Gibco	15-250-061	Solution, 0.4%
Trypsin/EDTA	Gibco	25200-072	Solution, 0.25%
Vortex Mixer	VWR	97043-562
Whatman Filter Paper	Fisher Scientific	09-927-841