יצירת Protein-E CENP-E-/- Knockout Cell Lines באמצעות מערכת CRISPR/Cas9

Summary

מאמר זה מדווח על בניית תאי נוקאאוט הקשורים לצנטרומר לחלבון-E (CENP-E) באמצעות מערכת CRISPR/Cas9 ושלוש אסטרטגיות סינון מבוססות פנוטיפ. השתמשנו בקו תאי הנוקאאוט של CENP-E כדי לבסס גישה חדשנית לאימות הספציפיות והרעילות של מעכבי CENP-E, שהיא שימושית לפיתוח תרופות ולמחקר ביולוגי.

Abstract

מערכת CRISPR (clustered regular interspaced short palindromic repeats)/Cas9 התפתחה ככלי רב עוצמה לעריכת גנים מדויקת ויעילה במגוון אורגניזמים. Centromere-associated protein-E (CENP-E) הוא קינזין מכוון פלוס הנדרש ללכידת קינטוחור-מיקרוטובול, יישור כרומוזומים ומחסום הרכבת ציר. למרות שתפקודים תאיים של חלבוני CENP-E נחקרו היטב, היה קשה לחקור את הפונקציות הישירות של חלבוני CENP-E באמצעות פרוטוקולים מסורתיים מכיוון שאבלציה של CENP-E מובילה בדרך כלל להפעלת מחסום הרכבת צירים, מעצר מחזור תאים ומוות תאי. במחקר זה, חיסלנו לחלוטין את הגן CENP-E בתאי HeLa אנושיים ויצרנו בהצלחה את תאי ^CENP-E-/- HeLa באמצעות מערכת CRISPR/Cas9.

נקבעו שלוש אסטרטגיות סינון אופטימליות המבוססות על פנוטיפים, כולל סינון מושבות תאים, פנוטיפים של יישור כרומוזומים ועוצמות פלואורסצנטיות של חלבוני CENP-E, המשפרים ביעילות את יעילות הסינון ואת שיעור ההצלחה הניסויית של תאי הנוקאאוט CENP-E . חשוב לציין, מחיקת CENP-E גורמת לחוסר תיאום כרומוזומים, למיקום לא תקין של חלבוני המחסום המיטוטי BUB1 serine/threonine kinase B (BubR1) ולפגמים מיטוטיים. יתר על כן, השתמשנו במודל תאי HeLa הנוקאאוט של CENP-E כדי לפתח שיטת זיהוי עבור מעכבי CENP-E ספציפיים.

במחקר זה נקבעה גישה שימושית לאימות הספציפיות והרעילות של מעכבי CENP-E. יתר על כן, מאמר זה מציג את הפרוטוקולים של עריכת גנים CENP-E באמצעות מערכת CRISPR/Cas9, אשר יכול להיות כלי רב עוצמה לחקור את המנגנונים של CENP-E בחלוקת התא. יתר על כן, קו תאי הנוקאאוט של CENP-E יתרום לגילוי ותיקוף של מעכבי CENP-E, שיש להם השלכות חשובות על פיתוח תרופות נגד גידולים, מחקרים על מנגנוני חלוקת תאים בביולוגיה של התא ויישומים קליניים.

Introduction

עריכת גנום מהונדסת מתווכת את השינויים הממוקדים של גנים במגוון תאים ואורגניזמים. באיקריוטים, מוטגנזה ספציפית לאתר יכולה להיות מוצגת על ידי יישומים של נוקלאזות ספציפיות לרצף המעוררות רקומבינציה הומולוגית של דנ"א מטרה¹. בשנים האחרונות, מספר טכנולוגיות לעריכת גנום, כולל נוקלאזות אצבע אבץ (ZFNs)^2,3, נוקלאזות אפקט דמוי מפעיל שעתוק (TALENs)^4,5, ומגנוקלאזות ביות ^6,7, הונדסו כדי לבקע גנומים באתרים ספציפיים, אך גישות אלה דורשות הנדסת חלבונים מורכבת והליכי ניסוי מיותרים. מחקרים הרא....

Protocol

1. בניית וקטורי הנוקאאוט של הגן CRISPR/Cas9

1. בחר את רצף ה- DNA הגנומי של היעד על הגן האנושי CENP-E (GenBank Accession No. NM_001286734.2) ולעצב את ה-sgRNA באמצעות כלי מקוון לעיצוב CRISPR (http://crispor.tefor.net/).
2. הזן רצף גנומי יחיד, בחר את הגנום של "הומו ספיינס-אדם-UCSC דצמבר 2013 (ערכת ניתוח hg38) + פולימורפיזמים נוקלאוטידים בודדים (SNPs): dbSNP148", ובחר את המוטיב הסמוך של אב החלל "20 bp-NGG-spCas9". בחר שני רצפים מנחים, כולל sgRNA-1, 5'-CGGCCGCACTCGCACGCAGA-3' ו- sgRNA-2 5'-TTCTTTAGAGACGCGGGCTC-3', בהתאם לציוני הספציפיות⁵⁰, היעילות החזויה¹⁰ והמינימום מחוץ ליעדים....

תוצאות

תאי ^CENP-E-/- HeLa נוצרו בהצלחה באמצעות מערכת CRISPR/Cas9 (איור 1). ציר הזמן ושלבי הניסוי הקריטיים של שיטה זו מוצגים באיור 1. ראשית, תכננו וסינתזנו את ה-sgRNA הספציפי ל-CENP-E, חישלנו וקשרנו את ה-sgRNA לפלסמיד pX458, הדבקנו את הפלסמיד לתאי HeLa ותרבנו אותם במשך 48 שעות. ה?.......

Discussion

Kinesin-7 CENP-E הוא וסת מפתח ביישור כרומוזומים ומחסום הרכבת ציר במהלך חלוקת התא 17,19,20. מחיקה גנטית של CENP-E גורמת בדרך כלל להפעלת מחסום הרכבת ציר, מעצר מחזור תאים ומוות תאי 27,29,51,52

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco	25200056
1.5 mL centrifuge tube	Axygen	MCT-150-C
24-well plate	Corning	3524
4S Gelred, 10,000x in water	Sangon Biotech (Shanghai)	A616697
50 mL centrifuge tube	Corning	430828
6 cm Petri dish	Corning	430166
95% ethanol	Sinopharm Chemical Reagent	10009164
96-well plate	Corning	3599
Acetic acid	Sinopharm Chemical Reagent	10000218	Dissolve in H2O to prepare a 10% working solution.
Agarose	Sangon Biotech (Shanghai)	A620014
Alexa Fluor 488-labeled Goat Anti-Mouse IgG(H+L)	Beyotime	A0428	For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:500 dilution.
Alexa Fluor 488-labeled Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)	Beyotime	A0423	For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:500 dilution.
Alexa Fluor 555-labeled Donkey Anti-Mouse IgG(H+L)	Beyotime	A0460	For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:500 dilution.
Anhydrous ethanol	Sinopharm Chemical Reagent	100092690
Anti-BubR1 rabbit monoclonal antibody	Abcam	ab254326	For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:100 dilution
Anti-CENP-B mouse monoclonal antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-376392	For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:50 dilution.
Anti-CENP-E rabbit monoclonal antibody	Abcam	ab133583	For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:100 dilution.
Anti-fade mounting medium	Beyotime	P0131	Slowing down the quenching of fluorescent signals.
Anti-α-tubulin mouse monoclonal antibody	Abcam	ab7291	For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:100 dilution.
Biotek Epoch Microplate Spectrophotometer	Biotek Instruments	Biotek Epoch
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sinopharm Chemical Reagent	69003435
BpiI (BbsI)	Thermo Fisher Scientific	ER1011
CellTiter 96 aqueous one solution cell proliferation assay	Promega	G3580
Centrifuge	Eppendorf	5424BK745380
Colchicine	Sinopharm Chemical Reagent	61001563
Confocal scanning microscope	Leica	Leica TCS SP8
Coverslip	CITOTEST	80344-1220
DAPI	Beyotime	C1006
DH5α competent cells	Sangon Biotech (Shanghai)	B528413
DL2000 DNA marker	TaKaRa	3427A
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	C11995500BT
Endo-free plasmid mini kit	Omega	D6950
Ezup Column Animal Genomic DNA Purification Kit	Sangon Biotech (Shanghai)	B518251
Fetal bovine serum	Zhejiang Tianhang Biotechnology	11011-8611
Gentian violet	Sinopharm Chemical Reagent	71019944	Dissolve in PBS to prepare 0.1% gentian violet/PBS.
Giemsa staining solution	Sinopharm Chemical Reagent	71020260
GraphPad Prism version 8.0 software	GraphPad	www.graphpad.com	Statistical analysis.
GSK923295	MedChemExpress	HY-10299
HeLa cell line	ATCC	CCL-2
Humidified incubator	Heal Force	HF90/HF240
Image J software	National Institutes of Health	https://imagej.nih.gov/ij/	Image processing and analysis.
Inverted microscope	Nanjing Jiangnan Novel Optics	XD-202
LB agar powder	Sangon Biotech (Shanghai)	A507003
Lipo6000 transfection reagent	Beyotime	C0526
Nikon Ti-S2 microscope	Nikon	Ti-S2
Opti-MEM reduced serum medium	Gibco	31985070
Paraformaldehyde	Sinopharm Chemical Reagent	80096618	Dissolve in PBS to prepare 4% paraformaldehyde/PBS.
Penicillin-streptomycin solution	HyClone	SV30010
SanPrep column DNA gel extraction kit	Sangon Biotech (Shanghai)	B518131
SanPrep column plasmid mini-preps kit	Sangon Biotech (Shanghai)	B518191
T4 DNA ligase	TaKaRa	2011A
T4 polynucleotide kinase	TaKaRa	2021A
TaKaRa Ex Taq	TaKaRa	RR001A
Triton X-100	Sinopharm Chemical Reagent	30188928	Dissolve in PBS to prepare 0.25% Triton X-100/PBS.
Tween 20	Sinopharm Chemical Reagent	30189328	Dissolve in PBS to prepare 0.1% Tween 20/PBS.