גישת הדמיה תוך-חיונית יעילה לניטור ארוך טווח של דינמיקה של רקמת אפיתל במיקרוסקופ קונפוקלי הפוך

Summary

הפרוטוקול מציג כלי חדש לפישוט הדמיה תוך חיונית באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי הפוך.

Abstract

הבנת התנהגויות נורמליות וחריגות של תאי in vivo נחוצה לפיתוח התערבויות קליניות לסיכול התחלת המחלה והתקדמותה. לכן חיוני לייעל גישות הדמיה המאפשרות תצפית על דינמיקה של תאים באתרם, כאשר מבנה הרקמה והרכבה נותרים ללא הפרעה. האפידרמיס הוא המחסום החיצוני ביותר של הגוף, כמו גם המקור לסרטן האנושי הנפוץ ביותר, כלומר קרצינומה עורית של העור. הנגישות של רקמת העור מהווה הזדמנות ייחודית לנטר התנהגויות אפיתל ותאי עור בבעלי חיים שלמים באמצעות מיקרוסקופ תוך-חיוני לא פולשני. עם זאת, גישת הדמיה מתוחכמת זו הושגה בעיקר באמצעות מיקרוסקופים רבי-פוטונים זקופים, המהווים חסם כניסה משמעותי עבור רוב החוקרים. מחקר זה מציג עלון במה מותאם אישית למיקרוסקופ מודפס בתלת-ממד המתאים לשימוש עם מיקרוסקופ קונפוקלי הפוך, ומייעל את ההדמיה התוך-חיונית ארוכת הטווח של עור האוזן בעכברים טרנסגניים חיים. אנו מאמינים כי המצאה רב-תכליתית זו, אשר עשויה להיות מותאמת אישית כך שתתאים למותג המיקרוסקופ ההפוך ולדגם המועדף ותותאם לתמונות של מערכות איברים נוספות, תוכיח את עצמה כבעלת ערך רב לקהילת המחקר המדעי הגדולה יותר על ידי שיפור משמעותי של הנגישות של מיקרוסקופיה תוך חיונית. התקדמות טכנולוגית זו היא קריטית לחיזוק הבנתנו את הדינמיקה של תאים חיים בהקשרים נורמליים ומחלות.

Introduction

מיקרוסקופיה תוך-חיונית היא כלי רב עוצמה המאפשר ניטור של התנהגויות תאים בסביבות in-vivo שאינן מוטרדות. שיטה ייחודית זו סיפקה תובנות מפתח על פעולתן הפנימית של מערכות איברים מורכבות של יונקים, כולל ריאות¹, מוח², כבד³, בלוטת חלב⁴, מעי⁵ ועור⁶. יתר על כן, גישה זו חשפה שינויים התנהגותיים בתאים במהלך התפתחות הגידול⁷, ריפוי פצעים^8,9, דלקת^10, ופתולוגיות מגוונות אחרות באתרן. במחקר זה אנו מתמקדים בשיפור הנגישות של מיקרוסקופ תוך-חיוני לדימוי דינמיקה חיה של אפיתל וסטרומה בעור עכבר שלם. הבנת התנהגויות תאים בעור יונקים היא בעלת חשיבות קלינית גבוהה בשל יכולת ההתחדשות והגידול המדהימה של רקמה זו.

הדמיה תוך-חיונית בעכברים בוצעה בעיקר באמצעות מיקרוסקופ מולטיפוטון זקוף בשל יכולתם לספק הדמיה ברזולוציה גבוהה בעומקי רקמות >100 מיקרומטר^11,12. עם זאת, מכשירים אלה חסרים את הרבגוניות של סוס העבודה ואת הנגישות הכללית יותר של מיקרוסקופים קונפוקליים הפוכים, שהם ידידותיים יותר למשתמש וחסכוניים יותר, מספקים את היכולת לצלם תאים בתרבית, אינם דורשים חושך מוחלט במהלך רכישת תמונה, והם בדרך כלל בטוחים יותר, בין יתרונות בולטים אחרים^13,14. במחקר זה אנו מציגים כלי חדש המשפר באופן משמעותי את נגישות ההדמיה התוך-חיונית על ידי התאמת גישה זו למיקרוסקופים קונפוקליים הפוכים.

כאן, אנו מציגים עיצוב של עלון במה מותאם אישית המודפס בתלת-ממד המשלב מספר תכונות עיקריות כדי להקל על הדמיה תוך-חיונית יציבה וארוכת טווח של עור אוזני עכבר במיקרוסקופ קונפוקלי הפוך (איור 1, איור 2, איור 3, איור 4 ואיור 5). תכונות מיוחדות אלה כוללות חור אובייקטיבי אופסט המאפשר את כל הגוף של עכבר בוגר לשכב שטוח לחלוטין במהלך ההדמיה. זה ממזער את הפרעות הרטט של תנועות גוף העכבר בהדמיה ומבטל את הצורך לתת קטמין וקסילזין כדי לדכא את הנשימה, תרגול שלעתים קרובות משולב עם הדמיה תוך חיונית⁶. בנוסף, סוגריים פינתיים בעלון ממקמים נכון חרוט אף איזופלורני כדי ליישר קו עם פני העכבר, אטב אוזניים מתכתי משתק את אוזן העכבר לדיסק כיסוי שנבנה בהתאמה אישית, ופלטת חום ביופידבק אופציונלית בלולאה סגורה הניתנת להסרה מונחת בתוך העלון כדי לתמוך בטמפרטורת גוף העכבר במהלך מפגשי הדמיה ארוכים. דיסק הכיסוי המותאם אישית, המספק משטח שטוח החיוני לראש העכבר ולאוזן לשכב שטוחים, נוצר בחנות מכונות על ידי הסרת הדפנות של צלחת תרבית תאים גנרית המכילה כיסוי. השימוש בעדשת טבילה בשמן סיליקון 40x (צמצם מספרי 1.25 [N.A.], מרחק עבודה של 0.3 מ"מ) בשילוב עם דיסק הכיסוי ותוספת הבמה המותאמת אישית מספק תמונות ברזולוציה גבוהה >50 מיקרומטר עמוק לתוך הדרמיס של האוזן.

כדי לבחון את הפונקציונליות של שלב המיקרוסקופ ההפוך החדש הזה, לכדנו ערימות z המשתרעות על פני כל שכבות אפיתל האפידרמיס במהלך זמן של 3 שעות באוזן של עכבר בוגר חי מהונדס K14-H2B-mCherry¹⁵ (גרעיני אפיתל בקו העכבר הזה מכילים תווית פלואורסצנטית אדומה) (איור 6A-A'). לכדנו גם ערימות z המשתרעות על פני מספר שכבות פיברובלסטים בתוך דרמיס העור במהלך 3 שעות באוזן של Pdgfra-rtTA¹⁶ מהונדס חי; pTRE-H2B-GFP¹⁷ עכבר בוגר (גרעיני פיברובלסטים בקו העכבר הזה מכילים תווית פלואורסצנטית ירוקה לאחר השראת דוקסיציקלין) (איור 6B-D'). הנתונים ברזולוציה גבוהה שלנו מראים יציבות עקבית על ידי חוסר סחף במישורי x, y ו- z, ובכך מוכיחים את יעילותו של כלי הדמיה תוך חיוני חדש זה לשימוש במיקרוסקופים הפוכים. חשוב לציין, ניתן להתאים את הממדים של תוספת שלב זו המודפסת בתלת-ממד, כמתואר בקובץ משלים 1, קובץ משלים 2 וקובץ משלים 3, כך שיתאימו לכל מיקרוסקופ הפוך, וניתן להעביר את מיקום פתח המטרה למיקומים חלופיים בתוך העלון כדי להתאים טוב יותר להדמיית רקמה מסוימת ו/או מודל בעל חיים מעניין. המצאה זו יכולה אפוא להעצים מעבדות בודדות, או חוקרים עם גישה קונפוקלית למתקני הליבה, להתאים כלי זה לצרכי הדימות התוך-חיוניים הייחודיים שלהם, ובכך לייעל את ההערכה של ביולוגיה מגוונת של התא in vivo.

Protocol

מחקר זה בוצע בהתאם להנחיות הטיפול והשימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת אמורי והמרכז הרפואי לענייני חיילים משוחררים באטלנטה ואושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC).

1. התקנת עלון ההדמיה החיה על במת המיקרוסקופ ההפוך

1. בנה את ההוספה באמצעות קובצי .stl (קובץ משלים 1, קובץ משלים 2 וקובץ משלים 3) המציינים את הממדים והעיצוב התלת-ממדיים (ראה איור 1 ואיור 2A), מדפסת תלת-ממד וחומצה פולילקטית (PLA).
2. הניחו בזהירות את האינסרט (איור 2B,C) בחריץ הגדול של שלב המיקרוסקופ (איור 2C ואיור 3A). השתמשו בברגים כדי לאבטח את האינסרט באמצעות ארבעה חורי ברגים הממוקמים בכל פינה של האינסרט (איור 2B-C).
   הערה: העלון הוא דו-כיווני וניתן לסובב אותו ב-180° בהתאם לכיוון שלב המיקרוסקופ ומנגנון ההרדמה.
3. החליקו את לוחית החום לתוך תקע ההוספה כלפי מטה (איור 2D) כך שהיחידה תניח על גבי חריצי ההוספה התחתונים כשיציאת התקע עוברת מתחת לשלב (איור 3B).
4. יישרו את הפתח העגול והמחורץ באינסרט עם יעד טבילה של שמן סיליקון 40x (איור 3C) ומרחו שמן סיליקון על מרכז המטרה.
   1. אם ההדמיה נמשכת פרקי זמן ארוכים יותר (>1 שעות), יש למרוח כמות נדיבה של שמן שתישאר בממשק הכיסוי/אובייקטיבי לאורך כל ההדמיה. אין לאפשר לשמן להישפך על קצוות העדשה.
5. השתמשו במזרק כדי למרוח כמות קטנה של שומן ואקום לאורך הפתח העגול והמחורץ והניחו את דיסק הכיסוי מעליו כדי לאטום את האינסרט (איור 3D).
   הערה: דיסק הכיסוי נוצר על ידי הסרת הדפנות של צלחת תרבית תאים בתחתית זכוכית בגודל 35 מ"מ x 10 מ"מ (מבוצעת על ידי חנות מכונות).
6. מרימים את המטרה פי 40 עד שהשמן נושק לתחתית מכסה הזכוכית.

2. תצורת איזופלורן והכנת עכבר

1. מקם את רכיבי הוופורייזר האלקטרוני בזרימה נמוכה (תא הרדמה, צינורות, וופורייזר, מיכל פחם) כדי לאפשר לקונוס האף ולצינורות המחוברים להגיע לאינסרט (איור 3A).
   אזהרה: איזופלורן הוא חומר הרדמה באינהלציה ויש לטפל בו בזהירות כדי למנוע שפיכות ולמזער את החשיפה לבני אדם.
2. יש למדוד את משקל בקבוק האיזופלורן לפני השימוש ולתושם. חברו את הפקק מהוופורייזר האלקטרוני לבקבוק האיזופלורן.
3. חבר את כבל החשמל למכשיר האידוי האלקטרוני. סגרו את אטבי חרוט האף הכחולים ופתחו את אטבי תא האינדוקציה הלבנים כדי לאפשר זרימת אוויר דרך התא לתוך מכל הפחם. הסר את מכסה האוויר האדום מצדה השמאלי של ההתקן כדי לאפשר זרימת אוויר.
4. אפשר למערכת להתחמם במשך 5 דקות ב-200 מ"ל/דקה (זרימה נמוכה) ו-2% איזופלורן.
   הערה: למרות שהגדרת חרוט האף נבחרה, קו חרוט האף הכחול צריך להישאר סגור, וקו תא האינדוקציה הלבן צריך להישאר פתוח.
5. ברגע שהמערכת מאוזנת כראוי, נקה את הקווים כדי להסיר את שאריות האיזופלורן מהחדר.
6. מקם את העכבר בתא האינדוקציה ובחר זרימה גבוהה. השלם את כל הכנת העכבר (כלומר, הסרת שיער, אספקת תרופות מקומית, מריחת משחת עיניים וכו ') לפני הנחת גוף בעל החיים על גבי העלון. ודא שהעכבר מורדם לחלוטין באמצעות שיטת רפלקס צביטת הבוהן.
   1. כאשר הרגל מורחבת, השתמש בציפורן כדי לצבוט בחוזקה את הבוהן מבלי לגרום נזק פיזי. אם העכבר מפגין תגובה חיובית לגירוי (כלומר, נסיגה ברגל, עווית ברגל וכו '), המשך לתת הרדמה בתוך החדר עד שלא נצפתה תגובה. לאחר הרדמה מתאימה, קצב נשימת העכבר צריך להאט ל~ 55-65 נשימות לדקה¹⁸.
7. כאשר העכבר מורדם לחלוטין, בחר שוב זרימה גבוהה כדי לעצור את העברת האיזופלורן. נקו את התא לפני פתיחתו וכווננו את האטבים (כחול: פתוח; לבן: סגור) כדי להעביר איזופלורן דרך חרוט האף. בחר זרימה נמוכה כאשר חרוט האף מחובר לעכבר כדי להמשיך בהעברת איזופלורן.
8. צינורות איזופלורן חוט עם חרוט האף המחובר דרך תושבת הצינור הפינתי באינסרט (איור 3A ואיור 5).

3. מיקום העכבר על העלון לצורך הדמיה תוך חיונית

1. חברו את פלטת החום לבקר (המכילה בדיקה אנאלית מחוברת), הפעילו אותה ואפשרו לצלחת להגיע לטמפרטורה של 36°C (איור 4A).
2. הוציאו את העכבר המרדים מתא האינדוקציה ושכבו על פלטת החום (איור 4B ואיור 5A). בצע את ההעברה מהחדר להחדרה במהירות כדי למזער את הזמן שהעכבר פעיל ללא הרדמה ממסים נדיפים.
3. הצמידו את חרוט האף לעכבר (איור 4B,C ואיור 5). במידת הצורך, השתמש בסרט כדי לאבטח עוד יותר את הזווית והמיקום של חרוט האף.
4. הכנס את הבדיקה האנאלית וכוונן את טמפרטורת הבקר עד שטמפרטורת גוף העכבר יציבה ב~36 מעלות צלזיוס (איור 4A,B). לאחר שהעכבר ממוקם כראוי, השתמשו בניילון נצמד כדי ללכוד חום, במידת הצורך, כדי לתמוך עוד יותר בטמפרטורת הגוף המתאימה (איור 4C).
5. מקם את העכבר כך שהראש יתיישר עם דיסק הכיסוי והכנס את האוזן למרכז מכסה הזכוכית באמצעות אטב אוזניים מתכתי (איור 5A,B) או סרט (איור 5C).
   הערה: ניתן לכוונן את הלחץ של אטב האוזן המתכתי על האוזן על-ידי שחרור הבורג שמחבר את האטב לעלון. ניתן להוסיף קפיץ מתכת לגמישות הידוק קליפס מוגברת.
   1. כדי לשנות את מיקום אטב האוזן, פתחו את הברגת הבורג באמצעות מפתח אלן בקוטר 2.5 מ"מ והעבירו אותו לאתר המשני (איור 2B,C). בעת הרכבה מחדש של אטב האוזן, הניחו את האטב כנגד העלון, ולאחר מכן את מכונת הכביסה מעליו. השתמש בבורג כדי להדק היטב את התפס בכוח קל כדי לסובב את התפס.
6. התאימו את מיקום ה-z האובייקטיבי עד שהתאים יהיו בתוך מקום המוקד (איור 6A,D). הגדר את הפרמטרים z-stack ו- time-lapse בהתאם למטרות הניסוי והתחל ברכישת תמונה.
   הערה: אם הושגה ההגדרה הנכונה, ניתן לצלם את אוזן העכבר במשך 3 שעות רצופות לפחות (איור 6A',D).
   1. לאחר קביעת גבולות מחסנית z, כוונן את עוצמת הלייזר ואת הרווח כדי להבטיח שאף מישור z אינו רווי יתר על המידה כדי למזער את ההלבנה. קבע את פרמטרי קיטועי הזמן באמצעות העובי הכולל של ערימת z, מספרי צעדים (מומלץ דגימת Nyquist) ומרווחי זמן.
   2. לקבוע את פרמטרי ההדמיה (מרווחי זמן, זמן הדמיה כולל וכו ') באמצעות גורמים מרובים, כולל כדאיות בעלי חיים תחת הרדמה, הלבנה / פוטוטוקסיות המושרה בלייזר, והמטרה של הדמיה חיה (כלומר, דינמיקה של חלוקת תאים, אינטראקציות תא-תא וכו ').

4. הפסקת הדמיה

1. הפעל את כרית החום במחזור המים והגדר למחזור רציף ו- 35 ° C למשך 30 דקות לפחות לפני סיום רכישת התמונה.
2. בסיום ההדמיה, בחר זרימה נמוכה במכשיר האידוי האלקטרוני כדי לעצור את העברת האיזופלורן ולהעביר את העכבר לכרית חום עד לאמבולטורי.
3. לאחר התעוררות, החזירו את העכבר למיכל ההעברה תוך המשך שמירה על כרית חום עד לאמולטורי מלא. נטר באופן עקבי את העכבר בזמן שהוא על כרית החום עד שהוא מגיב.
4. במכשיר האידוי האלקטרוני, לחץ על בחר תפריט > בקרת הרדמה > ריק. הסר את בקבוק האיזופלורן מהמערכת והחזיר את פקק היצרן לבקבוק.
5. מדדו את משקל בקבוק האיזופלורן ומיכל הפחם והכניסו משקולות לבול עץ. לאחר שמיכל הפחם שוקל 50 גרם מעל המדידה הבסיסית, השליכו את המיכל והחליפו אותו ביחידה חדשה. החזר את האיזופלורן לתיבת הנעילה.
6. הסר את דיסק הכיסוי ונגב באמצעות נייר עדשה ותמיסת עדשה. יש לאחסן כראוי כדי למנוע שריטות לשימוש חוזר.
7. הסר את צינורית ההרדמה מתושבת ההחדרה ופתח את ההברגה משלב המיקרוסקופ.

תוצאות

הרכבה נכונה של עלון הדמיה חיה במיקרוסקופ קונפוקלי הפוך והתמצאות מתאימה של עכבר מהונדס על גבי העלון מאומתת על ידי רכישת ערימות z של רקמת אוזן חיה עם תווית פלואורסצנטית לאורך מסלול זמן ≥1 שעות עם עדות מינימלית לסחף בצירי x, y ו-z. יש לצלם תמונות במרווחי זמן קבועים (זמן המרווח יהיה תלוי בשאלה הבי...

Discussion

במחקר זה אנו מציגים כלי חדש המאפשר הדמיה תוך-חיונית יציבה וארוכת טווח של אפיתל עור עכבר שלם על גבי מיקרוסקופים קונפוקליים הפוכים. המצאה זו עשויה PLA, שהוא החומר הנפוץ ביותר וזול ביותר להדפסה תלת מימדית; כל עלויות הדפסת התלת-ממד הפנימיות עבור עלון זה מסתכמות ב-<$5. את שני חלקי ההוספה הנפרדים (

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3D Printer	Qudi Tech	i-Fast	3D prints using PLA material
40x 1.25NA silicone objective lens	Nikon
AxR Laser Scanning Confocal Microscope	Nikon
Cotton Tipped Swab	VWR	76337-046	Cream/ointment application
Doxycycline hyclate	Sigma-Aldrich	D9891	Induces GFP labeling of fibroblast nuclei in Pdgfra-rtTA; pTRE-H2B-GFP mice
Flathead Screwdriver (2.5 mm)			Affiix insert to microscope stage
Flathead Screws x 4 (#6-32)	Nikon		Screw insert into microscope stage
Glass Bottom Culture Dish	chemglass Life Sciences	CLS-1811-002	Modified by removing walls of dish for use as coverslip disk compatible with live insert; 35 mm wide disk contains 20 mm wide glass coverslip; dish walls were removed by machine shop
Heat Plate controller	Physitemp	TCAT-2LV	Animal Temperature Controller - Low Voltage; anal prob attachment for mouse body temperature monitoring
Hex Wrench (1.5 mm)			For M3 setscrew adjustments
Hex Wrench (2.5 mm)			Adjust tension on metal ear clip
Intravital Imaging Insert
Isoflurane	Med-Vet International	HPA030782-100uL	Mouse anesthesia
Labeling Tape (or Scotch Tape)	VWR	10127-458	Alternative to metal ear clip to immobilize ear to coverslip
Metal fastener			used as ear clip
Mouse: C57BL/6-Pdgfraem1(rtTA)Xsun/J	The Jackson Laboratory	RRID: IMSR_JAX:034459	Fibrroblast-specific promoter driving doxycycline-inducible rtTA expression
Mouse: K14-H2BPAmCherry	Courtesy of Dr. Valentina Greco at Yale University		Labels epidermal epithelial cell nuclei with mCherry; referred to in text as "K14-H2B-mCherry"
Mouse: pTRE-H2B-GFP: STOCK Tg(tetO-HIST1H2BJ/GFP)47Efu/J	The Jackson Laboratory	RRID: IMSR_JAX:005104	Labels fibroblast nuclei with GFP when combined with Pdgfra-rtTA and induced with doxycycline
Multipurpose Sealing Wrap	Glad		Enhance mouse warmth
Optixcare	VWR	MSPP-078932779	Eye lubricant
Set screws x 3 (M3; 6 mm)	Thorlabs	SS3M6	Attachment for heatplate module
Silicone Immersion Oil			Applied to 40x silicone objective
Small Animal Heating Plate	Physitemp	HP-4M	Provides heat to animal
Somnoflow Low-Flow Electronic Vaporizer	Kent Scientific	SF-01	Mouse anesthesia
Vacuum Grease	Flinn Scientific	AP1095	Seals coverslip disk to insert
Veet			hair removal
Water circulating heat pad	Stryker Medical	TP700	for mouse revival post-imaging