הקמת מודל עכברי פיסטולה אורונזלית

Summary

מאמר זה מתאר הליך שלב אחר שלב להקמת מודל עכברים עם פיסטולה אורונזאלית. הפיסטולה האורונזאלית נוצרה על ידי שימוש בצריבה אופתלמולוגית מחוממת כדי לפגוע בחלק קו האמצע של החיך הקשה, וכתוצאה מכך נוצר פתח בין חלל הפה והאף.

Abstract

מחקר זה מציג שיטה המשתמשת בצריבה אופתלמולוגית מחוממת לפיתוח מודל בר קיימא לחקר פיסטולות אורונזאליות. עכברי C57BL/6 שימשו לביסוס מודל הפיסטולה האורונזאלית (ONF). כדי ליצור את ONF, העכברים הורדמו, שותקו, והחיך הקשה שלהם נחשף. במהלך ההליך הכירורגי נגרמה פגיעה ברירית בעובי מלא של 2.0 x 1.5 מ"מ בקו האמצע של החיך הקשה באמצעות צריבה אופתלמולוגית. היה חיוני לשלוט בגודל ה-ONF ולמזער דימום כדי להבטיח את הצלחת הניסוי. אימות יעילות מודל ONF נערך ביום השביעי שלאחר הניתוח, וכלל הערכות אנטומיות ותפקודיות כאחד. נוכחותה של מחיצת האף בתוך חלל הפה ויציאת המים הסטריליים מהנחיריים עם הזרקתם לחלל הפה אישרו את הקמתו המוצלחת של מודל ONF. המודל הדגים פיסטולה אורונזאלית מעשית ומוצלחת, המאופיינת בשיעור תמותה נמוך, שינויים משמעותיים במשקל ושונות מינימלית בגודל ONF. מחקרים עתידיים עשויים לשקול לאמץ מתודולוגיה זו כדי להבהיר את מנגנוני ריפוי פצעי החיך ולחקור טיפולים חדשניים לפיסטולות אורונזאליות.

Introduction

פיסטולה אורונזאלית (ONF), פתח לא תקין בין חלל הפה והאף, מתבטאת קלינית בפגם באזור מבני מתהליך הנאדיות ועד האובולה, המתרחש בדרך כלל כסיבוך לאחר תיקון חיך שסוע¹. חולים עם ONF חווים ריפלוקס מזון, הפרעות ביטוי ותפקוד וולופרינגיאלי לקוי, המשפיעים באופן משמעותי על איכות חייהם ^2,3,4. שיעור ONF לאחר הניתוח נע בין 2.4% ל -55% בשל גורמים כגון רוחב שסוע, סוג Veau ושיטה כירורגית 5,6,7,8. בנוסף, שיעור ההישנות לאחר תיקון ONF גבוה, ונע בין 0% ל-43%⁹.

מספר טיפולים חדשניים הראו לאחרונה הבטחה בתחום ONF, כולל חומרים שונים, תרופות וטכניקות חדשניות 10,11,12,13,14,15,16,17. הערכה מדויקת של השפעות טיפוליות היא חיונית מכיוון שהיא מספקת את הבסיס לבחירה ופיתוח נוסף של טיפולי ONF. עם זאת, קבלת הערכה תקפה בטווח הקצר עבור השפעות טיפוליות שאינן ניתוח היא מאתגרת, שכן המאפיינים של ONFs משתנים בין חולים שונים. לכן, הקמת מודל מחלת ONF נחוצה כדי לוודא את היעילות של שיטות טיפול אלה.

במשך כמה עשורים, חוקרים יצרו את מודל הפיסטולה האורונזאלית (ONF) במינים שונים של בעלי חיים, כולל חולדות^18,19, חזירונים 20,21, מיני-חזירים 22 וכלבים ^23, שכן למינים אלה יש חיך קשה משמעותי המתאים למניפולציה כירורגית. עם זאת, לעכברים יש רצף גנטי וגנום שלם הדומה לזה של בני אדם, מה שהופך אותם למודל חשוב למחקר ופיתוח תרופות חדשות^24,25,26. יתר על כן, עכברים מציעים שונות קטנה מאצווה לאצווה, מה שהופך אותם לבחירה חיובית להקמת מודל ONF^12,13,27.

עם זאת, השלבים המפורטים ליצירת ONF לא תוארו, והיציבות של גודל ONF לא נלקחה בחשבון. בנוסף, אימות היווצרות ONF הסתמך אך ורק על תצפית²⁸, מבלי להבטיח תקשורת ישירה בין חלל הפה והאף. זה לא הודגם באמצעים אחרים, כגון אובדן משקל הגוף של העכבר עקב קשיי אכילה שנגרמו על ידי ONF. יתר על כן, שונות נורמלית בגודל הפצע לא נלקחה בחשבון, וזה חיוני למחקרים על תרופות או חומרים המקדמים או מעכבים ריפוי פצעים. לכן, יש צורך חזק להקים מודל ONF יציב ומאומת.

מטרת מחקר זה הייתה לפתח מודל ONF מעשי המתייחס לסוגיות הנ"ל, בתקווה שפרוטוקול זה ישמש בסיס למחקר עתידי על מנגנוני ריפוי פצעי החיך וטיפולים חדשניים ל- ONF.

Protocol

כל ההליכים בבעלי חיים במחקר זה נבדקו ואושרו על ידי הוועדה האתית של בית הספר לסטומטולוגיה של מערב סין, אוניברסיטת סצ'ואן. עכברי C57BL/6 בוגרים (נקבה) שימשו במחקר הנוכחי.

1. הכנה כירורגית

1. אספו את כלי הניתוח הדרושים להליך: נביטה, צריבה אופתלמולוגית, מספריים מיקרו-כירורגיים, פינצטה מיקרו-כירורגית, מזרקים ומחטים (26 גרם x 0.63 אינץ') (איור 1A,B) (ראו טבלת חומרים).
   הערה: לפני ההליך הכירורגי, autoclave את כלי הניתוח, כולל צריבה אופתלמולוגית, פינצטה microsurgical ומספריים microsurgical , ב 102.9 kPa (1.05 ק"ג / ס"מ²) ו 121 ° C במשך 20 דקות.
2. אספו את הציוד הכירורגי הדרוש: וילונות כירורגיים, כפפות לטקס, כותנה סטרילית, יריעות סטריליות, רדיד מתכת סטרילי, לוח קצף כפלטפורמה כירורגית, גומיות (שניתן להשיג על ידי קריעת כפפת לטקס רפואית) וסרט (איור 1C) (ראו טבלת חומרים).
   הערה: השתמש בערכת חומרים מתכלים נפרדת עבור כל עכבר, כולל מזרקים ויריעות סטריליות עבור שדה הניתוח.
3. נקו את אזור הניתוח ואת מכשיר הניתוח (מקור אור, לוח קצף ומכשיר לתחזוקת טמפרטורה, ראו טבלת חומרים) באמצעות מגבוני אלכוהול. כסו את הידיות והידיות של מכשירים שעשויים להידרש במהלך ההליך ברדיד מתכת סטרילי.
4. פתח את המכשירים הבודדים ומקם אותם בזהירות באזור הניתוח. הפעל את המביט (ראה טבלת חומרים) ואת האורות לשימוש במהלך ההליך. מניחים את הצריבה האופטלמולוגית לתוך הנבט ומחממים אותו ל 250 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות.

2. הליך כירורגי

1. בצע קיבוע של העכבר ופתח את חלל הפה לפי השלבים הבאים.
   1. בחר עכבר נקבה C57BL/6J במשקל 20-25 גרם ובגילאי 8-12 שבועות. בית העכבר במשך 7 ימים לפני ביצוע הליכים כלשהם.
   2. הרדימו את העכבר על ידי הזרקה תוך צפקית של Zoletil50 (80 מ"ג/ק"ג) וקסילזין (5 מ"ג/ק"ג) (ראו טבלת חומרים). החל משחת עיניים אופתלמית על העין של העכבר. חכו עד שלא תהיה תגובה של צביטת אצבע.
      הערה: העכבר מוכן להליך כאשר אין באפשרותו להתהפך באופן עצמאי.
   3. חבר את העכבר ללוח קצף מרופד ביריעות סטריליות. השתמשו בסרט הדבקה כדי לקשור את העכבר למשטח הניתוח במצב שכיבה (איור 2A).
   4. פתח את חלל הפה של העכבר. מקם שתי מחטים (26 גרם x 0.63 אינץ ') לפני מישור האוזן המסלולית ושתיים נוספות מאחוריו. מניחים גומייה סביב המחטים וחוצים את החותכות כדי להחזיק את הפה פתוח. השתמשו בפינצטה מיקרוכירורגית כדי לפתוח את זוויות הפה (איור 2B).
      הערה: ודא שהחיך הקשיח חשוף בבירור. קבע את הלשון מתחת לגומייה כדי למנוע חסימה של שדה הראייה וצריבה במהלך הניסויים הבאים.
2. צרו את הפיסטולה האורונזאלית (ONF) על החיך הקשה (איור 3A-F).
   1. אחזר את הצריבה אופתלמולוגית, אשר כבר מחומם ל 250 ° C במשך 20 דקות. מניחים את קצה הצריבה במרחק של 1 מ"מ מההצטלבות של קו האמצע של החיך וקו הטוחנת הקדם-טוחנת הראשונה, ויוצרים פגיעה ברירית בעובי מלא לחיך הקשה בקו האמצע.
      הערה: הימנע מצריבת לשון העכבר.
   2. לאחר מספר שניות, הסר את הצריבה האופטלמולוגית כאשר הרירית סביב קצה הצריבה הופכת לבנה.
   3. מניחים את הצריבה האופטלמולוגית בנבט וממשיכים לחמם אותה ל 250 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. חזור על השלב הקודם כדי להגדיל את הפצע סביב הקצוות עד שהוא מגיע לאורך של 2.0 מ"מ ורוחב של 1.5 מ"מ.
      הערה: כל הארכה צריכה לעקוב אחר קצה הפציעה האחרונה. השתמש בקליפר ורנייר כדי למדוד את אורך ורוחב הפציעה. הפציעה צריכה לכסות 10% מהחיך.
   4. השתמש מספריים microsurgical כדי להסיר כל רקמה רכה denatured עודף סביב הפצע. השתמש כותנה סטרילית כדי לעצור דימום ולמנוע שאיפה חנק של העכבר. מדדו את הפצע כדי לוודא שהוא יוצר פגיעה ברירית החיך הקשה בעובי מלא בגודל 2.0 x 1.5 מ"מ בקו האמצע.

3. טיפול לאחר הניתוח

1. מתן Meloxicam לעכבר בזמן התעוררות לאחר הניתוח, במינון של 5 מ"ג / ק"ג / d במשך 3 ימים, תת עורית²⁹.
2. הניחו את העכבר על מכשיר לשמירת טמפרטורה עד שהוא חוזר להכרה מלאה.
   הערה: ודא שהעכבר ממוקם באופן המאפשר נשימה. סובבו את העכברים כל 10-15 דקות כדי למנוע איגום דם או קריסה של אונות ריאה. לאחר שהעכבר התחמם, החזירו אותו לכלוב שלו. לספק ג'לי סטרילי ומזון מוקרן בתחתית הכלוב עבור העכברים לצרוך.

4. אימות יצירת פיסטולה אורונזאלית

הערה: ההצלחה של יצירת פיסטולה oronasal (ONF) מוערכת ביום השביעי לאחר ההליך הכירורגי.

1. הכינו את הציוד הכירורגי הדרוש: גומייה, סרט הדבקה, מזרקים, וילונות כירורגיים, כפפות לטקס, יריעות סטריליות, רדיד מתכת סטרילי וקרש קצף.
2. יש ללבוש וילונות כירורגיים וכפפות סטריליות כדי לשמור על תנאים אספטיים. יש לחטא את לוח הקצף, מקור האור ומכשיר תחזוקת הטמפרטורה באלכוהול.
3. יש לגרום להרדמה כללית על ידי הזרקה תוך צפקית של Zoletil50 (80 מ"ג/ק"ג). חכו עד שלא תהיה תגובה של צביטת אצבע. השתמש באותה שיטה כמתואר בשלב 2.1.3 ו- 2.1.4 כדי לשתק את העכבר ולחשוף את החיך הקשה.
4. בצעו אימות אנטומי מבני על-ידי כך שתבטיחו שהמחיצה עדיין נראית לעין באתר הפצע, מה שמעיד על יצירת ONF מוצלחת (איור 4A,B).
5. ביצוע אימות פונקציונלי: סגור את חלל הפה של העכבר והזריק מים סטריליים לחלל הפה שלו באמצעות מזרק סטרילי. היצירה המוצלחת של ONF מאושרת כאשר נוזל זורם מנחיריו של העכבר.
6. הניחו את העכבר על מכשיר שמירת הטמפרטורה (37°C) עד שהוא חוזר להכרה מלאה. סובבו את העכברים כל 10-15 דקות כדי למנוע איגום דם או קריסה של אונות ריאה.

תוצאות

כדי להעריך את ההיתכנות והיציבות של שיטה ניסיונית זו, בוצע אותו הליך על עשרה עכברים, ונעשו תצפיות לגבי תמותה, שינויים בגודל הפצע, משקל הגוף וניתוח היסטולוגי. העכברים הומתו ביום השביעי.

ההליך הציג שיעור תמותה נמוך. הצריבה האופטלמולוגית והנביט, המתוארים באיור 1A-C

Discussion

חוקרים חקרו חומרים שונים, תרופות וטכניקות חדשניות לטיפול ב- ONF 10,11,12,13,14,15,16,17. עם התקדמות בהליכים כירורגיים, השכיחות וההישנות של ONF הופחתו. עם זא...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Germinator	Electron Microscopy Sciences	66118-20	Heating and disinfection equipment
Latex gloves	Allmed		or similar
Lights	Olympus	A1813
Meloxicam	MedChemExpress	HY-B0261	crushed; 5 mg/kg
Microsurgical instruments (scissors and tweezers)	Jiangsu Tonghui Medical Devices Co.	M-Y-0087	Surgical instrument
Ophthalmologic cautery	Suqian Wenchong Medical Equipment Co.	1.00234E+13	Surgical instrument
Sterile cotton,	Yancheng Begu Technology Co.		or similar
Sterile metal foil	Biosharp		or similar
Sterile sheets	3M	XH003801129	or similar
Surgical drapes	Yancheng Begu Technology Co.		or similar
Syringes	Yancheng Begu Technology Co.	S-015301	or similar
Tape	Bkmamlab		or similar
Temperature maintenance device	Harvard Apparatus	LE-13-2104
Zoletil50	Virbac		80 mg/kg