JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

מחקר זה מספק פרוטוקול לשימוש בעכברי נוקאאוט Stat3 ספציפיים לשושלת אוסטאובלסטים כדי לחקור עיצוב מחדש של עצם תחת כוח אורתודונטי ומתאר שיטות לניתוח עיצוב מחדש של עצם הנאדית במהלך תנועת שיניים אורתודונטית, ובכך שופך אור על הביולוגיה המכנית של השלד.

Abstract

עצם הנאדית, עם שיעור תחלופה גבוה, היא העצם המשפצת ביותר בגוף. תנועת שיניים אורתודונטית (OTM) היא תהליך מלאכותי נפוץ של עיצוב מחדש של עצם הנאדית בתגובה לכוח מכני, אך המנגנון הבסיסי נותר חמקמק. מחקרים קודמים לא הצליחו לחשוף את המנגנון המדויק של עיצוב מחדש של עצם בכל זמן ומרחב בשל מגבלות הקשורות למודלים של בעלי חיים. מתמר האותות והמפעיל של שעתוק 3 (STAT3) חשוב בחילוף החומרים בעצמות, אך תפקידו באוסטאובלסטים במהלך OTM אינו ברור. כדי לספק ראיות in vivo לכך ש-STAT3 משתתף ב-OTM בנקודות זמן ספציפיות ובתאים מסוימים במהלך OTM, יצרנו מודל עכבר נוקאאוט Stat3 ספציפי לשושלת אוסטאובלסטים המושרה בטמוקסיפן, הפעלנו כוח אורתודונטי וניתחנו את פנוטיפ העצם הנאדית.

טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת (Micro-CT) ומיקרוסקופ סטריאו שימשו לגישה למרחק OTM. ניתוח היסטולוגי בחר את האזור הממוקם בתוך שלושה שורשים של הטוחנת הראשונה (M1) בחתך הרוחב של העצם המקסילרית כאזור העניין (ROI) כדי להעריך את הפעילות המטבולית של אוסטאובלסטים ואוסטאוקלסטים, מה שמצביע על השפעת הכוח האורתודונטי על עצם הנאדיות. בקיצור, אנו מספקים פרוטוקול לשימוש בעכברי נוקאאוט Stat3 ספציפיים לשושלת אוסטאובלסטים כדי לחקור עיצוב מחדש של עצם תחת כוח אורתודונטי ומתארים שיטות לניתוח עיצוב מחדש של עצם מכתשית במהלך OTM, ובכך שופכים אור חדש על ביולוגיה מכנית השלד.

Introduction

ידוע בדרך כלל כי העצם נמצאת בשחזור מתמיד לאורך כל החיים, בתגובה לכוחות מכניים על פי חוק וולף 1,2. גירוי מכני מתאים, כגון כוח הכבידה ופעילות גופנית יומיומית, שומר על מסת העצם וחוזקה ומונע אובדן עצם על ידי גירוי הן אוסטאובלסטים והן אוסטאוקלסטים. אוסטאוקלסטים, האחראים על ספיגת עצם 3,4,5,6,7, ואוסטאובלסטים, האחראים על היווצרות עצם 8,9,10, שומרים על הומאוסטזיס העצם ומתפקדים במשותף בתהליך הביולוגי של עיצוב מחדש של העצם. לעומת זאת, בהיעדר גירויי העמסה, כמו אצל אסטרונאוטים תחת מיקרו-כבידה ארוכת טווח, העצמות סובלות מאובדן צפיפות מינרלים של 10%, מה שמגדיל את הסיכון לאוסטאופורוזיס11,12. יתר על כן, טיפולים מכניים לא פולשניים ונוחים, כולל יישור שיניים ואוסטאוגנזה של הסחת דעת, התגלו כטיפולים למחלות עצם13,14. כל אלה הראו כי כוח מכני משחק תפקיד קריטי בשמירה על איכות העצם וכמותה. מחקרים אחרונים ניתחו בדרך כלל עיצוב מחדש של עצם בתגובה להעמסה מכנית באמצעות מודלים גוזלי זמן כגון בדיקות מתלים של גלגל ריצה וזנב, אשר בדרך כלל לקח 4 שבועות או יותר כדי לדמות העמסת כוח או פריקה15,16. לכן, יש ביקוש למודל נוח ויעיל של בעלי חיים לחקר עיצוב מחדש של עצם המונע על ידי העמסת כוח.

עצם הנאדית היא הפעילה ביותר מבחינת שיפוץ עצם, עם שיעור תחלופה גבוה17. תנועת שיניים אורתודונטית (OTM), טיפול נפוץ לחסימה, היא תהליך מלאכותי של עיצוב מחדש של עצם הנאדית בתגובה לכוח מכני. עם זאת, OTM, אשר גורם לעיצוב מחדש מהיר של עצם18, הוא גם דרך חוסכת זמן לחקור את ההשפעות של כוח מכני על עיצוב מחדש של עצם בהשוואה למודלים אחרים עם תקופת ניסוי ארוכה. לכן, OTM הוא מודל אידיאלי ללמוד שיפוץ עצם תחת גירויים מכניים. ראוי לציין כי המנגנון של remodeling עצם alveolar הוא לעתים קרובות רגיש לזמן, ויש צורך לבחון את השינויים remodeling עצם alveolar בנקודות זמן מסוימות לאחר דוגמנות. עם היתרונות הכפולים של בקרה זמנית ומרחבית של רקומבינציה מחדש של DNA וספציפיות רקמות, מודל עכבר נוקאאוט גן מותנה המושרה הוא בחירה מתאימה למחקרי OTM.

באופן קונבנציונלי, עיצוב מחדש של עצם מכתשית בתיווך OTM חולק לאזורי מתח הכוללים היווצרות עצם ואזורי לחץ הכוללים ספיגת עצם 19,20,21, שהיא מפורטת יותר אך קשה לווסת. יתר על כן, יורי ואחרים דיווחו כי זמן היווצרות העצם ב- OTM היה שונה בצדדי המתח והדחיסה22. בנוסף, מחקר קודם הראה כי הטוחנת הראשונה יכולה ליזום שיפוץ רחב של עצם הנאדית המקסילרית תחת כוח אורתודונטי, אשר לא היה מוגבל לאזורי המתח והלחץ23. לכן, בחרנו את האזור הממוקם בתוך שלושה שורשים של M1 בחתך הרוחב של העצם המקסילרית כאזור העניין (ROI) ותיארנו שיטות להערכת הפעילות של אוסטאובלסטים ואוסטאוקלסטים באותו אזור כדי להעריך עיצוב מחדש של עצם מכתשית תחת OTM.

כגורם שעתוק גרעיני, מתמר אותות ומפעיל של שעתוק 3 (STAT3) הוכח כקריטי בהומאוסטזיסעצם 24,25. מחקרים קודמים דיווחו על צפיפות מינרלים נמוכה בעצם ושברים פתולוגיים חוזרים ונשנים בעכברים מוטנטיים Stat3 26,27. המחקר הקודם שלנו הראה כי מחיקת Stat3 באוסטאובלסטים Osx+ גרמה למום גולגולתי ואוסטאופורוזיס, כמו גם לשבר עצם ספונטני28. לאחרונה, סיפקנו ראיות in vivo עם מודל עכבר מחיקה ספציפי לאוסטאובלסטים Stat3 (Col1α2CreERT2; Stat3 fl/fl, להלן Stat3Col1α2ERT2) כי STAT3 הוא קריטי בתיווך ההשפעות של כוח אורתודונטי המניע עיצוב מחדש של עצם מכתשית29. במחקר זה, אנו מספקים שיטות ופרוטוקולים לשימוש בעכברי נוקאאוט Stat3 ספציפיים לשושלת אוסטאובלסטים כדי לחקור עיצוב מחדש של עצם תחת כוח אורתודונטי ומתארים שיטות לניתוח עיצוב מחדש של עצם מכתשית במהלך OTM, ובכך שופכים אור על הביולוגיה המכנית של השלד.

Protocol

כל השיטות המערבות בעלי חיים המתוארות כאן אושרו על ידי ועדת האתיקה של בית החולים העממי התשיעי בשנחאי, בית הספר לרפואה של אוניברסיטת ג'יאו טונג בשנגחאי (מס '82101048).

1. ביסוס עכברי נוקאאוט ספציפיים לשושלת אוסטאובלסטים אינדוקציה Stat3

הערה: עכברי Stat3 fl/fl הושגו באופן מסחרי; זן Col1α2CreERT2היה מתנה (ראו טבלת חומרים לכל הפרטים). כדורי מעבדה מתוקננים מזון ומים ותנאי מעבדה סביבתיים סטנדרטיים (טמפרטורת החדר ב 22 ° C עד 26 ° C ולחות ב 50%-55%) סופקו לכל בעלי החיים.

  1. שימו עכבר זכר אחד בוגר מינית עם שתי נקבות עכברים באותו כלוב. לאחר 18 יום, לבדוק עבור תינוקות כל יום. הוציאו עכברות הרות לכלוב ריק והחזיקו אותן לבד במידת הצורך. הכניסו עכברות זכרים לכלובי רבייה שונים אחרים אם נקבות העכברות אינן בהריון תוך 30 יום.
  2. צור Stat3fl/+; עכברי Col1α2 CreERT2 על ידי הכלאה של עכברי Stat3 fl/ fl עם עכברי Col1α2CreERT2; לשמור את כל העכברים האלה על רקע C57BL/6. לאסוף 2-5 מ"מ קצות זנב עבור גנוטיפ ולשמור על זכר Stat3fl/+; Col1α2CreERT2 עכברים עד שהם בוגרים מינית (F1).
  3. הכלאה זכר בן 6 שבועות Stat3fl/ +; Col1α2CreERT2 עכברים עם נקבת עכברי Stat3 fl/fl. לאסוף 2-5 מ"מ קצות זנב כאשר עכברים הם 2 שבועות עבור genotyping, ולשמור על זכר Stat3 fl/ fl; Col1α2 CreERT2(Stat3,Col1α2ERT2) עכברים עד שהם בוגרים מינית (F2).
  4. הכלאה זכר בן 6 שבועות Stat3 fl/ fl; Col1α2CreERT2 עכברים עם נקבת עכברי Stat3 fl/fl (F3). אספו קצות זנב בקוטר 2-5 מ"מ כאשר עכברים בני שבועיים לצורך גנוטיפ, והשתמשו בעכברים הצעירים יותר מאותו גנוטיפ כדי להחליף עכברים מבוגרים יותר בעת הצורך (F3+N).
    הערה: יכולת הרבייה של עכברים יורדת לאחר גיל 8 חודשים, ולכן יש לעקוב בקפידה אחר העכברים בכלובי הרבייה ולהחליפם לפי הצורך. בנוסף, על פי דרישות הניסוי, יש להגדיל כראוי את מספר כלובי הרבייה כדי למנוע הכחדה של עכברי גן המטרה.

2. מחיקה מושרית של Stat3 באוסטאובלסטים המבטאים Col1α2 על ידי טמוקסיפן

  1. ממיסים טמוקסיפן בשמן תירס ל-20 מ"ג/מ"ל בצינור צנטריפוגה, ומגנים מפני אור על ידי עטיפה בנייר כסף. מניחים את צינור הצנטריפוגה המכוסה בנייר כסף על מיקסר סיבובי ומערבבים בטמפרטורת החדר עד להמסה מלאה.
    הערה: טמוקסיפן הושג באופן מסחרי ואוחסן בחושך ב 4 °C (75 °F).
  2. בחר עשרה עכברים זכרים בני 6 שבועות וחלק אותם לקבוצות Stat3 fl/fl ו- Stat3Col1α2ERT2 עם חמישה עכברים בכל קבוצה. לנהל טמוקסיפן (100 מ"ג·kg-1·bw) כל יומיים במשך שבוע על ידי הזרקה intraperitoneal.

3. מודל תנועת שיניים אורתודונטית (OTM)

  1. הכינו משטח דיסקציה מעוקר של עכברי פלסטיק כשולחן ניתוחים כדי לשתק את העכברים.
    הערה: שולחן נתיחת העכבר הושג באופן מסחרי והורכב מארבעה עמודי גומי מתכווננים ומוט מתכת אחד לשיתוק העכברים. השתמש במכשירים וכלים סטריליים לאורך כל ההליך.
  2. חברו רצועה אלסטית לכל עמוד גומי לצורך קיבוע הגפיים.
  3. קשרו רצועה אלסטית אחת בין שני עמודי הגומי העליונים; לקשור חוט לרצועה האלסטית כדי להחזיק את החותכות התחתונות; ולקשור חוט נוסף למוט המתכת כדי להחזיק את החותכות העליונות.
  4. מרדימים עכברים זכרים בני 7 שבועות בתמיסת 0.1 מ"ל של דקסמדטומידין הידרוכלוריד (0.1 מ"ג·kg-1·bw) וזולטיל (tiletamine hydrochloride עבור 20 מ"ג·kg-1·bw וזולאזפאם הידרוכלוריד עבור 20 מ"ג·kg-1·bw) מומסים במי מלח על ידי הזרקה תוך צפקית לפני הניתוח. יש לוודא כי העכברים נמצאים תחת הרדמה מתאימה לאורך כל הניתוח.
    הערה: שים לב לתאריך השימוש היעיל בסמים, ואל תשתמש בתרופות שפג תוקפן.
  5. ודא כי העכברים נמצאים תחת הרדמה מתאימה על ידי לחיצה על אצבעות הגפיים האחוריות עם האצבעות.
    הערה: אם העכברים אינם מגיבים לבדיקה, פירוש הדבר שהם מחוסרי הכרה וההרדמה הגיעה לעומק הרצוי. באותו זמן, העכברים נמצאים במצב של הרפיה שרירי הגפיים, עם נשימה חלקה וקצב הלב, וניתן להתחיל את הפעולה.
  6. השתמשו במשחה וטרינרית על עיני העכברים כדי למנוע יובש והניחו את העכבר המרדים במצב שכיבה על שולחן הניתוחים. השתמש בארבע גומיות אלסטיות על עמודי הגומי כדי לקבע את הגפיים, חוט אחד מחובר למוט המתכת כדי להחזיק את החותכות העליונות וחוט נוסף מחובר לרצועה אלסטית בין שני עמודי הגומי העליונים כדי להתחבר מעל החותכות התחתונות כדי להחזיק את הלסת התחתונה פתוחה.
  7. הכינו קפיצי סליל סגורים (גודל חוט 0.25 מ"מ, קוטר 0.76 מ"מ, אורך 1 מ"מ) למכשיר כוח אורתודונטי.
    הערה: גזור שמונה חוטי קפיץ עבור כל עכבר. ארבעה חוטים באורך 1 מ"מ באמצע למכשיר כוח ושני חוטים בכל קצה לקשירה באמצעות חוט ליגטורה מפלדה.
  8. לקשור קצה אחד של הקפיץ מוכן לטוחנת הראשונה השמאלית המקסילרית. חברו את הקצה השני לחותכת המרכזית באמצעות חוט ליגטורה מפלדה בקוטר 0.1 מ"מ המחוזק בשרף משקם מרפא אור לאחר מריחת דבק על החותכות עם קצה ה-Q ליצירת כוח יציב בעוצמה של 10 גרם הנמדד באמצעות דינמומטר.
  9. לאחר סיום הניתוח, הכניסו את העכברים לכלוב עם אחרים מאותו זן בהתאוששות, או הכניסו כל עכבר לכלוב ריק בלבד. יש לוודא שהעכברים אינם נותרים ללא השגחה עד שהם חזרו להכרה מספקת 2-4 שעות לאחר הניתוח כדי לשמור על עצם החזה. במשך הימים הקרובים, להאכיל את העכברים דיאטה רכה ולצפות בהם באופן קבוע כדי להבטיח כי לא מתרחשים סיבוכים כדי לברר את מידת הכאב לאחר הניתוח; לתת תרופות משככי כאבים לפי הצורך.
    הערה: אין להחזיר עכברים שעברו ניתוח לחברתם של עכברים אחרים עד להחלמה מלאה. אין להכניס עכברים לאחר ניתוח להתאוששות עם עכברים שאינם מורדמים. עכברים חייבים להישמר חמים במהלך ההתאוששות.
  10. בדוק את המכשיר האורתודונטי מדי יום והרחק עכברים ניסיוניים עם תזוזת.

4. אוסף דגימות

  1. הרדימו את העכברים בשלוש נקודות זמן שונות באמצעות פריקת צוואר הרחם: 4 ימים (d4), 7 ימים (d7) ו-10 ימים (d10) לאחר תחילת OTM.
  2. השתמש מספריים אופתלמיים לחתוך את העור אנכית מאזור צוואר הרחם ולאחר מכן להפריד את הראש מהגוף עם כל העור של הראש מנותח.
  3. חותכים את העור ואת שרירי הבוצ'ינטור מהאנגולוס אוריס הדו-צדדי לאזור האחורי של הלסת התחתונה. נתק לחלוטין את שרירי buccal ואת הגידים המחוברים coracoids כדי להסיר את הלסת ולקצץ עצמות נוספות כדי לקבל maxillae שלם. לאחר מכן, להסיר את העצם מאחורי טוחנות שלישי דו צדדי לקרוע את רירית palatal. לבסוף, נתקו את המכשיר האורתודונטי וחתכו את העצם בין החותכות לאורך תפר הפלטין החציוני כדי לקבל את עצם הנאדית של צד ימין וצד שמאל.
    הערה: יש לוודא שהאזור שבין החותכות לטוחנת השלישית נשמר שלם משני הצדדים.

5. הכנה לסעיף פרפין

  1. קיבוע: לטבול את עצם הנאדית שנקטפה בפרפורמלדהיד 4% למשך 48 שעות ולקצץ עם מספריים אופתלמיים במכסה האדים עבור מקטעים 6 ו -7.
  2. הסתיידות: שטפו בעדינות דגימות עם 1x PBS למשך 3 x 10 דקות. Decalcify את הדגימות ב אוניברסלי רקמות קיבוע (pH 8.0), מוחלף עם פתרון טרי כל 2 ימים, במשך 5 שבועות עד העצמות ניתן לחדור בקלות על ידי קצה מחט.
  3. התייבשות: שטפו דגימות ב-1x PBS במשך 3 x 10 דקות, ולאחר מכן טבלו אותן ברצף ב-95% אתנול, 100% אתנול וקסילן, במשך 2 x 1 שעות כל תמיסה.
  4. יש לטבול את הדגימות בתערובת של 1:1 של קסילן ופרפין למשך 30 דקות ולאחר מכן בפרפין בטמפרטורה של 65°C למשך הלילה.
  5. הטבעה: בחר מיכלי הטבעה מתאימים. מקם את עצם הנאדית באופן אחיד עם השיניים למעלה באותה רמה. הסר את הדגימות ממיכל ההטבעה והעבר אותן למקפיא -20 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן מספר אותן כאשר הפרפין מקורר לחלוטין ומוצק.
  6. בעזרת מיקרוטום, חותכים עשרים עד ארבעים חלקים בעובי 4 מיקרומטר ברציפות במישור הרוחבי וצפים על מים בטמפרטורה של 37°C. מצמידים את החלקים לשקופיות במיקרוסקופ ואופים ב-18 מעלות למשך הלילה.

6. מדידת מרחק OTM

  1. צלמו דגימות משלוש נקודות זמן אנכית מהמישור הנסתר באמצעות מיקרוסקופ סטריאו.
  2. סרוק את עצם הנאדית באמצעות סורק Micro-CT. שחזור תמונות תלת ממדיות של מישור הקשת המרבי של עצם הנאדית המקסילרית, בהן שלוש טוחנות גלויות לחלוטין, באמצעות התוכנה התומכת של הסורק בהתאם להוראות היצרן.
  3. מדוד את מרחק OTM באמצעות תוכנת ImageJ:
    1. פתח את תוכנת ImageJ והשתמש בכלי קו ישר כדי ליצור קטע קו של מרחק ידוע.
    2. לחצו על ' נתח ' ובחרו ' קבע קנה מידה ' כדי להזין את הערך של מרחק הקו המצויר ב'מרחק ידוע ' והזינו יחידות ב'יחידת אורך'.
    3. צייר קו בין נקודות האמצע של רכס השוליים המזיאלי של M2 לבין הרכס השולי הדיסטלי של M1 ולחץ על מדידה. התוצאות המוצגות בעמודה אורך מייצגות את מרחק OTM.

7. ניתוח היסטולוגי

  1. בחירת אזור עניין (ROI): הגדר את עצם הנאדית של הטוחנת הראשונה (M1) כהחזר השקעה, הממוקמת בדיוק בתוך שלושה שורשים של M1 בחלק הרוחבי בעצם המקסילרית. אזור זה לא רק מגיע לעצם קליפת המוח של הטוחנת הראשונה בכיוון הבוקאלי-לשוני, אלא גם משתרע עד אמצע הציר הארוך של השורש המסיובוקי, כולל חצי השטח שבין השורש הדיסטובוקלי לשורש החיך.
  2. ניתוח של אוסטאוגנזה
    1. Calcein ו alizarin אדום תיוג כפול וניתוח
      1. הכנת קלצין ואליזרין אדום: ממיסים קלצאין בתמיסת 2% NaHCO3 ל-1 מ"ג/מ"ל ואליזרין אדום S ב-H 2 O עד2מ"ג/מ"ל.
        הערה: במחקר זה, calcein ו alizarin אדום הושגו באופן מסחרי.
      2. מתן קלצאין (20 מ"ג·kg-1·bw) ביום הראשון ואליזרין אדום S (40 מ"ג·kg-1·bw) ביום 8 על ידי הזרקה intraperitoneal לאחר תחילת OTM. הרדימו את העכברים ביום ה-10 וקצרו את עצם הנאדית.
      3. הכינו דגימות והטמיעו אותן לפי שלבים 5.1 ו-5.3-5.5. לפרטים נוספים, עיין ב- Yang et al.30.
      4. באמצעות מיקרוטום סיבובי, חותכים מקטעים בעובי 5 מיקרומטר ברציפות במישור הרוחבי. הדביקו את החלקים לשקופיות מיקרוסקופ והרכיבו עם כיסויים באמצעות בלסם ניטרלי.
        הערה: את שאר הדגימות יש לאחסן עם חומר מייבש בטמפרטורת החדר.
      5. לבחון ולצלם את המקטעים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי ולחשב את קצב הקצאת המינרלים (MAR) וקצב היווצרות העצם (BFR/BS) על פי השיטה שתוארה קודם לכן30.
    2. אימונופלואורסנציה
      1. בחרו נתחי פרפין מתאימים ואופים בחום של 180 מעלות במשך 30 דקות.
      2. Dewaxing: לטבול את החלקים בקסילן במשך 5 דקות ולחזור על הפעולה פעמיים עם קסילן טרי בכל פעם.
      3. התייבשות: יש לטבול את החלקים ברצף ב-95% אתנול, 75% אתנול, 50% אתנול ו-ddH2O, כל אחד למשך 5 דקות.
      4. שטפו בעדינות את החלקים עם 1 x PBS במשך 2 x 5 דקות.
      5. אחזור אנטיגן: יש לטבול את החלקים בתערובת של Tris-HCl (0.05 M, pH 8.0), EDTA (0.01 M, pH 8.0) ופרוטאז K (10 מיקרוגרם/מ"ל) ב-ddH2O ולדגור ב-37°C למשך 15 דקות.
      6. שטפו בעדינות את החלקים עם 1 x PBS במשך 3 x 5 דקות.
      7. בלוק: מוציאים נוזל נוסף מהחלקים ומציירים עיגול סביב אזור המטרה באמצעות סמן הידרופובי. כדי לחסום קשירה לא ספציפית, מכסים בחיץ חוסם המכיל אלבומין בסרום בקר 10% ודגרים בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת.
        הערה: היזהר לא לייבש את המקטעים במשך זמן רב מדי, כדי לא להשפיע על התוצאות.
      8. דגירה ראשונית של נוגדנים: לדלל את הנוגדן נגד אוסטיאופונטין (OPN) עם נוגדן מדלל לריכוז המומלץ, ולהוסיף 30-50 μL לכל דגימה; יש לדגור ב-4°C (75 °F) למשך הלילה בתא לח.
        הערה: הקפד להשאיר מעט מים בתא ולכסות אותם כדי למנוע מנוזל הנוגדנים להתאדות.
      9. שטפו בעדינות את החלקים עם 1 x PBS במשך 3 x 10 דקות.
        הערה: שלבים 7.2.2.10-7.2.2.12 יש לבצע בחושך.
      10. דגירה שניונית פלואורסצנטית: יש לבחור נוגדן פלואורסצנטי משני מתאים המתאים לנוגדן הראשוני ולדלל אותו לריכוז המומלץ. יש להוסיף 30-50 μL לכל דגימה ולדגור בטמפרטורת החדר למשך שעה.
      11. שטפו בעדינות את המקטעים עם 1 x PBS במשך 2 x 10 דקות.
      12. השתמש באמצעי הרכבה נגד דהייה עם 4'6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) כדי להרכיב את הדגימות. אחסנו את המדורים בחושך וצלמו אותם בהקדם האפשרי.
      13. בצע מיקרוסקופ פלואורסצנטי המשלב מצלמה דיגיטלית כדי לבחון ולצלם את המקטעים ולספור תאים חיוביים באזורי העניין (ROIs).
  3. ניתוח של osteoclastogenesis
    1. צביעת חומצה פוספטאז עמידה לטרטרט (TRAP)
      1. בחר קטעי פרפין מתאימים. Dewax ו rehydrate בצע שלבים 7.2.2.1-7.2.2.3.
      2. הכינו תמיסת צביעה טרייה באמצעות ערכת צביעה TRAP בהתאם להוראות היצרן וחממו מראש ל-37°C.
      3. יש להוסיף 30-50 מיקרוליטר של תמיסת צביעה לכל דגימה ולדגור בטמפרטורה של 37°C בתא לח למשך 20-30 דקות. בדוק כל 5 דקות עד אוסטאוקלסטים אדומים מרובי גרעינים נראים תחת מיקרוסקופ אור. עצור את התגובה עם ddH2O.
      4. כתם נגדי בתמיסת המטוקסילין למשך 30 שניות וטבילה בתמיסת אמוניה 1% למשך דקה אחת לקבלת צבע כחול יציב. יש לשטוף במי ברז הזורמים באיטיות.
      5. הרכיבו את החלקים עם כיסויים באמצעות בלסם ניטרלי וייבשו למשך הלילה.
      6. צלם תמונות תחת מיקרוסקופ וספור את מספר התאים החיוביים ל- TRAP עם יותר משלושה גרעינים, בהתאם לפרוטוקול30 הקודם שלנו.
    2. Immunofluorescence: השתמש בנוגדן Cathepsin K (CTSK) בריכוז המומלץ עבור immunofluorescence ופעל לפי הפרוטוקול המתואר בסעיף 7 לעיל.

תוצאות

באמצעות פרוטוקול זה, ביססנו מודל של עכבר נוקאאוט Stat3 ספציפי לשושלת אוסטאובלסטים (Stat3Col1α2ERT2) כדי לבחון את ההשפעות של מחיקת STAT3 על עיצוב מחדש של עצם מכתשית המונעת על ידי כוח אורתודונטי (איור 1A,B). מחיקת STAT3 באוסטאובלסטים אושרה על-ידי צביעה אימונופלואורס?...

Discussion

מכיוון שחסימה היא בין הפרעות הפה הנפוצות ביותר הפוגעות בנשימה, במסטיקציה, בדיבור ואפילו במראה, הביקוש ליישור שיניים עולה מיום ליום כאשר התחלואה עולה מ-70% ל-93% על פי סקר אפידמיולוגי קודם31,32. כיצד להאיץ שיפוץ עצם מכתשית כדי להעלות את היעילות של טיפול אורתודונט?...

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי מענקים מהקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (81870740, 82071083, 82271006, 82101048, 81800949); הקרן למדעי הטבע של שנחאי (21ZR1436900, 22ZR1436700); התוכנית של מוביל מחקר אקדמי / טכנולוגי בשנחאי (20XD1422300); תוכנית מחקר קליני של SHDC (SHDC2020CR4084); קרן המחקר הבין-תחומית של בית החולים העממי התשיעי בשנחאי, בית הספר לרפואה של אוניברסיטת ג'יאו טונג בשנגחאי (JYJC201902, JYJC202116); צוות מחקר החדשנות של אוניברסיטאות מקומיות ברמה גבוהה בשנחאי (SSMUZLCX20180501); קרן דיסציפלינה למחקר מס' KQYJXK2020 מבית החולים העממי התשיעי, בית הספר לרפואה של אוניברסיטת ג'יאו טונג בשנחאי והמכללה לסטומטולוגיה, אוניברסיטת ג'יאו טונג בשנחאי; פרויקט חקר מקורי של בית החולים העממי התשיעי בשנחאי, בית הספר לרפואה של אוניברסיטת ג'יאו טונג בשנגחאי (JYYC003); פרויקט מאתיים כישרונות של בית הספר לרפואה של אוניברסיטת ג'יאו טונג בשנחאי; פרויקט המחקר השיתופי של המכון לביו-חומרים ורפואה רגנרטיבית בשנחאי בית הספר לרפואה של אוניברסיטת ג'יאו טונג (2022LHB02); פרויקט הביובנק של בית החולים העממי התשיעי בשנחאי, בית הספר לרפואה של אוניברסיטת ג'יאו טונג בשנגחאי (YBKB201909, YBKB202216).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1x PBSBeijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd. P1020
4% paraformaldehydeWuhan Servicebio Technology Co., Ltd.G1101
Alizarin redSigma-AldrichA5533
Anti-CTSK antibodySanta Cruzsc-48353
Anti-OPN antibodyR&D Systems, Minneapolis, MN, USAAF808
CalceinSigma-AldrichC0875
Closed-coil springsInnovative Material and Devices, Shanghai, ChinaCS1006B
Col1α2CreERT2 miceA gift from Bin Zhou, Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences.
Dexmedetomidine hydrochlorideOrionintie Corporation, Orion Pharma Espoo site
EDTABeyotime BiotechanologyST069
Embedding tanksCitotest Labware Manufacturing Co., Ltd80106-1100-16
EthanolSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.100092183
ImageJ softwareNIH, Bethesda, MD, USA
Mounting medium with DAPIBeyotime BiotechanologyP0131
Mouse dissection platformShanghai Huake Experimental Devices and Materials Co., Ltd.HK105
ParaffinSangon biotech Co., Ltd.A601889
Primers for genotypingStat3 F-TTGACCTGTGCTCCTACAAAAA; Stat3 R-CCCTAGATTAGGCCAGCACA; Cre F-CGATGCAACGAGTGATGAGG; Cre R-CGCATA ACCAGTGAAACAGC
Protease KSigma-Aldrich539480
Self-curing restorative resin3M ESPE, St. Paul, MN, USA712-035
Stat3fl/fl miceGemPharmatech Co., LtdD000527
TamoxifenSigma-AldrichT5648
TRAP staining kitSigma-Aldrich387A
Tris-HClBeyotime BiotechanologyST780
Universal tissue fixativeWuhan Servicebio Technology Co., Ltd.G1105
XyleneSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.10023418
ZoletilVIRBAC 

References

  1. Frost, H. M. The Utah paradigm of skeletal physiology: an overview of its insights for bone, cartilage and collagenous tissue organs. Journal of Bone and Mineral Metabolism. 18 (6), 305-316 (2000).
  2. Frost, H. M. Wolff's Law and bone's structural adaptations to mechanical usage: an overview for clinicians. The Angle Orthodontist. 64 (3), 175-188 (1994).
  3. Gothlin, G., Ericsson, J. L. The osteoclast: review of ultrastructure, origin, and structure-function relationship. Clinical Orthopaedics and Related Research. (120), 201-231 (1976).
  4. Feng, X., Teitelbaum, S. L. Osteoclasts: New Insights. Bone Research. 1 (1), 11-26 (2013).
  5. Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. Osteoclast differentiation and activation. Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).
  6. Zhu, L. X., et al. Osteoclast-mediated bone resorption is controlled by a compensatory network of secreted and membrane-tethered metalloproteinases. Science Translational Medicine. 12 (529), eaaw6143 (2020).
  7. Dai, Q., et al. A RANKL-based osteoclast culture assay of mouse bone marrow to investigate the role of mTORC1 in osteoclast formation. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (133), 56468 (2018).
  8. Karsenty, G., Kronenberg, H. M., Settembre, C. Genetic control of bone formation. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 25, 629-648 (2009).
  9. Long, F. Building strong bones: molecular regulation of the osteoblast lineage. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 13 (1), 27-38 (2011).
  10. Harada, S., Rodan, G. A. Control of osteoblast function and regulation of bone mass. Nature. 423 (6937), 349-355 (2003).
  11. Lang, T., et al. Cortical and trabecular bone mineral loss from the spine and hip in long-duration spaceflight. Journal of Bone and Mineral Research. 19 (6), 1006-1012 (2004).
  12. Sibonga, J. D. Spaceflight-induced bone loss: is there an osteoporosis risk. Current Osteoporosis Reports. 11 (2), 92-98 (2013).
  13. Yang, Y., et al. Administration of allogeneic mesenchymal stem cells in lengthening phase accelerates early bone consolidation in rat distraction osteogenesis model. Stem Cell Research and Therapy. 11 (1), 129 (2020).
  14. Huang, C., Holfeld, J., Schaden, W., Orgill, D., Ogawa, R. Mechanotherapy: revisiting physical therapy and recruiting mechanobiology for a new era in medicine. Trends in Molecular Medicine. 19 (9), 555-564 (2013).
  15. Shu, H. S., et al. Tracing the skeletal progenitor transition during postnatal bone formation. Cell Stem Cell. 28 (12), 2122-2136 (2021).
  16. Wang, X., et al. miR-214 targets ATF4 to inhibit bone formation. Nature Medicine. 19 (1), 93-100 (2013).
  17. Huja, S. S., Fernandez, S. A., Hill, K. J., Li, Y. Remodeling dynamics in the alveolar process in skeletally mature dogs. The Anatomical Record. Part A, Discoveries in Molecular, Cellular, and Evolutionary Biology. 288 (12), 1243-1249 (2006).
  18. Jin, A., et al. FOXO3 mediates tooth movement by regulating force-induced osteogenesis. Journal of Dental Research. 101 (2), 196-205 (2022).
  19. Bumann, A., Carvalho, R. S., Schwarzer, C. L., Yen, E. H. Collagen synthesis from human PDL cells following orthodontic tooth movement. European Journal of Orthodontics. 19 (1), 29-37 (1997).
  20. Kitaura, H., et al. Effect of cytokines on osteoclast formation and bone resorption during mechanical force loading of the periodontal membrane. The Scientific World Journal. 2014, 617032 (2014).
  21. Lu, W., et al. Sclerostin injection enhances orthodontic tooth movement in rats. Archives of Oral Biology. 99, 43-50 (2019).
  22. Seki, Y., et al. Differentiation ability of Gli1(+) cells during orthodontic tooth movement. Bone. 166, 116609 (2023).
  23. Gong, X. Y., et al. Local orthodontic force initiates widespread remodelling of the maxillary alveolar bone. Australasian Orthodontic Journal. 36 (2), 175-183 (2020).
  24. Liu, Y., et al. STAT3 and its targeting inhibitors in osteosarcoma. Cell Proliferation. 54 (2), e12974 (2021).
  25. Guadagnin, E., Mazala, D., Chen, Y. W. STAT3 in skeletal muscle function and disorders. International Journal of Molecular Sciences. 19 (8), 2265 (2018).
  26. Saikia, B., et al. Clinical profile of hyper-IgE syndrome in India. Frontiers in Immunology. 12, 626593 (2021).
  27. van de Veen, W., et al. Impaired memory B-cell development and antibody maturation with a skewing toward IgE in patients with STAT3 hyper-IgE syndrome. Allergy. 74 (12), 2394-2405 (2019).
  28. Zhou, S. R., et al. STAT3 is critical for skeletal development and bone homeostasis by regulating osteogenesis. Nature Communications. 12 (1), 6891 (2021).
  29. Gong, X. Y., et al. Osteoblastic STAT3 is crucial for orthodontic force driving alveolar bone remodeling and tooth movement. Journal of Bone and Mineral Research. 38 (1), 214-227 (2023).
  30. Yang, Y., et al. Skeletal phenotype analysis of a conditional Stat3 deletion mouse model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (161), 61390 (2020).
  31. Egic, B. Prevalence of orthodontic malocclusion in schoolchildren in Slovenia. A prospective aepidemiological study. European Journal of Paediatric Dentistry. 23 (1), 39-43 (2022).
  32. Gois, E. G., et al. Incidence of malocclusion between primary and mixed dentitions among Brazilian children A 5-year longitudinal study. The Angle Orthodontist. 82 (3), 495-500 (2012).
  33. Yang, F., et al. Effects Of triptolide on tooth movement and root resorption in rats. Drug Design, Development and Therapy. 13, 3963-3975 (2019).
  34. Wang, C., Sun, H. Progress in gene knockout mice. Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao. 35 (5), 784-794 (2019).
  35. Cao, H., et al. Force-induced Adrb2 in periodontal ligament cells promotes tooth movement. Journal of Dental Research. 93 (11), 1163-1169 (2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

197STAT3CT

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved