JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

רקמת השומן היא מקור מצוין לתאי גזע מזנכימליים. כאן, אנו מביאים את המיצוי, הטיפוח והאפיון שלב אחר שלב של תאי גזע שמקורם ברקמת שומן (ADSCs) מרקמת שומן אפידידימלית של עכברים שוויצרים.

Abstract

תאי גזע מזנכימליים (MSCs) נחקרו בהרחבה כגישה טיפולית חדשה, בעיקר כדי לעצור דלקת מחמירה בשל הפוטנציאל שלהם לווסת את התגובה החיסונית. MSCs הם תאים בעלי זכויות חיסון המסוגלים לשרוד במושתלים אלוגניים שאינם תואמים אימונולוגית בהתבסס על ביטוי נמוך של מולקולות מורכבות היסטותאימות עיקריות מסוג I (MHC) ובשימוש בטיפול תאי להשתלה אלוגנית. תאים אלה יכולים להיות מבודדים ממספר רקמות, כאשר הנפוץ ביותר הוא מח העצם ורקמות השומן. אנו מספקים פרוטוקול קל לבידוד, תרבית ואפיון MSCs מרקמת שומן אפידידימלית של עכברים. רקמת השומן האפידידימלית נכרתת בניתוח, מקוטעת פיזית ומתעכלת בתמיסת 0.15% קולגן מסוג II. לאחר מכן, תאי גזע ראשוניים שמקורם ברקמת שומן (ADSCs) מתורבתים ומורחבים במבחנה, והאפיון הפנוטיפי מתבצע על ידי ציטומטריית זרימה. אנו מספקים גם את השלבים להתמיין ADSCs לתאים אוסטאוגניים, אדיפוגניים וכונדרוגניים, ולאחר מכן אפיון פונקציונלי של כל שושלת תאים. הפרוטוקול המסופק כאן יכול לשמש לניסויים in vivo ו - ex vivo , וכחלופה, תאי גזע שמקורם בשומן יכולים לשמש ליצירת תאים אימורטליים דמויי MSCs.

Introduction

תאי גזע מזנכימליים (MSCs) הם תאים רב-פוטנציאליים בוגרים המתמיינים לתאים כגון אוסטאובלסט, כונדרובלסט ואדיפוציט 1,2. תאים אלה שוכנים במספר איברים, ובגלל זה, הם יכולים להיות מופקים מרקמות בוגרות כגון מח עצם, שריר, שומן, זקיק שיער, שורש השן, שליה, דרמיס, פריכונדריה, חבל הטבור, ריאות, כבד, טחול 3,4.

ההשפעות של MSCs על הפיזיולוגיה והמערכת החיסונית דווחו 5,6. תאים אלה היו מבטיחים לטיפול במספר מחלות, הן ברפואה האנושית והן ברפואה הווטרינרית. MSCs יכולים לשלוט בדלקת ולקדם אנגיוגנזה והומאוסטזיס רקמות באמצעות מנגנונים שונים, כגון מגע בין תאים, גורמים מסיסים ובועיות חוץ-תאיות קטנות 7,8,9,10. יתר על כן, MSCs הם תאים בעלי זכויות חיסון המסוגלים לשרוד אצל מושתלים אלוגניים שאינם תואמים אימונולוגית מכיוון שתאים אלה מראים ביטוי נמוך של מולקולות מורכבות היסטותאימות עיקריות מסוג I (MHC) ומשמשים בטיפול מבוסס תאים להשתלה אלוגנית11,12. האימונוגניות הנמוכה בשילוב עם הפוטנציאל הרגנרטיבי הופכת MSCs למועמדים אידיאליים לטיפול תאי, כגון מחלת השתל נגד המאכסן (GvHD)13, זאבת אדמנתית מערכתית (SLE)14, וטרשת נפוצה15, בין היתר16,17.

למרות העובדה כי MSCs שוכנים במספר רקמות בוגרות, רקמת השומן מציעה יתרונות על פני מקורות אחרים, כגון נגישות לקציר, עם התערבות כירורגית מינימלית; מספר גדול של תאים זמינים עם קצב התפשטות גבוה; והרחבה קלה במבחנה באמצעות פרוטוקול קל לביצוע ללא צורך בציוד ספציפי וחומרים בעלות נמוכה 18,19,20. לאחר החילוץ, יש לאפיין את תאי הגזע שמקורם ברקמת השומן (ADSCs) כפי שהוקם על ידי האגודה הבינלאומית לטיפול תאי (ISCT)21. לפיכך, MSCs חייבים להראות מורפולוגיה דמוית פיברובלסט, דבקות בתרבית פלסטית, המבטאת אחוז גבוה (≥95%) של סמנים מזנכימליים כגון אנדוגלין (CD105), ecto-5'-nucleotidase (CD73) ו- Thy-1 (CD90), ואחוז נמוך (≤2%) של סמנים hematopoietic כגון אנטיגן משותף לויקוציטים (CD45), פוספוגליקופרוטאין transmembrane (CD34), גליקופרוטאין קרום מעוגן גליקוליפיד (CD14), integrin alpha M (CD11b), שרשרת אלפא חלבון משויך קולטן אנטיגן B (CD79α) או B-לימפוציטים פני השטח אנטיגן B4 (CD19) ואנטיגן לויקוציטים אנושי סוג II (HLA-II). יתר על כן, נדרש אפיון פונקציונלי, והתאים צריכים להיות מסוגלים להתמיין לתאי אוסטאובלסט, כונדרובלסטים או אדיפובלסטים21.

כאן, אנו מראים כיצד להשיג את MSCs מרקמת שומן אפידידימלית באמצעות דיסוציאציה מכנית ועיכול אנזימטי עבור מחקרי מבחנה והאפיון המורפולוגי שנקבע מראש על ידי ISCT.

Protocol

כל הניסויים בבעלי חיים נערכו על פי הנחיות בינלאומיות לאתיקה של בעלי חיים ואושרו על ידי ועדות מוסדיות לטיפול ושימוש מאוניברסיטת המדינה של סנטה קרוז תחת פרוטוקול מספר 021/22. עכברים זכרים שוויצרים (6-8 שבועות) נרכשו מהמעבדה להרבעה, תחזוקה וניסויים בבעלי חיים - מתקן מחקר בעלי חיים של אוניברסיטת סנטה קרוז (LaBIO-UESC), מתוחזקים בתנאים ספציפיים נטולי פתוגנים, ומקבלים מים ומזון עם מחזורי אור / חושך של 12 שעות.

הערה: ניתן להשתמש בשושלת עכברים אחרת; אנו ממליצים על שימוש בעכברים בוגרים (6-8 שבועות) מכיוון שיש להם רקמת שומן מפותחת יותר ותאים עם פעילות שגשוג גבוהה.

1. הכנה

הערה: לפני שתמשיך, הכן את הריאגנטים הבאים המתוארים להלן. עיין בטבלת החומרים לקבלת מידע על מגיבים וספקי חומרים. יש ללבוש ציוד מגן אישי כגון מסכות, כובעים, מעילי מעבדה וכפפות בכל ההליכים המעשיים.

  1. מיצוי רקמת שומן אפידידימלית
    1. שמור את חומרי הניתוח: שלושה סטים של פינצטה סטרילית ומספריים, חמש מחטים, וכוס המכילה 200 מ"ל של 70% אתנול.
    2. הכינו חומר הרדמה סופני, תוך ערבוב קטמין (100 מ"ג/ק"ג) וקסילזין (10 מ"ג/ק"ג).
  2. תרבות ADSCs
    1. מדיום בסיסי: הכינו את מדיית הגלוקוז הגבוהה Eagle Medium (DMEM) של Dulbecco בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS), 50 מיקרוגרם/מ"ל גנטמיצין, 0.25 מיקרוגרם/מ"ל אמפוטריצין B, 100 U/מ"ל פניצילין וסטרפטומיצין 100 מ"ג/מ"ל.
    2. תמיסת עיכול: יש להכין 0.15% של collagenase type II ב-PBS מעוקר במסנן של 0.25 מיקרומטר.
      הערה: אין צורך להשתמש בארבע האנטיביוטיקות המתוארות בתווך הבסיסי. זה יהיה תלוי בתנאי תרבית התא של המעבדה שבה זה מבוצע.
  3. אפיון פנוטיפי של ADSCs
    1. הכינו אלבומין בסרום בקר 1% (BSA) ב-PBS.
    2. דללו את הנוגדנים נגד עכברים כפי שמוזכר בטבלה 1.
    3. הכינו פורמלדהיד 2% ב-PBS.
  4. התמיינות אוסטאוגנית של ADSCs
    1. מדיום התמיינות אוסטאוגני: הכינו DMEM בתוספת חומצה אסקורבית 5.67 M, 10 ננומטר דקסמתזון, 0.02 M β-גליצרופוספט, 10% FBS ו-1% פניצילין/סטרפטומיצין.
    2. לצביעת פון קוסה, הכינו את התמיסות הבאות: 70% אתנול במים, 5% כסף חנקתי במים, מים מזוקקים, 5% נתרן תיוסולפט במים ו-1% אאוסין B במים.
  5. בידול אדיפוגני:
    1. מדיום התמיינות אדיפוגני: הכינו DMEM בתוספת 0.5 mM 3-Isobutyl-1-methylxanthine, 200 μM indomethacin, 1 μM dexamethasone, 10 μM אינסולין, 10% FBS, ו 1% פניצילין/סטרפטומיצין.
    2. לצביעת שמן-אדום, הכינו את התמיסות הבאות: 10% פורמלין במים שעברו דה-יוניזציה, 60% איזופרופנול במים שעברו דה-יוניזציה, ליזוכרום (צבע מסיס בשומן) דיאזו (תמיסת Oil-Red O) ב-60% איזופרופנול, ו-1% המטוקסילין במים שעברו דה-יוניזציה.
  6. התמיינות כונדרוגנית:
    1. מדיום התמיינות כונדרוגני: הכינו מדיום כונדרוגני בתוספת 10% FBS ו-1% פניצילין/סטרפטומיצין.
    2. הכינו 10% פורמלדהיד ב-PBS.
    3. לצביעת פרוטאוגליקנים וגליקוזאמינוגליקנים, הכינו את התמיסות הבאות: כתם הטרוגליקן (כחול אלקיאן 1%) בחומצה אצטית, pH 2.5, פרפין, המטוקסילין, דילול סדרת אתנול במים (100%, 96%, 80% ו-70%).

נוגדן/פלואורופורדילולשיבוטריכוז סופי (מק"ג/מ"ל)פונקציה ותא שבו הוא בא לידי ביטוי
CD34- PE1:100RAM342גורם הידבקות תאים. תאי גזע המטופויטיים.
CD45- נגמ"ש1:10030-F112סיוע בהפעלת לויקוציטים. מתבטא לויקוציטים.
CD71- FITC1:100ג25שולט בספיגת ברזל במהלך התפשטות תאים. תאים מתרבים, רטיקולוציטים ותאים מקדימים.
CD29- FITC1:100Ha2/55הידבקות ושפעול, אמבריוגנזה, לויקוציטים, תאים דנדריטיים, טסיות דם, תאי פיטום, פיברובלסטים ותאי אנדותל.
CD90- PerCP1:100OX-72איתות, הדבקה. לימפוציטים מסוג T, NK, מונוציט, תאי גזע המטופויטיים, נוירון ופיברובלסט.

טבלה 1: נוגדנים המשמשים לאפיון פנוטיפי של ADSCs לפי ציטומטר זרימה. רשימת נוגדנים עם פלואורוכרומים, דילולים, שיבוט וריכוז סופי בהתאמה וכן תפקידם בתא המתבטא.

2. שיטות

הערה: רקמת השומן מפוזרת בכל הגוף במקומות תת עוריים או תוך בטניים. בעכברים, רקמות השומן הנפוצות ביותר המשמשות לניסויים כוללות אפידידימלי תת-עורי, מזנטרי ורטרופריטוניאלי22. כאן מוצגים השלבים להשגת רקמת שומן אפידידימלית (איור 1).

figure-protocol-4939
איור 1: תכנון ניסויי להשגת תאי גזע שמקורם ברקמת שומן מעכברים שוויצרים. (א) בעזרת מחטים הניחו את בעל החיים על לוח הפקק או הקלקר; (B) להרים את העור באמצעות פינצטה, לבצע חתך במרכז אזור הבטן ולנתק את העור מהצפק; (ג) לזהות את רקמת השומן הלבנה מעל האפידידימיס; (D) להעביר את הרקמה למדיום DMEM בתוספת 10% FBS ו-1% אנטיביוטיקה, לשטוף את רקמת השומן האפידידימלית ביסודיות עם PBS, ולהעביר את הרקמה לעיכול תמיסה; (E), לפרק את הרקמה ו-(F) לדגור בטמפרטורה של 37°C למשך שעה אחת תוך ניעור נמרץ כל 10 דקות; (G) לאחר ספירת התאים, לוחים בלוחות בעלי 6 בארות ומתבוננים במורפולוגיית התא תחת מיקרוסקופ הפוך. (F) המורפולוגיה של התא תשתנה מעגולה לדמוית פיברובלסט. סרגל קנה מידה = 22.22 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

  1. מיצוי רקמת שומן אפידידימלית
    הערה: שים לב שכל ההליכים חייבים להתבצע בתנאים סטריליים בארון זרימה למינרי על מנת להבטיח תרבית תאים טהורה ונטולת זיהום.
    1. הרדימו את בעלי החיים באמצעות קטמין ותמיסת קסילזין (100 ו-10 מ"ג/ק"ג, כמתואר בשלב 1.1.2) בדרך תוך צפקית.
      הערה: ניתן להשתמש בשיטות המתת חסד אחרות23. ודא שהחיה מתה על ידי אישור היעדר פעימת לב.
    2. הניחו את החיה כשהצד הגחוני פונה כלפי מעלה על לוח שעם או קלקר מכוסה ברדיד אלומיניום וקיבעו אותה באמצעות מחטים סטריליות (איור 1A).
      הערה: כדי למנוע זיהום, יש לרסס 70% אלכוהול באזור הבטן. לחלופין, יש לגלח את השיער בעזרת אזמל.
    3. הרימו את העור באמצעות פינצטה במרכז אזור הבטן ובצעו חתך בעזרת מספריים סטריליים.
      הערה: שני סטים של פינצטה סטרילית ומספריים נחוצים כדי למנוע זיהום. הראשון משמש לפתיחת החיה, חיתוך העור ושכבת הצפק; השני משמש להרים את רקמת השומן epididymal. כמו כן, שמור 150 מ"ל של אלכוהול 70% בכוס כדי לנקות מספריים פינצטה בין צעדים.
    4. הכניסו את המספריים מתחת לעור של החיה ופתחו אותה כדי לנתק אותה מהצפק (איור 1B). מרימים את שכבת הצפק באמצעות פינצטה וחותכים במספריים סטריליים.
    5. השתמש קבוצה נוספת של פינצטה סטרילית ומספריים ולזהות את epididymis מעל האשכים ואת רקמת השומן הלבן מעל epididymis. משכו את כל רקמת השומן האפידידימלית באמצעות פינצטה סטרילית, בגודל של כ-2 ס"מ, וחתכו קרוב מאוד לאפידידימיס (איור 1C).
    6. הכניסו את השומן לתוך צינור חרוטי סטרילי בנפח 50 מ"ל שמכיל תווך בסיסי והניחו אותו על קרח (איור 1D). במכסה המנוע, המשך לשלבים הבאים כמתואר להלן.
  2. בידוד תאי גזע שמקורם ברקמת שומן (ADSCs)
    הערה: עבד את הדגימות במכסה מנוע זרימה למינרית ביולוגית מסוג II, ועל הצוות ללבוש חלוק מעבדה, כפפות ומסכה כירורגית.
    1. לשטוף את רקמת השומן epididymal ביסודיות עם PBS.
      הערה: שלב זה חיוני כדי להסיר את הדם וחלקיקים אחרים מהדגימה. הדם יכול לעכב אנזים קולגנאז מסוג II ולסכן את הניסוי.
    2. באמצעות טוויטר סטרילי, להעביר את רקמת השומן epididymal לתוך צינור 50 מ"ל המכיל 15-20 מ"ל של פתרון digest, מוכן כמו שלב 1.2.2. שברו את הרקמה באמצעות מספריים סטריליים ודגרו על הרקמה בטמפרטורה של 37°C למשך שעה אחת (איור 1E, F).
      הערה: אמבט מים או אינקובטור ב 37 °C (77 °F) ניתן להשתמש בשלב זה. כל 10 דקות, ההשעיה חייב להיות מזועזע במרץ כדי להקל על העיכול. אין להאריך את זמן הדגירה של שעה אחת.
    3. השבת את collagenase על ידי דילול הדגימה 1: 1 בתווך בסיסי צנטריפוגה את המתלה ב 250 x גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C כדי לקבל את החלק הווסקולרי של סטרומה. יש להשליך את הסופרנאטנט ולהשהות מחדש את הגלולה ב-1 מ"ל של מדיום בזאלי.
    4. בדקו את הכדאיות וספרו את התאים בשיטת הרחקת הצבע הכחול טריפאן בתא נויבאואר באמצעות דילול של 1:10 או 1:100.
      הערה: התשואה הצפויה היא סביב 0.5-1 מיליון תאים/גרם של רקמת שומן מעובדת וכדאיות של 80%.
    5. צלחת את התאים המבודדים (0.3-0.5 מיליון) ב 3 מ"ל של מדיום בסיסי בבאר אחת של צלחת 6 בארות. לדגור על התאים לילה ב 37 ° C עם 5% CO2.
    6. למחרת: מוציאים את המדיום מהבאר ושוטפים את התאים עם PBS. מוסיפים 3 מ"ל של מדיום בסיסי. חזור על תהליך זה כל יומיים עד שהתאים הופכים למפגש של 90%.
      הערה: תמיד התבוננו במורפולוגיה של התאים מתחת למיקרוסקופ ההפוך, המשתנה מעגול לדמוי פיברובלסט (איור 1H).
  3. הרחבת תאי גזע שמקורם ברקמת שומן (ADSCs)
    הערה: ברגע שהתאים גדלים ~ 90% נפגשים, המשך לתת-תרבית כמתואר להלן.
    1. הסר את המדיום מן הבאר ולשטוף את התאים עם PBS. הוסיפו 0.5 מ"ל/באר של טריפסין/EDTA (0.05% טריפסין; 200 מ"ג/ליטר EDTA) ודגרו על הצלחת למשך 3-5 דקות ב-37°C כדי לנתק את התאים.
      הערה: אין לחרוג מ-5 דקות במינון טריפסין/EDTA. יש לאמת את הניתוק המלא של התאים תחת המיקרוסקופ ההפוך. ניתן להאיץ את התהליך על ידי זינוק בזהירות למעלה ולמטה או הקשה על צד הצלחת.
    2. נטרל את האנזים על ידי דילול הדגימה ביחס 1:1 ב-DMEM בתוספת 10% נסיוב בקר עוברי (FBS) ואנטיביוטיקה 1%.
    3. לפצל את תרחיף התא ל 2 בארות ולהוסיף 3 מ"ל של מדיום בסיסי (DMEM בתוספת 10% FBS ו 1% אנטיביוטיקה). יש לדגור למשך הלילה ב-37°C עם 5% CO2.
    4. שנה מדיום למחרת, ולאחר מכן כל יומיים עד 90% מפגש.
    5. חזור על התהליך עד לקטע השלישי והמשך לפנוטיפ ואפיון פונקציונלי.
      הערה: שימו לב תמיד למורפולוגיה של התאים מתחת למיקרוסקופ ההפוך, המשתנה מעגול לדמוי פיברובלסט.
  4. אפיון תאי גזע שמקורם ברקמת שומן (ADSCs)
    1. אפיון פנוטיפי לפי ציטומטריית זרימה
      1. נתק את התאים באמצעות טריפסין/EDTA, כמתואר בשלבים 2.3.1 עד 2.3.2.
      2. לאסוף את התאים בצינור חרוטי (50 מ"ל) וצנטריפוגה ב 250 x גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C. השליכו את הסופרנאטנט והשעו מחדש את הגלולה ב-1 מ"ל של PBS.
      3. ספור את התאים כמתואר בשלב 2.2.4 וזרע 0.5-1 x 106 תאים ב 100 μL של PBS בצלחת 96 באר.
        הערה: מספר הבארות יהיה תלוי בצבע של מצומד פלואורוכרום ואת המסננים/לייזרים של הציטומטר.
      4. הוספת נוגדנים (טבלה 1) מדוללים ב-1% BSA ב-PBS.
        הערה: אין צורך להשתמש בבלוק Fc כדי למנוע קשירה לא ספציפית מכיוון שאנו כבר משתמשים ב- BSA כדי לדלל נוגדנים. שמור דגימה של תאים ללא קבלת נוגדנים שישמשו כבקרה של צביעה. ניתן לשלב את הנוגדנים באותה באר בהתאם לצבע הפלואורוכרום ולציטומטר הקיימים במעבדה. ניתן להוסיף את כל הנוגדנים המתוארים בטבלה 1 באותה באר, למעט CD71 FITC ו- CD29 FITC, אשר חייבים להיות בבארות שונות בגלל אותו פלואורוכרום.
      5. לדגור על הצלחת במשך 30 דקות ב 4 ° C בחושך.
      6. לשטוף תאים, ולאחר מכן להשלים את נפח ל 200 μL באמצעות PBS, צנטריפוגה את הצלחת ב 252 x גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C, ולהשליך את supernatant. חזור על שלב זה פעם נוספת.
      7. תקן את התאים על ידי הוספת 200 μL לכל באר של 2% פורמלדהיד ב- PBS. אחסנו את התאים בחושך בטמפרטורה של 4°C עד לניתוח בציטומטר הזרימה.
        הערה: לקבלת התוצאות הטובות ביותר, רכוש את התאים בציטומטר הזרימה בהקדם האפשרי. בהירות הפלואורסצנטיות של הסמנים דועכת באופן משמעותי לאחר 48 שעות עבור רוב הפלואורוכרומים. אז, לא יעלה על 48 שעות לקרוא את הצלחת. מומלץ לרכוש 30,000 אירועים.
      8. השתמשו באסטרטגיית ה-gating המוצגת באיור 2B כדי לבחור את אוכלוסיית ה-ASC.
    2. אפיון פונקציונאלי: התמיינות אוסטאוגנית
      1. נתק את התאים באמצעות טריפסין/EDTA (כמתואר בשלבים 2.3.1 עד 2.3.2), אסוף וצנטריפוגה את התאים (כמתואר בשלבים 2.4.1.2 ו- 2.4.1.2) וספור אותם (כמתואר בשלבים 2.2.4).
      2. צלחת, במשולש, 2 x 105 תאים לכל באר בצלחות 6 באר במדיאלי בסיסי (DMEM בתוספת 10% FBS ו 1% אנטיביוטיקה); יש לדגור ב-37°C ב-5% CO2.
        הערה: יהיה צורך בשתי צלחות בנות 6 בארות, אחת לכל זמן בידול (14 ו-21 יום).
      3. למחרת, שנה את המדיום למדיום אוסטאוגני (שלב 1.4.1).
        הערה: שמור 3 בארות להיות בתרבית רק עם המדיום הבסיסי, אשר יהיה הבקרה עבור בידול.
      4. תרבית תאים במשך 14 ו -21 ימים במדיה אוסטאוגנית ובתאי הביקורת, החלפת מדיה כל 3 ימים. המשך לצביעת פון קוסה (שלב 1.4.2) כדי להעריך את הגושים המינרליים בסוף כל תקופת תרבית.
      5. שאפו את המדיום מכל באר ושטפו את התאים פעמיים עם PBS. תקן את התאים עם 2 מ"ל של אתנול 70% לילה בטמפרטורת החדר (RT). שטפו את התאים בזהירות במים זורמים.
      6. הוסף 2 מ"ל של תמיסת חנקת כסף 5% ודגר על הצלחת באור אולטרה סגול למשך שעה אחת. לשטוף את התאים עם מים מזוקקים. מוסיפים 2 מ"ל של 5% נתרן תיוסולפט, ודגרים במשך 5 דקות. יש לשטוף במים מזוקקים.
      7. כתם נגדי עם 2 מ"ל של eosin במשך 40 שניות. יש לשטוף במים מזוקקים עד להסרת תמיסת הצביעה, ולדמיין את הצביעה באמצעות מיקרוסקופ אופטי.
    3. אפיון פונקציונאלי: בידול אדיפוגני
      1. נתק את התאים באמצעות טריפסין/EDTA (כמתואר בשלבים 2.3.1 עד 2.3.2), אסוף וצנטריפוגה את התאים (כמתואר בשלבים 2.4.1.2 ו- 2.4.1.2) וספור אותם (כמתואר בשלבים 2.2.4).
      2. צלחת 2 x 105 תאים לכל באר בצלחות 6 באר במדיאלי בסיסי (DMEM בתוספת 10% FBS ו 1% אנטיביוטיקה); יש לדגור ב-37°C ב-5% CO2.
        הערה: יהיה צורך בשתי צלחות בנות 6 בארות, אחת לכל זמן בידול (14 ו-21 יום).
      3. למחרת, שנה את המדיום למדיום אדיפוגני (שלב 2.5.1).
        הערה: שמור 3 בארות להיות מתורבת רק עם המדיום הבסיסי כמו בקרה.
      4. תאי תרבית במשך 14 ו -21 יום בתווך אדיפוגני, החלפת מדיה כל 3 ימים. בסוף כל תקופת תרבית, המשיכו לצביעת O אדום שמן (שלבים 2.4.3.5-2.4.3.7), אינדיקטור להצטברות שומנים תוך תאיים.
      5. שאפו את התקשורת מכל באר. שטפו את התאים פעמיים עם PBS. תקן תאים ב 2 מ"ל של 10% פורמלין במשך 1 שעות. יש לשטוף פעם אחת עם PBS, ולאחר מכן פעם אחת עם מים.
      6. יש לצבוע עם 2 מ"ל של תמיסת Oil-Red O באיזופרופנול 60% למשך 5 דקות. יש לשטוף פעם אחת במים מזוקקים.
      7. כתם נגדי עם 2 מ"ל של 1% hematoxylin מדולל 1: 2 במים מזוקקים במשך 1 דקה. יש לשטוף במים מזוקקים עד להסרת תמיסת הצביעה, ולדמיין את הדגימות המוכתמות באמצעות מיקרוסקופ אופטי.
    4. אפיון פונקציונאלי: התמיינות כונדרוגנית
      1. נתק את התאים באמצעות טריפסין/EDTA (כמתואר בשלבים 2.3.1 עד 2.3.2), אסוף וצנטריפוגה את התאים (כמתואר בשלבים 2.4.1.2 ו- 2.4.1.2) וספור אותם (כמתואר בשלבים 2.2.4).
      2. מניחים 5 x 105 ADSCs בארבעה צינורות חרוטי פוליפרופילן וצנטריפוגה ב 450 x גרם במשך 5 דקות כדי ליצור כדור. השליכו את הסופרנטנט.
      3. תרבית את הכדוריות בצינור חרוטי בתווך כונדרוגני (שלב 1.6.1) או רק בתווך בסיסי (בקרת התמיינות) במשך 14 ו -21 ימים ב 37 ° C ב 5% CO2. החליפו מדיום כל 3 ימים והימנעו מהוצאת כדורים.
        הערה: כל כדורית תא מתייחסת לכל זמן תרבית, כמו גם לבקרות בהתאמה שגדלו רק עם מדיום בסיסי.
      4. בסוף כל נקודת זמן בתרבית, אספו את הכדוריות באמצעות פינצטה עדינה והניחו אותן בצלחת בת 24 בארות. המשך לחתך היסטולוגי וצביעה של פרוטאוגליקנים וגליקוזאמינוגליקנים (שלבים 2.4.4.5.-2.4.4.9).
        הערה: כל גלולה מעובדת בבאר נפרדת.
      5. תקן כדורים ב 2 מ"ל של 10% פורמלדהיד חוצץ במשך 30 דקות. השליכו את תמיסת הפורמלדהיד והוסיפו 2 מ"ל אתנול 70%. מוציאים את הגלולה מהצינור החרוטי בעזרת קצה ומטמיעים את הכדוריות בפרפין.
      6. באמצעות מיקרוטום פרפין מסתובב, לעשות 5 מיקרומטר חתכים היסטולוגיים. לדגור על החלקים במשך 15 דקות ב 60 ° C, ולטבול אותם פעמיים xylene (במשך 5 ו 15 דקות).
      7. יש להחזיר לחות לדגימות על ידי טבילת החלקים ההיסטולוגיים באמבטיות אלכוהול בריכוזים יורדים (100%, 96%, 80% ו-70%) למשך 2 דקות כל אחת, ולאחר מכן לשטוף במים נטולי יונים, במשך 5 דקות.
      8. המשיכו להכתים את הדגימות עם Alcian blue 1% בחומצה אצטית, pH 2.5, למשך 30 דקות.
      9. כתם נגדי עם hematoxylin במשך 1 דקות, ולשטוף עם מים מזוקקים. הרכבה עם DPX (mountant עבור היסטולוגיה) או פתרון הרכבה אחר ולהמחיש דגימות באמצעות מיקרוסקופ אופטי.

תוצאות

תאים שחולצו מרקמת השומן על פי הפרוטוקול המוצג כאן הראו מורפולוגיה התואמת את הקריטריונים המינימליים עבור MSCs המוצעים על ידי ISCT. סקירה כללית של הפרוטוקול מוצגת באיור 1. באופן פנוטיפי, ADSCs הראו היצמדות למורפולוגיה פלסטית ודמוית פיברובלסטים בימים הראשונים של תרבית תאים (

Discussion

MSCs ניתן לחלץ רקמות שונות. למרות שמח עצם מייצג מקור משותף של MSCs הן במורין והן בבני אדם25,26, בחרנו לעבוד עם רקמת השומן במחקר זה בגלל העושר שלה ב- MSCs, הפיזור בגוף וקלות הגישה אליה. כחלופה, ניתן להשתמש בתאי גזע שמקורם בשומן כדי ליצור תאים אימורטליים דמויי MSCs

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

המחקר נתמך על ידי מענק של Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnologico (480807/2011-6) ו- Fundação de Amparo à Pesquisa de Minas Gerais (APQ-01237-11). מחקר זה מומן בחלקו על ידי PROPP UESC (073.6764.2019.0021079-85). MGAG ו- URS הודות למלגה שהוענקה על ידי Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado da Bahia (FAPESB), ו- Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), בהתאמה.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
140 °C High Heat Sterilization CO2 IncubatorRADOBIO SCIENTIFIC CO. LTD, ChinaC180
3-Isobutyl-1-methylxanthineSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAI7018
Acetic acid glacialSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAPHR1748
Alcian Blue 8GXSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAA9186BioReagent, suitable for detection of glycoproteins. 1% in acetic acid, pH 2.5
Alcohol 70%Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA65350-M70% in water
Amphotericin BSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAPHR1662
Antibodies anti-mouse anti-CD29 FITC (Clone Ha2/5)BD Biosciences, San Diego, CA, USA555005Functions in the cell: Adhesion and activation, embryogenesis, Leukocytes, DC, platelets, mast cells, fibroblasts and endothelial cells
Antibodies anti-mouse anti-CD34 PE (Clone RAM34)BD Biosciences, San Diego, CA, USA551387Functions in the cell: Cell adhesion factor. Hematopoietic stem cells
Antibodies anti-mouse anti-CD45 APC (Clone 30-F11)BD Biosciences, San Diego, CA, USA559864Functions in the cell: Assists in the activation of leukocytes
Antibodies anti-mouse anti-CD71 FITC (Clone C2)BD Biosciences, San Diego, CA, USA553266Functions in the cell: Controls iron uptake during cell proliferation. Proliferating cells, reticulocytes and precursors
Antibodies anti-mouse anti-CD90 PerCP (Clone OX-7)BD Biosciences, San Diego, CA, USA557266Functions in the cell: Signaling, adhesion. T lymphocyte, NK, monocyte, HSC, neuron, fibroblast
Ascorbic acidSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAPHR1008
Automatic pipettesThermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA4700850NFinnpipette F1 Good Laboratory Pipetting (GLP) Kits
BeakerNot applicable1 unit
Bovine serum albuminSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAA7906
Cell culture plates (6-well)Merck, Darmstadt, GermanyZ70775907 units sterile. TPP tissue culture plates
Cell culture plates (96-well. Round or V bottom)Merck, Darmstadt, GermanyCLS35307701 unit sterile. Wells, 96, Tissue Culture (TC)-treated surface, round bottom clear wells, sterile
Chondrogenic mediumStem Pro Chondrogenesis Differentiation–Life TechnologiesA1007101TGF-β2, TGF-β3, dexamethasone, insulin, transferrin, ITS, sodium-l - ascorbate, sodium pyruvate, ascorbate-2-phosphate
Collagenase type IILife Technologies, California, USA17101015
cork or styrofoam board covered with aluminumNot applicable1 unit
cottonNot applicable50 g
DexamethasoneSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAD4902
Dissecting scissorNot applicable03 units sterile
DPX Mountant for histologySigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA6522
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAD5523With 1000 mg/L glucose and L-glutamine, without sodium bicarbonate, powder, suitable for cell culture
Eosin BSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA861006
Fetal bovine serum (FBS)Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAF4135
FormaldehydeSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA47608
FormalinSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAHT501128
GentamicinSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAG1397
HematoxylinSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAH3136
Hypodermic Needle (0.3mm x 13mm)Not applicable5 units
IndomethacinSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAI0200000
InsulinSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAI3536
IsopropanolSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA56393570% in H2O
Ketamine-D4 hydrochloride solutionSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAK-0061.0 mg/mL in methanol (as free base), certified reference material, Cerilliant®
Neubauer chamberSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USABR718620BRAND counting chamber BLAUBRAND Neubauer pattern. With clips, double ruled
Nichiryo pipette tips (0.1–10 μL)Merck, Darmstadt, GermanyZ645540Volume range 0.1–10 μL, elongated, bulk pack. Sterile
Nichiryo pipette tips (1–10 mL)Merck, Darmstadt, GermanyZ717401Volume range 1–10 mL, universal, bulk pack. Sterile
Nichiryo pipette tips (200 μL)Merck, Darmstadt, GermanyZ645516Maximum volume 200 μL, graduated, ministack. Sterile
Oil-Red O solutionSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAO13910.5% in isopropanol
ParaffinSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA107.15146–48, in block form
Penicillin/StreptomycinSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAP4333Solution stabilized, with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL, 0.1 μm filtered, BioReagent, suitable for cell culture
Phosphate-buffered saline solution 1x (PBS).Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAP3813Powder, pH 7.4, for preparing 1 L solutions. Balanced and sterile
Polypropylene conical tubes (15 mL)Falcon, Fisher Scientific14-959-53ASterile
Polypropylene conical tubes (50 mL)Falcon, Fisher Scientific14-432-222 units sterile
scalpel (optional)Not applicable1 unit
Silver nitrateSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA85228
Sodium thiosulfateSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA72049
Surgical tweezer (15 cm)Not applicable3 units sterile
Swiss male mice (6–8 weeks)Bioterium, Santa Cruz State University021/22
syringe (1 mL)Not applicable1 unit
Trypan Blue DyeSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAT81540.4%, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture
Trypsin/EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid)Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAT3924
XylazineSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAPHR3263
β-glycerophosphate disodium salt hydrateSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAG9422BioUltra, suitable for cell culture, suitable for plant cell culture, ≥99% (titration)

References

  1. Caplan, A. I. Mesenchymal stem cells. J Orthop Res. 9 (5), 641-650 (1991).
  2. Pittenger, M., et al. Mesenchymal stem cell perspective: cell biology to clinical progress. npj Regen Med. 4, 22 (2019).
  3. Lin, W., et al. Mesenchymal stem cells and cancer: Clinical challenges and opportunities. BioMed Res Int. 2820853, 1-12 (2019).
  4. Mazini, L., et al. Hopes and limits of adipose-derived stem cells (ADSCs) and mesenchymal stem cells (MSCs) in wound healing. Int J Mol Sci. 21 (4), 1306 (2020).
  5. Shi, Y., et al. Immunoregulatory mechanisms of mesenchymal stem and stromal cells in inflammatory diseases. Nat Rev Nephrol. 14 (8), 493-507 (2018).
  6. Uccelli, A., et al. Mesenchymal stem cells in health and disease. Nat Rev Immunol. 8 (9), 726-736 (2008).
  7. Dong, J., et al. Human adipose tissue-derived small extracellular vesicles promote soft tissue repair through modulating M1-to-M2 polarization of macrophages. Stem Cell Res Ther. 14 (1), 67 (2023).
  8. Maffioli, E., et al. Proteomic analysis of the secretome of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells primed by pro-inflammatory cytokines. J. Proteomics. 166, 115-126 (2017).
  9. Akiyama, K., et al. Mesenchymal-stem-cell-induced immunoregulation involves FAS-ligand-/FAS-mediated T cell apoptosis. Cell Stem Cell. 10, 544-555 (2012).
  10. Wang, Y., et al. Plasticity of mesenchymal stem cells in immunomodulation: pathological and therapeutic implications. Nat Immunol. 15, 1009-1016 (2014).
  11. Li, C., et al. Allogeneic vs. autologous mesenchymal stem/stromal cells in their medication practice. Cell Biosci. 11, 187 (2021).
  12. Zhang, J., et al. The challenges and promises of allogeneic mesenchymal stem cells for use as a cell-based therapy. Stem Cell Res Ther. 6, 234 (2015).
  13. Jurado, M., et al. Adipose tissue-derived mesenchymal stromal cells as part of therapy for chronic graft-versus-host disease: A phase I/II study. Cytotherapy. 19 (8), 927-936 (2017).
  14. Zhang, M., et al. Mesenchymal stem cell-derived exosome-educated macrophages alleviate systemic lupus erythematosus by promoting efferocytosis and recruitment of IL-17+ regulatory T cell. Stem Cell Res Ther. 13 (1), 484 (2022).
  15. Fernández, O., et al. Adipose-derived mesenchymal stem cells (AdMSC) for the treatment of secondary-progressive multiple sclerosis: A triple blinded, placebo controlled, randomized phase I/II safety and feasibility study. PLoS One. 13 (5), 0195891 (2018).
  16. Abdolmohammadi, K., et al. Mesenchymal stem cell-based therapy as a new therapeutic approach for acute inflammation. Life Sci. 312, 121206 (2023).
  17. Hoang, D. M., et al. Stem cell-based therapy for human diseases. Signal Transduct Target Ther. 7 (1), 272 (2022).
  18. Lee, R. H., et al. Characterization and expression analysis of mesenchymal stem cells from human bone marrow and adipose tissue. Cell Physiol Biochem. 14 (4-6), 311-324 (2004).
  19. Strem, B. M., et al. Multipotential differentiation of adipose tissue derived stem cells. Keio J Med. 54 (3), 132-141 (2005).
  20. Kern, S., et al. Comparative analysis of mesenchymal stem cells from bone marrow, umbilical cord blood, or adipose tissue. Stem Cells. 24 (5), 1294-1301 (2006).
  21. Dominici, M. D., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  22. Berryman, D. E., et al. Growth hormone's effect on adipose tissue: Quality versus quantity. International Journal of Molecular Sciences. 18 (8), 1621 (2017).
  23. Shomer, N. H., et al. Review of rodent euthanasia methods. J Am Assoc Lab Anim Sci. 59 (3), 242-253 (2020).
  24. Miranda, V. H. S., et al. Liver damage in schistosomiasis is reduced by adipose tissue-derived stem cell therapy after praziquantel treatment. PLoS Negl Trop Dis. 14 (8), e0008635 (2020).
  25. Li, H., et al. Isolation and characterization of primary bone marrow mesenchymal stromal cells. Ann N Y Acad Sci. 1370 (1), 109-118 (2016).
  26. Boregowda, S. V., et al. Isolation of mouse bone marrow mesenchymal stem cells. Methods Mol Biol. 1416, 205-223 (2016).
  27. Sreejit, P., et al. Generation of mesenchymal stem cell lines from murine bone marrow. Cell Tissue Res. 350 (1), 55-68 (2012).
  28. Bunnell, B. A. Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells. Cells. 10 (12), 3433 (2021).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

MSCs

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved