JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול זה שם דגש על מיצוי, תרבית ושימור של תאי גזע רב-פוטנטיים ממוך השן באמצעות עיכול אנזימטי. בנוסף, הוא מדגים את הפוטנציאל שלהם להתמיין לאוסטאובלסטים, אדיפוציטים וכונדרוציטים, ומדגיש את חשיבות הדיוק והעקביות בתהליך.

Abstract

בתחום הרפואה הרגנרטיבית והיישומים הטיפוליים, מחקר תאי גזע צובר תאוצה במהירות. תאי גזע ממוך השן (DPSCs), הנמצאים הן בשיניים נשירות והן בשיניים קבועות, התגלו כמקור תאי גזע חיוני בשל נגישותם, יכולת ההסתגלות שלהם ויכולות ההתמיינות המולדת שלהם. DPSCs מציעים מאגר זמין ושופע של תאי גזע מזנכימליים, המציגים רב-תכליתיות ופוטנציאל מרשימים, במיוחד למטרות רגנרטיביות. למרות הבטחתם, המשוכה העיקרית טמונה בבידוד ואפיון יעיל של DPSCs, בהתחשב בייצוגם כשבריר זעיר בתוך תאי מוך השן. חיוני לא פחות הוא שימור נאות של משאב סלולרי יקר ערך זה. שתי השיטות העיקריות לבידוד DPSC הן עיכול אנזימטי (ED) וצמיחה מצמחי רקמות (OG), המכונה לעתים קרובות צמיחה ספונטנית. פרוטוקול זה מתרכז בעיקר בגישת העיכול האנזימטי לבידוד DPSC, ומפרט באופן מורכב את השלבים הכוללים מיצוי, עיבוד במעבדה ושימור תאים. מעבר למיצוי ושימור, הפרוטוקול מתעמק ביכולת ההתמיינות של DPSCs. באופן ספציפי, הוא מתאר את ההליכים המשמשים כדי לגרום לתאי גזע אלה להתמיין לאדיפוציטים, אוסטאובלסטים וכונדרוציטים, ומציג את התכונות הרב-עוצמתיות שלהם. שימוש עוקב בטכניקות צביעה קולורימטרית מאפשר הדמיה מדויקת ואישור של בידול מוצלח, ובכך לאמת את האיכות והפונקציונליות של DPSCs מבודדים. פרוטוקול מקיף זה מתפקד כתוכנית המקיפה את כל הספקטרום של מיצוי תאי גזע במוך השן, טיפוח, שימור ואפיון. הוא מדגיש את הפוטנציאל המשמעותי הגלום ב- DPSCs, מניע קדימה חקר תאי גזע וטומן בחובו הבטחה לפריצות דרך רגנרטיביות וטיפוליות עתידיות.

Introduction

מחקר תאי גזע פרח במדע הביו-רפואי בשל היישומים המבטיחים שלו ברפואה רגנרטיבית ובהנדסת רקמות. תאי גזע של מוך השן (DPSCs), שמקורם ברקמת מוך השן של שיניים נשירות וקבועות אנושיות, משכו עניין רב כמקור לתאי גזע בשל זמינותם המוכנה ויכולתם הרב-פוטנטית 1,2. לתאים אלה יש פוטנציאל להתמיין לסוגי תאים שונים, כולל אדיפוציטים, אוסטאובלסטים וכונדרוציטים, כפי שאושר במחקרים רבים3.

במהלך העשורים האחרונים, המחקר והיישומים הטיפוליים של תאי גזע זינקו. הפוטנציאל הרחב של תאי גזע מחייב גיוון המקורות מהם הם מתקבלים. מספר גורמים משפיעים על היעילות, הכדאיות והגבעול של תאים נבחרים. למרות קיומם של מאגרים ידועים שונים של תאי גזע, כגון מח עצם ורקמות שומן, ההליכים הפולשניים, תחלואה באתר וחששות אתיים הקשורים למקורות אלה מגבילים לעתים קרובות את חקירתם 4,5. בין מקורות תאי הגזע השונים, תאי גזע דנטליים זכו לתשומת לב בשל נגישותם הקלה, פלסטיות גבוהה ויישומים פוטנציאליים מגוונים. תאי גזע אנושיים של מוך השן, בפרט, נחקרו בהרחבה עבור הסיכויים הטיפוליים שלהם6. שיניים, שבדרך כלל מושלכות כפסולת רפואית, מכילות שפע של תאי גזע מזנכימליים7. שמירה על מאגר תאי גזע יקר ערך זה דורשת מאמצים קולקטיביים מצד מטופלים, רופאי שיניים ורופאים כדי להבטיח שמשאבים אלה לא יבוזבזו, מה שהופך כל תא גזע במוך השן לזמין לדרישות התחדשות עתידיות.

תאי גזע שמקורם במוך השן, כגון תאי גזע אנושיים בוגרים של מוך השן (DPSCs) ותאי גזע משיניים נשירות אנושיות (SHED), ממוקמים בנישה הפרי-וסקולרית של מוך השן. תאים אלה הם האמינו שמקורם בתאי פסגה עצבית גולגולתית ומציגים סמנים מוקדמים הן עבור תאי גזע מזנכימליים (MSC) והן עבור תאי גזע נוירואקטודרמליים. DPSCs ו- SHEDs הוכיחו רב-עוצמה ויכולת לחדש סוגי רקמות מגוונים8.

מקורות פוטנציאליים של תאי גזע דנטליים כוללים שיניים בריאות, נשירות וקבועות. תאי גזע מהווים רק כ-1% מכלל אוכלוסיית התאים במוך השן, מה שמדגיש את החשיבות של טכניקות בידוד והתפשטות יעילות9. כתוצאה מכך, מיצוי והרחבה של תאי גזע אלה הם שלבים מרכזיים בבידוד DPSC10. שיניים שנעקרו או עברו קילוף צריכות להיות מאוחסנות באמצעי הובלה עשיר בחומרים מזינים, כגון מלוחים חוצצי פוספט (PBS) או תמיסת מלח חוצצת הנקס (HBSS).

השגת מוך השן יכולה להיות מושגת בשיטות שונות, המותנות בסוג השן 7,11. עבור שיניים נשירות עם שורשים נספגים, ניתן לבצע עקירה דרך קודקוד השורש. באופן דומה, ניתן להשתמש במוך דוקרני סטרילי כדי להשיג מוך שיניים קבועות עם קודקוד פתוח לא בוגר. במקרים של שיניים קבועות עם שורשים מפותחים, הגישה לחדר מוך השן כרוכה בהפרדת כתר השיניים מהשורש. זה מושג על ידי חיתוך השן באמצעות דיסק יהלום בצומת צמנטואמייל. חתך זה חושף את תא מוך השן ומאפשר שליפה של רקמת מוך השן 12,13,14.

תאי גזע של מוך השן (DPSCs) יכולים להיות מבודדים באמצעות עיכול אנזימטי (ED) או צמיחה מצמחי רקמות (OG), הידוע גם בשם צמיחה ספונטנית. שיטת ED משתמשת באנזימים, בעיקר collagenase I ו- dispase, כדי לפרק את הרקמה לתרחיפים חד-תאיים15,16. שיטת OG, פשוטה ומהירה יותר, כרוכה בחיתוך שברי עיסת השן והנחתם ישירות לתוך צלחת תרבית, המאפשרת לתאים לצמוח מצמחי הרקמה17. חוקרים השתמשו והשוו את שתי הטכניקות כדי להעריך את קצב התפשטות התאים, שימור תכונות תאי גזע מבודדים, התמיינות וביטוי סמנים על פני השטח18. הקמה וסטנדרטיזציה של פרוטוקולים לרכישת DPSCs עם יעילות גבוהה וגזע יכולים לסלול את הדרך לטיפולים יעילים ובטוחים19. פרוטוקול זה כולל חילוץ DPSCs באמצעות עיכול אנזימטי, עיבוד מעבדה, שימור והתמיינות תאים עם צביעה קולורימטרית עבור אדיפוגנזה, אוסטאוגנזה וכונדרוגנזה.

הפרוטוקול המתואר במאמר זה מציג הליך שלב אחר שלב, החל מהבידוד הראשוני של מוך השן מהשן, לאחר מכן תרבית ותחזוקה של DPSCs במעבדה, וכלה באפיון שלהם באמצעות סמנים ספציפיים של תאי גזע (איור 1). כמו כן מתוארות הטכניקות לגרימת תאי גזע אלה לשושלות תאים שונות, תוך הדגשת הרב-עוצמה שלהם.

Protocol

הפרוטוקול המתואר כאן תואם את הנחיות ועדת האתיקה המוסדית למחקר אנושי (IRB, Pushpagiri Research Center, Kerala). השימוש בשיניים שנעקרו נעשה על פי סטנדרטים אתיים כדי להבטיח את שלמותם, כבודם וזכויותיהם של המשתתפים. המשתתפים שנבחרו למחקר זה היו אנשים בריאים מתחת לגיל 30 שנזקקו לעקירת שן לצורך טיפול אורתודונטי. אלו עם עששת נרחבת או דלקת חניכיים חמורה לא נכללו במחקר. שיניים נשירות נאספו מילדים שנזקקו לעקירת שיניים שמורים. הסכמה מדעת בכתב התקבלה גם מהנבדקים המעורבים במחקר זה.

1. עקירה והובלה של שיניים

  1. אוסף שיניים נשירות וקבועות
    1. הסבירו למשתתפים את מטרת ההליך ואת השימוש האפשרי בשיניים שנעקרו למטרות מחקר.
    2. ביצוע עקירת שיניים בהרדמה מקומית על ידי מתן חומר הרדמה בקרבת השן לעקירה. באופן ספציפי, 1.75 מ"ל של לידוקאין מעורבב עם אפינפרין (ראה טבלה של חומרים) ביחס של 1:200,000 הוזרק עבור מחקר זה. בחירת שיניים שאינן מציגות עששת חמורה או דלקת חניכיים עדיפה20,21.
  2. הובלת השיניים שנעקרו
    הערה: מומלץ לעבוד בתנאים אספטיים כדי למנוע זיהום. זה כולל לבישת ציוד מגן אישי, כגון כפפות ומעיל מעבדה, ועבודה בסביבה סטרילית, כגון מכסה מנוע זרימה למינרית מסוכנת ביולוגית.
    1. לאחר עקירת השן, שטפו אותה בתמיסת מלח סטרילית חוצצת פוספט (PBS) כדי להסיר את הדם ופסולת אחרת. בעזרת מלקחיים סטריליים ואזמל, הסירו בזהירות את שאריות הרקמה הרכה המחוברת מפני השטח של השן (איור 2A).
    2. לטבול את השן בתמיסת חיטוי, כגון אתנול 70%, במשך 10 שניות. לאחר החיטוי, שטפו את השן עם PBS סטרילי כדי לשטוף את שאריות חומר החיטוי.
    3. מניחים את השן במיכל סטרילי המכיל את אמצעי ההובלה.
      הערה: אמצעי ההובלה כלל את Alpha-MEM, מדיום תרבית מסחרית בתוספת אנטיביוטיקה: 100 U/mL פניצילין/סטרפטומיצין (ראה טבלת חומרים). מדיום זה סיפק חומרים מזינים חיוניים לתאים בתוך השן שנעקרה, והבטיח את הישרדותם עד לעיבוד מעבדה. האנטיביוטיקות שימשו לעיכוב צמיחת חיידקים.
    4. שמור על טמפרטורה של 4 ° C במהלך ההובלה כדי להאט את הפעילות המטבולית התאית ולעכב מוות תאי. העבירו את השן למעבדה לשלבים הבאים, כולל עיבוד ובידוד תאי הגזע של מוך השן.

2. איסוף רקמת מוך השן

  1. אבטחו את השן באמצעות מלקחיים דנטליים כדי להבטיח שהיא תישאר במקומה במהלך ההליך. השתמשו בדיסק יהלום כדי לחתוך את השן בידית דנטלית (ראו טבלת חומרים) שמחוברת לנוזל קירור מים (איור 2B).
    הערה: המטרה היא לחשוף את תא מוך השן מבלי לגרום נזק מיותר לרקמת מוך השן שבתוכו.
  2. השתמש במחפר שיניים (ראה טבלת חומרים) כדי להסיר את רקמת מוך השן. מכשיר זה מאפשר הוצאת מוך השן מבלי לגרום נזק, ובכך משמר את יכולת הקיום של תאי הגזע של מוך השן (איור 2C).
  3. מניחים את הרקמה המתקבלת על צלחת פטרי זכוכית. לשטוף את רקמת מוך השן עם מלוחים חוצץ פוספט.

3. עיכול רקמת עיסת השן ובידוד תאים

  1. טחינת רקמות ועיכול
    1. בעזרת להב כירורגי סטרילי, טחנו בזהירות את רקמת מוך השן למקטעים קטנים (איור 2D) והניחו אותה במטחנת רקמות קטנה עם PBS כדי לקבל תערובת הומוגנית דקה. תהליך זה מגדיל את שטח הפנים של הרקמה, ומקל על פעולת אנזים יעילה יותר במהלך העיכול.
    2. מעבירים את מקטעי הרקמה ההומוגנית הטחונה לתוך צינור של 15 מ"ל ומעכלים אנזימטית באמצעות תערובת של 3 מ"ג/מ"ל קולגנאז מסוג I ו-4 מ"ג/מ"ל דיספאס (ראו טבלת חומרים). אנזימים אלה הומסו בתמיסת המלח המאוזנת של האנק (HBSS) כדי להשיג את הריכוזים הרצויים.
    3. לדגור על רקמת מוך השן בתערובת האנזימים (שלב 3.1.2) במשך כשעתיים בטמפרטורה של 37°C. לאחר הדגירה, נטרלו את האנזימים, ואספו את התאים בצנטריפוגה (שלב 3.2.1) לתרבית נוספת.
  2. צנטריפוגה ומתלים
    1. לאחר הדגירה, מעבירים את הרקמה המעוכלת לצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל ומסתובבים ב 300 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי לגלול את התאים. שלב זה מפריד את התאים מחלקי הרקמה והאנזימים הלא מעוכלים הנותרים. יש להשליך בזהירות את התווך העל-טבעי, ולהבטיח שלא להפריע לגלולת התא בתחתית הצינור.
    2. השהה מחדש את גלולת התא במדיום תרבית טרי. מדיום זה מספק את החומרים המזינים הדרושים ואת הסביבה עבור התאים המבודדים לשרוד ולהתרבות.

4. תרבית תאים

  1. ציפוי ודגירה של תאים
    1. מעבירים בזהירות את התאים המרחפים לצלוחית תרבית בגודל 25 סמ"ר.
      הערה: כל החומר מעיסה אחת מועבר לצלוחית אחת של25 ס"מ 2 תרבית תאים. נפח מדיה של 5-7 מ"ל מבטיח כיסוי מספיק וזמינות תזונתית עבור התאים. ודא שאמצעי התרבית עבור DPSCs הוא מדיום הנשר המותאם (DMEM) של Dulbecco, בתוספת סרום בקר עוברי (FBS) של 10%-20% (ראה טבלת חומרים) כדי לספק גורמי גדילה נחוצים. יתר על כן, להשלים את המדיום עם 1% פניצילין/סטרפטומיצין כדי למנוע זיהום חיידקי. ודא שהתאים מפוזרים באופן שווה לאורך הבקבוק כדי לקדם צמיחה הומוגנית.
    2. לדגור את הבקבוק ב 37 ° C באטמוספירה המכילה 5% CO2.
  2. שינוי בינוני ומעקב אחר מפגש
    1. שנה את מדיום התרבית כל 2-3 ימים כדי לספק חומרים מזינים טריים ולהסיר פסולת מטבולית. כדי לעשות זאת, בזהירות לשאוף את המדיום הישן באמצעות פיפטה סרולוגית סטרילית ולהחליף אותו עם מדיום טרי.
    2. עקוב באופן קבוע אחר תרבית התאים תחת מיקרוסקופ כדי לעקוב אחר גדילת התאים ולבדוק אם יש סימני זיהום.
    3. המשיכו בתהליך זה עד שהתאים מגיעים למפגש של 80%-90%, הנקודה שבה התאים מכסים את רוב שטח הפנים של הבקבוק אך אינם צפופים מדי.
  3. טריפסיניזציה של תאים ומעבר או הקפאה
    1. ברגע שהתאים מגיעים למפגש של 80%-90%, הסירו את מדיום התרבית ושטפו את התאים במי מלח חוצצי פוספט (PBS) כדי להסיר את שאריות התווך והתאים שאינם דבקים.
    2. הוסף תמיסה של 0.25% טריפסין-EDTA לבקבוק כדי לנתק את התאים מפני השטח של הצלוחית. יש לדגור במשך 2-5 דקות בטמפרטורה של 37°C עד שהתאים מתרוממים.
    3. נטרלו את הטריפסין על ידי הוספת נפח שווה של מדיום תרבית, ולאחר מכן החזירו בעדינות את תרחיף התא למעלה ולמטה כדי להבטיח ניתוק תאים מלא.
    4. צנטריפוגה את תרחיף התא ב 300 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי pellet את התאים.
    5. השהה מחדש את התאים במדיום תרבית טרי וצלחת אותם מחדש (מעבר) לצמיחה נוספת או הקפיא אותם לשימוש עתידי. בעת ההקפאה, השתמש באמצעי הקפאה המכיל הגנה קריופרוטקטיבית, כמו DMSO, כדי להגן על התאים מפני נזק במהלך ההקפאה.

5. אפיון DPSCs

  1. ניתוח ציטומטריית זרימה
    1. כדי לאשר את אופי תאי הגזע המזנכימליים של התאים המבודדים, בצע ניתוח ציטומטריית זרימה22,23. בתחילה, טריפסינזציה ואיסוף תאים כמתואר בשלב 4.3.
    2. קבע את כדאיות התא על ידי טכניקת אי הכללת צבע טריפאן. בצע את הניתוח באמצעות מנתח כדאיות התא (ראה טבלת חומרים) במהלך המעברים השניוהשמיני. בצע אנליזה פנוטיפית באמצעות ציטומטר זרימה במהלך המעבריםה-3 וה-7.
    3. לאחר הדגירה, שטפו את התאים במאגר ציטומטריית זרימה כדי להסיר נוגדנים עודפים ולנתח את התאים באמצעות ציטומטר זרימה.
      הערה: מאגר ציטומטריית הזרימה מורכב ממלח חוצץ פוספט (1x PBS), 1%-2% סרום בקר עוברי (FBS), ו-0.1% נתרן אזיד (NaN3). ה- FBS או BSA חוסם את הקישור הלא ספציפי של נוגדנים, בעוד שהנתרן אזיד פועל כחומר משמר. אחוז גבוה של תאים צריכים לבטא את הסמנים המזנכימליים של תאי גזע וחסרים את הסמנים ההמטופויטיים, המאשרים את זהותם כ- DPSCs24.
    4. נתקו את ה-DPSCs והכתימו אותם בנוגדנים אימונופלואורסנטיים לצורך ניתוח ציטומטריית זרימה.
      הערה: בחירת הסמנים לניתוח ציטומטריית זרימה של תאי גזע מזנכימליים (MSCs) מבוססת על הקונצנזוס שנקבע על ידי האגודה הבינלאומית לטיפול תאי (ISCT), הקובע כי MSCs צריכים לבטא CD105, CD73 ו- CD90, וחסרים את הביטוי של CD45, CD34, CD14 או CD11b, CD79a או CD19, ו- HLA Class II25. סמנים אלה משמשים בדרך כלל במחקרים החוקרים תאי גזע במוך השן26. ריכוזי הנוגדנים להכתמה יכולים להשתנות בהתאם לנוגדן הספציפי בו נעשה שימוש, ומומלץ לעקוב אחר הוראות היצרן (ראה טבלת חומרים) לדילול נוגדנים ותנאי דגירה25.
    5. לקבוע את קריטריוני הסיווג 27,28 לביטוי סמני CD כאמור: פחות מ-10%, ללא ביטוי; בין 11% ל -40%, ביטוי נמוך; טווח של 41% עד 70%, ביטוי מתון; מעל 71%, ביטוי גבוה.
    6. בנוסף, לאשר את היעדר סמנים hematopoietic על ידי דגירה תא נפרד aliquot עם נוגדנים נגד CD34 ו CD45.

6. הבחנה בין שושלות מרובות

הערה: השלבים הבאים מתארים פרוטוקולים להתמיינות אוסטאוגנית, אדיפוגנית וכונדרוגנית של תאי גזע דנטליים. התחל על ידי זריעת תרביות בצפיפות של 1 x 105 תאים לכל באר בצלחת תרבית רקמה מצופה פיברונקטין עם מדיום שלם (CM). עקוב אחר צמיחת התאים עד להשגת מפגש של 80%-90% לפני התחלת פרוטוקול ההתמיינות הרצוי. כדי להעריך את פוטנציאל ההתמיינות הרב-שושלתי של DPSCs, התחל את תהליך ההתמיינות כלפי אוסטאובלסטים, אדיפוציטים וכונדרוציטים על ידי זריעת תאים ללוחות של 24 בארות וטיפוחם באמצעי התמיינות מתאימים.

  1. התמיינות אוסטאוגנית
    1. התחל על ידי גידול DPSCs במדיום גידול רגיל בתנאים סטנדרטיים עד שהם מגיעים 70%-80% מפגש.
    2. הסר את מדיום הגידול מהתאים, ולאחר מכן לשטוף את התאים פעם אחת עם 1x PBS. הוסף את מדיום ההתמיינות האוסטאוגני (ODM) לתאים.
      הערה: ODM מורכב אלפא מינימלי חיוני בינוני (α-MEM) בתוספת 10% FBS, 100 יחידות / מ"ל פניצילין, 100 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין, 0.25 מיקרוגרם / מ"ל אמפוטריצין B, 50 מיקרוגרם / מ"ל חומצה אסקורבית, 10 mM בטא גליצרופוספט, ו 100 ננומטר dexamethasone (ראה טבלה של חומרים).
    3. לדגור על התאים בתווך אוסטאוגני ב 37 ° C עם 5% CO2. שנה את המדיום האוסטאוגני כל 2-3 ימים.
      הערה: לאחר 14 עד 21 יום, DPSCs היו צריכים להתמיין לתאים דמויי אוסטאובלסט. ניתן לאשר זאת על ידי בדיקת עלייה בביטוי של סמנים ספציפיים לאוסטאובלסט, כגון פוספטאז אלקליין, או על ידי שימוש בטכניקות צביעה כדי לזהות מטריצה מינרליזציה, כגון צביעת Alizarin Red S.
    4. תקן את התאים על ידי דגירה אותם עם אתנול 70% קר כקרח במשך 1 שעה ב -20 ° C.
    5. צבעו את התאים הקבועים בתמיסת צביעה 40 ננומטר Alizarin Red S (pH 4.2) בטמפרטורת החדר בחושך למשך 10-15 דקות. דמיינו את הצביעה תחת מיקרוסקופ כדי לאשר התמיינות אוסטאוגנית (איור 3). לאשר את ההבחנה על ידי צביעת התאים עם Alizarin אדום S, אשר מזהה משקעי סידן המעידים על מינרליזציה29,30.
  2. בידול אדיפוגני
    1. כפי שפורט בסעיף הקודם, DPSCs תרבית בתנאים סטנדרטיים באווירה לחה עם 5% CO2 ב 37 ° C. עוברים את התאים כשהם מגיעים למפגש של 70%-80%.
    2. שאפו את המדיום ושטפו את התאים פעם אחת עם 1x PBS. החליפו את המדיום הדהוי במדיום בידול אדיפוגני. מדיום זה מורכב בדרך כלל מ- DMEM, 10% FBS, 10 מיקרוגרם / מ"ל אינסולין, 1 מיקרומטר דקסמתזון, 200 מיקרומטר אינדומתצין ו- 0.5 מילימטר IBMX (ראה טבלת חומרים).
    3. שנה את מדיום הבידול כל 3-4 ימים. לאחר כ-3 שבועות, שטפו את ה-DPSCs המובחנים באדיפוגנים עם PBS וקיבעו אותם עם 4% פרפורמלדהיד (PFA) למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.
    4. צבעו את התאים הקבועים עם שמן אדום O (ראו טבלת חומרים) כדי להמחיש הצטברות טיפות שומנים (איור 4). כדי לאשר עוד יותר התמיינות אדיפוגנית, בצע ניתוח ביטוי גנים של סמנים אדיפוגניים כגון peroxisome proliferator-activated receptor-activated receptor gamma (PPARγ) ו- adiponectin31,32.
  3. התמיינות כונדרוגנית
    1. תרביות DPSCs המתוחזקות באטמוספירה לחה עם 5% CO2 ב -37 מעלות צלזיוס משמשות להתמיינות כונדרוגנית. עוברים את התאים כשהם מגיעים למפגש של 70%-80%.
    2. שאפו את המדיום ושטפו את התאים פעם אחת עם 1x PBS. החלף את המדיום שנשטף במדיום התמיינות כונדרוגני, המכיל בדרך כלל גלוקוז גבוה מדיום הנשר המעובד של דולבקו (DMEM), 1% ITS, 100 ננומטר דקסמתזון, 50 מיקרוגרם/מ"ל אסקורבט-2-פוספט, 40 מיקרוגרם/מ"ל פרולין ו-10 ננוגרם/מ"ל גורם גדילה-בטא 3 (TGF-β3) (ראה טבלת חומרים).
    3. לשמור על התאים במדיום התמיינות chondrogenic, שינוי המדיום כל 2-3 ימים. לאחר כשלושה שבועות, DPSCs היו צריכים להתמיין לתאים דמויי כונדרוציטים.
    4. תקן את התאים על ידי דגירה שלהם עם 4% paraformaldehyde (PFA) במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הקיבוע, צבעו את התאים בכחול אלקיאני (ראו טבלת חומרים) ודמיינו אותם תחת מיקרוסקופ כדי לאשר התמיינות כונדרוגנית (איור 5).
    5. אשר את ההתמיינות של DPSCs לכונדרוציטים באמצעות טכניקות כגון צביעת Alcian Blue עבור פרוטאוגליקנים או ניתוח ביטוי גנים של סמנים כונדרוגניים כמו aggrecan, SOX9 וקולגןמסוג II 33,34.

תוצאות

הביצוע המוצלח של הפרוטוקול המתואר הניב תאי גזע של מוך השן (DPSCs) המסוגלים להתמיין בין שושלות, ולהדגים את רב-העוצמה שלהם.

מבחני כדאיות
הכדאיות של DPSCs הוערכה באמצעות בדיקת אי הכללת Trypan Blue בנקודות זמן שונות. התוצאות מראות כדאיות גבוהה באופן עקבי (יותר מ-95%) לאורך כל תקופ?...

Discussion

הפרוטוקול מתאר את הבידוד, התרבות והאפיון של תאי גזע במוך השן (DPSCs) משיניים נשירות וקבועות אנושיות. הוא כולל תיאור של אחסון והתפשטות של תאים אלה, כמו גם הערכה של פוטנציאל התמיינות החוץ גופית שלהם לאוסטאובלסטים, אדיפוציטים וכונדרוציטים35.

Chen et al.3

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

המחברים אסירי תודה לד"ר מתיו מז'וואנצ'ריל, מנהל וראש מרכז המחקר פושפאגירי בטירובאלה, על תמיכתו בתיעוד ההליכים במרכז המחקר.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
3-isobuty-l-methyl-xanthine Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAI5879
Acetic acid Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAAS001
Alcian Blue Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USARM471
Alizarin Red S staining solutionSigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAGRM894
Alkaline phosphatase -Staining kitThermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA
Alpha Minimum Essential Medium (α-MEM) Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USAGibco
Alpha Minimum Essential Medium (α-MEM) Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USAGibco
Alpha-MEM, or Alpha Minimum Essential MediumThermo Fisher Scientific ,MA 02451,USAGibco
Alpha-MEM, or Alpha Minimum Essential MediumThermo Fisher Scientific ,MA 02451,USAGibco
Antibiotic/AntimycoticSigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAP4333
Ascorbate-2-phosphateSigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA012-04802
Beta-glycerophosphate Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAG9422-10G
Biosafety cabinet-Laminar flow hoodLabconco Corporation,MO 64132-2696,USA
CD90, CD105, CD73, CD34, CD45, and HLA-DRBioLegend, Inc.CA 92121,USA
Cell strainer (70 µm )HiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai,IndiaTCP025Cell strainer
CentrifugeREMI Elektrotechnik Limited (REMI)
CentrifugeHiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai,India1101 | 1102
CO2 IncubatorThermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA
Collagenase type IWorthington Biochem. Corp. NJ 08701, USA
Collagenase type IWorthington Biochem. Corp. NJ 08701, USA
Complete Growth MediumHiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai,IndiaAT006DMEM
Conical tubes (15 or 50 )Thermo Fisher Scientific, MA, USA546021P/546041P15 mL and 50 mL
Cryo freezing containerThermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA15-350-50
CryolabelsLabel India:
Cryovial storage boxes Cryostore Storage Boxes
CryovialsThermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA
Cryovials (1.8 mL)Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USAPW1282Self standing
Culture flask (25 cm²)Corning Inc.NY 14831,USA
Culture flasksHiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai,IndiaTCG4/TCG6T25/T75
Culture PlatesHiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai,IndiaTCP129/TCP00860 mm/100 mm
Dental Diamond DiscsKomet SC 29730, USAKomet 
Dental Spoon ExcavatorBrasseler,GA 31419,USA5023591U0
DexamethasoneSigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAD4902-25MG
DexamethosoneSigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAD4902-25MG
DexamethosoneSigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAD4902-25MG
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USATC185
DispaseRoche Diagnostics,Mannheim,Germany.
DispaseRoche Diagnostics GmbH, Mannheim,Germany
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Thermo Fisher Scientific, MA, USA
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA
Ethanol (70%)HiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai,IndiaMB106
Ethanol -70%Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USAFisher Scientific
Extraction forceps Dentsply Sirona, USA
Fetal bovine serum (FBS)Thermo Fisher Scientific Inc.,MA,USAF2442-500ML
Fetal bovine serum (FBS)Thermo Fisher Scientific Inc.,MA,USAF2442-500ML
Fetal bovine serum (FBS)HiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai,IndiaRM9954
Fetal bovine serum (FBS)Thermo Fisher Scientific Inc.,MA,USAF2442-500ML
Fetal bovine serum (FBS)Thermo Fisher Scientific Inc.,MA,USAF2442-500ML
Fibronectin-coated tissue culture plateCorning Inc.Corning, NY 14831,USA
Flow cytometerBD Biosciences,CA 95131,USA
Flow cytometry bufferBD Biosciences,CA 95131,USA
Glass cover slip 22 x 22 mmHiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai,IndiaTCP017
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)Lonza Group Ltd,4002 Basel, Switzerland
High-speed dental handpiece NSK Ltd,Tokyo 8216, JapanTi-Max Z series
Horse SerumThermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA
IBMX, or 3-isobutyl-1-methylxanthineSigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA
IndomethacinPfizer Inc. NY 10017,USA
Insulin-Transferrin-Selenium (ITS)Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USAI5523
Insulin-Transferrin-Selenium (ITS)Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USAI5523
Insulin-Transferrin-Selenium (ITS) premixCorning Incorporated,MA 01876,USA
Inverted microscopeOlympus Corp.,Tokyo 163-0914,Japan
Isopropanol (60% )Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAI9516
Isopropyl alcohol Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAMB063
Laminar flow hoodThermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA
Lidocaine mixed with epinephrineDENTSPLY,NC 28277,USACitanest
Liquid NitrogenAir Liquide,75007 Paris,France
Liquid nitrogen storage tankCryo Scientific Systems Pvt. Ltd.
MicropipettesEppendorf AG,22339 Hamburg,Germany30020Accupipet-2-20 µL
Mini tissue grinderBio-Rad Lab, Inc. CA 94547,USAReadyPrep mini grinders
Minus 80 freezerBlue Star Limited
Neubauer counting chamberMarienfeld Superior,arktheidenfeld,Germany
Oil red O stainSigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA1024190250
Osteogenic Differentiation Medium (ODM) STEMCELL Technologies Inc.Vancouver, BC, V5Z 1B3,Canada
Paraformaldehyde (PFA) Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USATCL119
Penicillin-StreptomycinGibco-Thermo Fisher Scientific Inc.,MA 02451,USA
Phosphate Buffered Solution (PBS) without Ca++ and Mg++HiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai,IndiaTS1101
Phosphate-buffered saline (PBS)Thermo Fisher ScientificGibco
Phosphate-buffered saline (PBS)Thermo Fisher Scientific,MA, USAGibco
Phosphate-buffered saline (PBS)Thermo Fisher Scientific, MA, USA
Phosphate-buffered saline (PBS)Thermo Fisher Scientific, MA, USAP3813-1PAK1x PBS, pH 7.4
Proline Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA
Scalpel Blade Size 15 Swann-Morton Ltd, Sheffield, S6 2BJ,UKBDF-6955C
Sodium HypochloriteHiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai,IndiaAS1024% w/v solution
Sterile centrifuge tubesTarsons Products Pvt. Ltd.
Sterile container -20 mL3M Center, MN 55144-1000,USA3 M
Sterile phosphate-buffered saline (PBS)Sigma Aldrich, USAP3813-1PAK1x PBS, pH 7.4
Sterile pipettes (2, 5, and 10 mL )Eppendorf AG,22339 Hamburg,Germany
Sterile pipettes and tipsEppendorf India Limited
Surgical Blade HandleBecton, Dickinson and Co.,NJ,USA371030BP Handle 3
Transforming Growth Factor-beta 3 (TGF-β3)R&D Systems, Inc.MN 55413,USA
Transforming Growth Factor-beta 3 (TGF-β3)R&D Systems, Inc.MN 55413,USA
Trypan Blue 0.4% Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA
Trypan Blue 0.4% Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USATCL046
Trypan Blue 0.4% Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USATCL046
Trypsin-EDTA Gibco-Thermo Fisher Scientific Inc.,MA 02451,USA
Trypsin-EDTA 0.25%Gibco-Thermo Fisher Scientific Inc.,MA 02451,USA
Water bathThermo Fisher Scientific ,MA 02451,USABSW-01D

References

  1. Bakopoulou, A., About, I. Stem cells of dental origin: current research trends and key milestones towards clinical application. Stem Cells International. 2016, 4209891 (2016).
  2. Yamada, Y., Nakamura-Yamada, S., Konoki, R., Baba, S. Promising advances in clinical trials of dental tissue-derived cell-based regenerative medicine. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 175 (2020).
  3. Huang, G. T., Gronthos, S., Shi, S. Mesenchymal stem cells derived from dental tissues vs. those from other sources: their biology and role in regenerative medicine. Journal of Dental Research. 88 (9), 792-806 (2009).
  4. Bissels, U., Diener, Y., Eckardt, D., Bosio, A. . Regenerative medicine-from protocol to patient. , 1-25 (2016).
  5. Hyun, I. The bioethics of stem cell research and therapy. Journal of Clinical Investigation. 120 (1), 71-75 (2010).
  6. Ledesma-Martinez, E., Mendoza-Nunez, V. M., Santiago-Osorio, E. Mesenchymal Stem Cells Derived from Dental Pulp: A Review. Stem Cells International. 2016, 4709572 (2016).
  7. Egusa, H., Sonoyama, W., Nishimura, M., Atsuta, I., Akiyama, K. Stem cells in dentistry--part I: stem cell sources. Journal of Prosthodontic Research. 56 (3), 151-165 (2012).
  8. Galler, K. M., Eidt, A., Schmalz, G. Cell-free approaches for dental pulp tissue engineering. Journal of Endodontics. 40, 41-45 (2014).
  9. Smith, A. J., Patel, M., Graham, L., Sloan, A. J., Cooper, P. R. Dentine regeneration: key roles for stem cells and molecular signalling. Oral Biosciences & Medicine. 2, 127-132 (2005).
  10. Bernardi, L., et al. The isolation of stem cells from human deciduous teeth pulp is related to the physiological process of resorption. Journal of Endodontics. 37 (7), 973-979 (2011).
  11. Saha, R., Tandon, S., Rajendran, R., Nayak, R. Dental pulp stem cells from primary teeth quality analysis: laboratory procedures. Journal of Clinical Pediatric Dentistry. 36 (2), 167-173 (2011).
  12. Miura, M., et al. SHED: stem cells from human exfoliated deciduous teeth. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (10), 5807-5812 (2003).
  13. Ferro, F., Spelat, R., Beltrami, A. P., Cesselli, D., Curcio, F. Isolation and characterization of human dental pulp derived stem cells by using media containing low human serum percentage as clinical grade substitutes for bovine serum. PLoS One. 7 (11), 48945 (2012).
  14. Spath, L., et al. Explant-derived human dental pulp stem cells enhance differentiation and proliferation potentials. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 14, 1635-1644 (2010).
  15. Gronthos, S., Mankani, M., Brahim, J., Robey, P. G., Shi, S. Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (25), 13625-13630 (2000).
  16. Takeda-Kawaguchi, T., et al. Derivation of iPSCs after culture of human dental pulp cells under defined conditions. PLoS One. 9 (12), 115392 (2014).
  17. Hilkens, P., et al. Effect of isolation methodology on stem cell properties and multilineage differentiation potential of human dental pulp stem cells. Cell and Tissue Research. 353 (1), 65-78 (2013).
  18. Karamzadeh, R., Eslaminejad, M. B., Aflatoonian, R. Isolation, characterization and comparative differentiation of human dental pulp stem cells derived from permanent teeth by using two different methods. Journal of Visualized Experiments. (69), e4372 (2012).
  19. Lucaciu, O., et al. Dental follicle stem cells in bone regeneration on titanium implants. BMC Biotechnology. 15, 114 (2015).
  20. Perry, B. C., et al. Collection, cryopreservation, and characterization of human dental pulp-derived mesenchymal stem cells for banking and clinical use. Tissue Engineering Part C: Methods. 14 (2), 149-156 (2008).
  21. Zainuri, M., Putri, R. R., Bachtiar, E. W. Establishing methods for isolation of stem cells from human exfoliated deciduous from carious deciduous teeth. Interventional Medicine & Applied Science. 10 (1), 33-37 (2018).
  22. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  23. Nakayama, H., Iohara, K., Hayashi, Y., Okuwa, Y., Kurita, K., Nakashima, M. Enhanced regeneration potential of mobilized dental pulp stem cells from immature teeth. Oral Diseases. 23 (5), 620-628 (2017).
  24. Cunningham, R. E. Indirect immunofluorescent labeling of fixed cells. Methods in Molecular Biology. 588, 335-339 (2010).
  25. Zimmerlin, L., Donnenberg, V. S., Rubin, J. P., Donnenberg, A. D. Mesenchymal markers on human adipose stem/progenitor cells. Cytometry A. 83 (1), 134-140 (2013).
  26. Alansary, M., Drummond, B., Coates, D. Immunocytochemical characterization of primary teeth pulp stem cells from three stages of resorption in serum-free medium. Dental Traumatology. 37 (1), 90-102 (2021).
  27. Lei, T., Zhang, X., Du, H. Characteristics, classification, and application of stem cells derived from human teeth. Stem Cells International. 2021, 8886854 (2021).
  28. Kalina, T., et al. CD Maps-dynamic profiling of CD1-CD100 surface expression on human leukocyte and lymphocyte subsets. Frontiers in Immunology. 10, 2434 (2019).
  29. Luzuriaga, J., et al. Osteogenic differentiation of human dental pulp stem cells in decellularised adipose tissue solid foams. European Cells & Materials eCM. 43, 112-129 (2022).
  30. Volponi, A. A., Gentleman, E., Fatscher, R., Pang, Y. W., Gentleman, M. M., Sharpe, P. T. Composition of Mineral Produced by Dental Mesenchymal Stem Cells. Journal of Dental Research. 94 (11), 1568-1574 (2015).
  31. Nozaki, T., Ohura, K. Gene expression profile of dental pulp cells during differentiation into an adipocyte lineage. Journal of Pharmacological Sciences. 115 (3), 354-363 (2011).
  32. Kobayashi, T., Torii, D., Iwata, T., Izumi, Y., Nasu, M., Tsutsui, T. W. Characterization of proliferation, differentiation potential, and gene expression among clonal cultures of human dental pulp cells. Human Cell. 33 (3), 490-501 (2020).
  33. Westin, C. B., Trinca, R. B., Zuliani, C., Coimbra, I. B., Moraes, A. M. Differentiation of dental pulp stem cells into chondrocytes upon culture on porous chitosan-xanthan scaffolds in the presence of kartogenin. Materials Science & Engineering C-Materials for Biological Applications. 80, 594-602 (2017).
  34. Rizk, A., Rabie, A. B. Human dental pulp stem cells expressing transforming growth factor beta3 transgene for cartilage-like tissue engineering. Cytotherapy. 15 (6), 712-725 (2013).
  35. Anil, S., Ramadoss, R., Thomas, N. -. G., George, J. -. M., Sweety, V. -. K. Dental pulp stem cells and banking of teeth as a lifesaving therapeutic vista. Biocell. 47 (1), 71-80 (2023).
  36. Chen, Y. K., Huang, A. H., Chan, A. W., Shieh, T. Y., Lin, L. M. Human dental pulp stem cells derived from different cryopreservation methods of human dental pulp tissues of diseased teeth. Journal of Oral Pathology & Medicine. 40 (10), 793-800 (2011).
  37. Pereira, L. O., et al. Comparison of stem cell properties of cells isolated from normal and inflamed dental pulps. International Endodontic Journal. 45 (12), 1080-1090 (2012).
  38. Malekfar, A., Valli, K. S., Kanafi, M. M., Bhonde, R. R. Isolation and characterization of human dental pulp stem cells from cryopreserved pulp tissues obtained from teeth with irreversible pulpitis. Journal of Endodontics. 42 (1), 76-81 (2016).
  39. Werle, S. B., et al. Carious deciduous teeth are a potential source for dental pulp stem cells. Clinical Oral Investigations. 20 (1), 75-81 (2016).
  40. Tsai, A. I., et al. Isolation of mesenchymal stem cells from human deciduous teeth pulp. Biomed Research International. 2017, 2851906 (2017).
  41. Paglia, L. Stem cells, a resource for patients and dentists. European Archives of Paediatric Dentistry. 17 (2), 89 (2016).
  42. Kerkis, I., et al. Isolation and characterization of a population of immature dental pulp stem cells expressing OCT-4 and other embryonic stem cell markers. Cells Tissues Organs. 184 (3-4), 105-116 (2006).
  43. Rodas-Junco, B. A., Villicana, C. Dental pulp stem cells: current advances in isolation, expansion and preservation. Tissue Engineering and Regenerative. 14 (4), 333-347 (2017).
  44. Shi, S., Robey, P. G., Gronthos, S. Comparison of human dental pulp and bone marrow stromal stem cells by cDNA microarray analysis. Bone. 29 (6), 532-539 (2001).
  45. Mortada, I., Mortada, R. Dental pulp stem cells and osteogenesis: an update. Cytotechnology. 70 (5), 1479-1486 (2018).
  46. Pagella, P., Neto, E., Lamghari, M., Mitsiadis, T. A. Investigation of orofacial stem cell niches and their innervation through microfluidic devices. European Cells & Materials eCM. 29, 213-223 (2015).
  47. Chalisserry, E. P., Nam, S. Y., Park, S. H., Anil, S. Therapeutic potential of dental stem cells. Journal of Tissue Engineering. 8, 2041731417702531 (2017).
  48. Pilbauerova, N., Soukup, T., Suchankova Kleplova, T., Suchanek, J. Enzymatic isolation, amplification and characterization of dental pulp stem cells. Folia Biologica (Praha). 65 (3), 124-133 (2019).
  49. Ebrahimi Dastgurdi, M., Ejeian, F., Nematollahi, A., Motaghi, A., Nasr-Esfahani, M. H. Comparison of two digestion strategies on characteristics and differentiation potential of human dental pulp stem cells. Archives of Oral Biology. 93, 74-79 (2018).
  50. Ducret, M., et al. Manufacturing of dental pulp cell-based products from human third molars: current strategies and future investigations. Frontiers in Physiology. 6, 213 (2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

DPSCs

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved