גישות משלימות לחקירת שטף מיטופגיה בתאי β הלבלב

Summary

פרוטוקול זה מתאר שתי שיטות לניתוח כמותי של מיטופגיה בתאי β של הלבלב: הראשונה, שילוב של צבעים ספציפיים למיטוכונדריה החדירים, ושנית, כתב מיטופגיה מקודד גנטית. שתי טכניקות אלה משלימות זו את זו וניתנות לפריסה על בסיס צרכים ספציפיים, ומאפשרות גמישות ודיוק בטיפול כמותי בבקרת איכות מיטוכונדריאלית.

Abstract

מיטופגיה היא מנגנון בקרת איכות הכרחי לשמירה על תפקוד מיטוכונדריאלי אופטימלי. מיטופגיה לא מתפקדת של תאי β גורמת לשחרור אינסולין לא מספיק. הערכות כמותיות מתקדמות של מיטופגיה דורשות לעתים קרובות שימוש במדווחים גנטיים. מודל העכבר mt-Keima, המבטא בדיקה ממוקדת pH רגישה למיטוכונדריה בעלת יחס עירור כפול לכימות מיטופגיה באמצעות ציטומטריית זרימה, עבר אופטימיזציה בתאי β. ניתן להשתמש ביחס בין פליטות אורכי גל mt-Keima חומציים לנייטרליים כדי לכמת מיטופגיה בצורה איתנה. עם זאת, שימוש בכתבי מיטופגיה גנטית יכול להיות מאתגר כאשר עובדים עם מודלים גנטיים מורכבים של עכברים או תאים קשים להעברה, כגון איים אנושיים ראשוניים. פרוטוקול זה מתאר שיטה חדשנית מבוססת צבע משלימה לכימות מיטופגיה של β תאים באיים ראשוניים באמצעות MtPhagy. MtPhagy הוא צבע רגיש ל-pH וחדיר לתאים שמצטבר במיטוכונדריה ומגביר את עוצמת הפלואורסצנטיות שלו כאשר מיטוכונדריה נמצאים בסביבות pH נמוכות, כמו ליזוזומים במהלך מיטופגיה. על ידי שילוב צבע MtPhagy עם Fluozin-3-AM, מחוון Zn²⁺ הבוחר עבור תאי β, וטטרמתילרודמין, אתיל אסטר (TMRE) להערכת פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית, ניתן לכמת שטף מיטופגיה באופן ספציפי בתאי β באמצעות ציטומטריית זרימה. שתי גישות אלה משלימות מאוד, ומאפשרות גמישות ודיוק בהערכת בקרת איכות מיטוכונדריאלית במודלים רבים של תאי β.

Introduction

תאי β בלבלב מייצרים ומפרישים אינסולין כדי לעמוד בדרישות המטבוליות, ותפקוד לקוי של תאי β אחראי להתפרצות היפרגליקמיה וסוכרת הן בסוכרת מסוג 1 והן בסוכרת מסוג 2. תאי β משלבים מטבוליזם של גלוקוז עם הפרשת אינסולין באמצעות אנרגיה מיטוכונדריאלית ופלט מטבולי, אשר תלויים בעתודה של מסה מיטוכונדריאלית תפקודית ^1,2,3. כדי לשמור על תפקוד מיטבי של תאי β, תאי β מסתמכים על מנגנוני בקרת איכות מיטוכונדריה כדי להסיר מיטוכונדריה מיושנים או פגומים ולשמר את המסה המיטוכונדריאלית התפקודית⁴. אוטופגיה מיטוכונדריאלית סלקטיבית, הידועה גם בשם מיטופגיה, היא מרכיב מרכזי במסלול בקרת הא....

Protocol

המחקרים בבעלי חיים המוצגים בפרוטוקול זה נבדקו ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת מישיגן. במחקר זה נעשה שימוש בעכברי C57BL/6J זכרים בני עשרים שבועות, שקיבלו דיאטת שומן רגילה של 15 שבועות (RFD) או דיאטה עתירת שומן (HFD).

1. הערכת מיטופגיה באמצעות גישת MtPhagy מבוססת צבע (שיטה 1)

1. הכנת איון עכבר וטיפול בו
   1. בצע תרבית איים וחשיפה לואלינומיצין לפי השלבים הבאים.
      1. בודדו איים מעכברי דיאטת שומן רגילה (RFD) או דיאטה עתירת שומן (HFD, 60 קק"ל% שומן¹⁹),^{בהתאם לשיטות 2,10} שתוארו קודם לכן.
      2. דגימות....

תוצאות

הערכת מיטופגיה באמצעות גישת MtPhagy מבוססת צבע
גישה מבוססת צבע זו הותאמה לניתוח שטף מיטופגיה בתוך תאי β עכבר ראשוניים ללא צורך בכתב גנטי, תוך שימוש בפלוזין-3-AM, TMRE ו- MtPhagy וכן DAPI כדי להוציא תאים מתים. על ידי זיווג צבעים אלה עם valinomycin כדי לגרום mitophagy, פרוטוקול זה מתאר שיטה מבוססת צבע למדו.......

Discussion

פרוטוקול זה תיאר שתי שיטות משלימות לכימות שטף מיטופגיה באיים עכבריים ראשוניים מנותקים. בשיטת mt-Keima כומתה עלייה במיטופגיה כיחס מוגבר של תאים חומציים (561 ננומטר)/ניטרליים (405 ננומטר), ואילו בשיטת MtPhagy כומתה שטף מיטופגיה מוגבר כגידול באוכלוסיית^{התאים הגבוהה MtPhagyHigh}TMRE. שיטות אלה.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibiotic-Antimycotic	Life Technologies	15240-062
Attune NxT Flow Cytometer	Thermofisher Scientific	A24858
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)	Thermofisher Scientific	D1306	DAPI reconstituted in ddH2O to reach 0.2 µg/mL stock
Dimethyl Sulfoxide	Sigma-Aldrich	317275
Fatty Acid Free heat shock BSA powder	Equitech	BAH66
Fetal bovine serum	Gemini Bio	900-108
Fluozin-3AM	Thermofisher Scientific	F24195	100 μg Fluozin-3AM powder reconstituted in 51 μL DMSO and 51 μL Pluronic F-127 to reach 1 mM stock.
Gibco RPMI 1640 Medium	Fisher Scientific	11-875-093
HEPES (1M)	Life Technologies	15630-080
MtPhagy dye	Dojindo	MT02-10	5 μg MtPhagy powder reconstituted with 50 μL DMSO to reach 100 μM stock.
MtPhagy dye	Dojindo	MT02-10
Penicillin-Streptomycin (100x)	Life Technologies	15140-122	1x Solution used in procotol by diluting 1:10 in ddH2O
Phosphate buffered saline, 10x	Fisher Scientific	BP399-20	1x Solution used in procotol by diluting 1:10 in ddH2O
Sodium Pyruvate (100x)	Life Technologies	11360-070	5 μg MtPhagy powder reconstituted with 50 μL DMSO to reach 100 μM stock.
TMRE [Tetramethylrhodamine, ethyl ester, perchlorate]	Anaspec	AS-88061	TMRE powder reconstituted in DMSO to reach 100 μM stock.
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Thermofisher Scientific	25300054
Valinomycin	Sigma	V0627	Valinomycin powder reconsituted in DMSO to reach 250 nM stock.