גישה מקיפה לניתוח מרכיבי התא של קרישי דם מוחיים

Summary

מחקר זה מתאר שיטה מהירה ויעילה לניתוח מרכיבי התא של קרישי דם מוחיים באמצעות המסת קרישי דם, צביעת תאים ובדיקת דם שגרתית.

Abstract

פקקת מוחית, קריש דם בעורק מוחי או בווריד, הוא הסוג הנפוץ ביותר של אוטם מוחי. חקר מרכיבי התאים של קרישי דם מוחיים חשוב לאבחון, טיפול ופרוגנוזה. עם זאת, הגישות הנוכחיות לחקר מרכיבי התא של קרישי הדם מבוססות בעיקר על צביעה באתרה , שאינה מתאימה למחקר מקיף של מרכיבי התא מכיוון שהתאים עטופים היטב בקרישי הדם. מחקרים קודמים בודדו בהצלחה אנזים פיברינוליטי (sFE) מ-Sipunculus nudus, שיכול לפרק את הפיברין הצולב, באופן ישיר, ולשחרר את מרכיבי התא. מחקר זה ביסס שיטה מקיפה המבוססת על sFE לחקר מרכיבי התא של פקקת מוחית. פרוטוקול זה כולל המסת קרישי דם, שחרור תאים, צביעת תאים ובדיקת דם שגרתית. על פי שיטה זו, ניתן היה לחקור את מרכיבי התא באופן כמותי ואיכותי. התוצאות המייצגות של ניסויים בשיטה זו מוצגות.

Introduction

מחלת כלי דם במוח היא אחת משלוש מחלות עיקריות שיכולות לאיים על בריאות האדם, ביניהן מחלת כלי דם איסכמית במוח מהווה יותר מ -80%. פקקת מוחית ופקקת ורידים מוחיים הן מחלות כלי הדם האיסכמיות המודאגות ביותר כיום, הנגרמות בעיקר על ידי קרישי דם מוחיים ^1,2. אם הטיפול לא נעשה כראוי, יהיו לו שיעורי נכות ותמותה גבוהים ושיעור הישנות גבוה לאחר השחרור³.

לאחרונה, מספר גדל והולך של מחקרים הראו כי מרכיבי התאים של קרישי דם מוחיים נמצאים בקורלציה הדוקה עם האבחון, הטיפול והפרוגנוזה של פקקת מוחית ^4,5,6. לכן, זמינות הנתונים על הרכב פקקת, במיוחד מרכיבי התא, חשובה לאבחון קליני וטיפול. למרבה הצער, השיטות הקיימות כיום אינן יכולות לנתח באופן מקיף את מרכיב קריש הדם באופן כמותי ואיכותי. לדוגמה, צביעה באתרו המבוססת על Martius Scarlett Blue יכולה לחקור רק את תאי הדם האדומים/לבנים של פרוסות מסוימות של קריש הדם⁷. צביעה באתרו המבוססת על אימונוהיסטוכימיה (IHC) יכולה לחקור רק רכיבי דם מוגבלים של פרוסות מסוימות של הקריש^{באמצעות נוגדנים} 8. השיטות המיקרוסקופיות מבוססות התמונה עוסקות רק במבנה הספציפי של קריש⁹. יתר על כן, כל השיטות האלה הן מייגעות וגוזלות זמן¹⁰. עד כה, לא דווחו ההליכים ללימוד כמותי ואיכותי של מרכיבי תאי תרומבי מוחיים. ידוע כי הפיברין הצולב עוטף בחוזקה את תאי הדם בקרישי הדם¹¹. כתוצאה מכך, הפירוק הספציפי של הפיברין הצולב, ושחרור התאים השלמים, הוא קריטי לניתוח מדויק של מרכיבי התא.

עבודות קודמות בודדו אנזים פיברינוליטי מ-Sipunculus nudus (sFE), שיכול לפרק את הפיברין באופן ספציפי ומהיר¹². כאן הוצעה שיטה לניתוח מרכיבי התא של תרומבי המוח בהתבסס על הפעילות הייחודית של sFE. פרוטוקול זה השתמש ב- sFE כדי לפרק את הפיברין של קרישי דם תחילה ולאחר מכן ניתח את מרכיבי התא על ידי צביעת רייט ובדיקת דם שגרתית^13,14. על פי שיטה זו, ניתן ללמוד כמותית ואיכותית את מרכיבי התא של תרומבי מוחי. פרוטוקול פשוט ויעיל זה עשוי להיות מיושם עבור ניתוח רכיבי התא של קרישי דם אחרים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

המחקר בוצע בהתאם להנחיות המוסדיות של ועדת האתיקה הרפואית של אוניברסיטת Huaqiao. קרישי הדם המוחיים הוסרו בניתוח ונאספו בבית החולים הראשון Quanzhou, המסונף לאוניברסיטה הרפואית פוג'יאן, בהסכמה מדעת של החולים.

1. טיפול מקדים לקריש דם

1. מניחים את הקרישים על צלחת נקייה, מוסיפים 5 מ"ל מלח פיזיולוגי עם טוויטר, מנערים את התבשיל בעדינות ומסירים את המלח עם פיפטה.
   הערה: יש לחזור על השטיפה שלוש פעמים.
2. חותכים את הקרישים לחתיכות קטנות יותר (קטנות מ 5 מ"מ x 5 מ"מ x 5 מ"מ) עם מספריים. מוסיפים 5 מ"ל מלח פיזיולוגי, מנערים את המנה בעדינות ומסירים את המלח עם פיפטה.
   הערה: יש לחזור על השטיפה שלוש פעמים. יש לוודא שלא נפלטות חתיכות קריש דם במהלך השטיפה.
3. מעבירים את הקרישים לצלחת U נקייה אחרת.
   הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן (לאחסן את הצלחת ב 2-8 ° C) ולהפעיל מחדש מאוחר יותר.

2. טרומבוליזה

1. הכן את פתרון העבודה sFE על ידי התאמת ריכוז sFE ל 2000 U/mL עם מלוחים פיזיולוגיים.
   הערה: ה-sFE הוכן בהתאם לפרוטוקולים המבוססים היטב של מעבדת טאנג¹⁵.
2. הוסף 300 μL של תמיסת עבודה sFE לקרישי הדם שטופלו מראש.
3. בצע את סבב ההשפלה הראשון.
   1. לדגור על תערובת של sFE וקרישי דם ב 37 ° C במשך 0.5 שעות.
      הערה: הכתם שטופל במי מלח פיזיולוגיים הוגדר כבקרה שלילית. אין לסובב את הדגימה על השייקר.
   2. מערבבים את הדגימה בעדינות. מעבירים את החלק הנוזלי לצינור נקי אחר עם פיפטה נקייה.
      הערה: הקרישים הנותרים שימשו לסבב נוסף של התפרקות.
   3. צנטריפוגה את החלק הנוזלי ב 200 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
   4. מעבירים את הסופרנאטנט לצינור נקי אחר עם פיפטה כדי לקבל את תמיסת ה-sFE המשוחזרת.
   5. מערבבים את משקעים התא עם 50 μL של מלוחים פיזיולוגיים בעדינות.
      הערה: תערובת התאים אוחסנה 2-8 °C לשימוש מאוחר יותר.
4. בצע השפלה לאחר מכן.
   1. יש לפרק את הקרישים הנותרים (שלב 2.3.2) עם תמיסת sFE המשוחזרת (שלב 2.3.4) ב-37°C למשך 0.5 שעות.
      הערה: שאר השלבים היו זהים לסבב ההשפלה הראשון. תהליך הפירוק הסתיים עד שכל הקרישים התפרקו.
5. ביצוע איסוף תאים.
   1. הכינו את דגימת תאי הדם על ידי איסוף תערובת התאים של כל סבב התפרקות.

3. הכתמים של רייט

1. בצע מריחת תאים.
   1. התאם תאים לצפיפות של 1 x 10⁶ תאים/מ"ל.
   2. הוסף 5 μL של התאים לשקופית זכוכית מצופה פולי-L ליזין, ולאחר מכן מרח אותם באמצעות החלקת הכיסוי.
   3. יש לאדות את הנוזל בטמפרטורת החדר.
2. בצעו את הצביעה.
   1. הוסיפו 200 μL של הצבע של רייט (ראו טבלת חומרים) למריחת התא בעדינות, והוסיפו 600 μL של צבע B של רייט כדי לערבב באופן שווה.  יש להכתים למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
   2. שטפו את הצבע בעדינות במים נקיים.
      הערה: ניתן לאחסן את כתם התאים המוכתמים בטמפרטורת החדר לשימוש מאוחר יותר.
3. בצע הדמיה מיקרוסקופית.
   1. בחנו את התאים המוכתמים באמצעות מיקרוסקופ אור (ראו טבלת חומרים).

4. בדיקת דם שגרתית

1. התאם תאים לצפיפות של 1 x 10⁶ תאים/מ"ל.
2. לנתח את מרכיבי התא כגון טסיות דם, אריתרוציטים, תאי דם לבנים, לימפוציטים, נויטרופילים, מונוציטים, אאוזינופילים, בזופילים וגרנולוציטים לא בשלים באמצעות מנתח אוטוהמטולוגיה בהתאם להוראות היצרן (ראה טבלת חומרים).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

בשלב הראשוני של תהליך ההשפלה, נמצא כי קרישי הדם היו בעלי מבנה קומפקטי אדום, ותמיסת העבודה הייתה חסרת צבע. לאחר הדגירה במשך 30 דקות, תמיסת העבודה הפכה לאדומה בהירה, מה שמצביע על כך שתאי הדם המוצלבים שוחררו לתמיסת העבודה. רוב הקרישים הומסו בעת הארכת זמן הדגירה ל-5 שעות, ותמיסת העבודה הפכה לאדומה...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

sFE הוא סוכן פיברינוליטי שיכול לפרק את הפיברין באופן ישיר ויעיל^12,16. כאן, נעשה שימוש ב-sFE כדי לפרק את הפיברין הצולב-מקושר של קרישי הדם במוח, לשחרר את התאים הסגורים בתוך קרישי הדם, ולנתח את מרכיבי התאים של הקרישים באופן איכותי וכמותי. נתוני המיקרוסקופ ובדיקת הדם ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agglutination Reaction Plate	ROTEST	RTB-4003
Auto Hematology Analyzer	SYSMEX	XNB2
Automatic Vertical Pressure Steam Sterilizer	SANYO	MLS-3750
Centrifuge Tube (1.5 mL)	Biosharp	BS-15-M
Clean bench	AIRTECH	BLB-1600
Constant Temperature Incubator	JINGHONG	JHS-400
Culture Dish (100 mm)	NEST	704001
DHG Series Heating and Drying Oven	SENXIN	DGG-9140AD
Electronic Analytical Balance	DENVER	TP-213
Filter Membrane (0.22 µm)	Millex GP	SLGP033NK
Micro Refrigerated Centrifuge	Cence	H1650-W
Microscope Slides	CITOGLAS	01-30253-50
Milli-Q Reference	Millipore	Z00QSV0CN
Normal Saline	CISEN	H37022337
Optical Microscope	Nikon	ECLIPSE E100
Parafilm	Bemis	PM-996
Phosphate-Buffered Saline	Beyotime	C0221A
Pipette Tip (1 mL )	Axygene	T-1000XT-C
Pipette Tip (200 µL)	Axygene	T-200XT-C
Pipettor (1 mL)	Thermo Fisher Scientific	ZY18723
Pipettor (200 µL)	Thermo Fisher Scientific	ZY20280
Scalpel	MARTOR	23111
Small-sized Vortex Oscillator	Kylin-Bell	VORTEX KB3
Tweezer	Hystic	HKQS-180
Wright Staining Solution	Beyotime	C0135-500ml