מיצוי DNA דיאטום מדגימות מים ורקמות

Summary

מאמר זה מתאר פרוטוקול למיצוי DNA דיאטומי באמצעות ערכת מיצוי DNA משותפת שונה.

Abstract

בדיקת דיאטום היא אמצעי עזר חיוני בפרקטיקה המשפטית כדי לקבוע אם הגופה טבעה במים ולהסיק את מקום הטביעה. בדיקות דיאטום הן גם תוכן מחקרי חשוב בתחום הסביבה והפלנקטון. טכנולוגיית בדיקת הביולוגיה המולקולרית הדיאטומית, המתמקדת בדנ"א דיאטומי כאובייקט המחקר העיקרי, היא שיטה חדשה לבדיקת דיאאטומים. מיצוי DNA דיאטומי הוא הבסיס לבדיקה מולקולרית דיאאטומית. כיום, הערכות הנפוצות למיצוי DNA דיאטום הן יקרות, מה שמגדיל את עלות ביצוע המחקר הנלווה. המעבדה שלנו שיפרה את ערכת המיצוי המהירה הכללית של DNA גנומי בדם שלם והשיגה אפקט מיצוי DNA דיאטום משביע רצון, ובכך סיפקה פתרון חלופי, חסכוני ובמחיר סביר למיצוי DNA המבוסס על חרוזי זכוכית למחקר קשור. הדנ"א הדיאטום המופק באמצעות פרוטוקול זה יכול לספק יישומים רבים במורד הזרם, כגון PCR וריצוף.

Introduction

בפרקטיקה הפורנזית, הקביעה אם גופה שנמצאה במים טובעת או הושלכה למים לאחר המוות חיונית לפתרון הראוי של המקרה¹. זהו גם אחד הנושאים הקשים שיש לפתור בדחיפות בפרקטיקה משפטית². דיאטומים נמצאים בשפע בסביבה הטבעית (במיוחד במים)^3,4. בתהליך של טביעה, עקב היפוקסיה ותגובת מתח, אנשים יהיו תנועות נשימה אינטנסיביות לשאוף כמות גדולה של נוזל טביעה. לכן, הדיאטומים במים נכנסים לריאה עם הנוזל הטובע, וחלק מהדיאטומים יכולים להיכנס למחזור הדם דרך מחסום הנאדיות-נימים ולהתפשט לאיברים פנימיים עם זרימת הדם ^5,6. גילוי דיאטומים ברקמות....

Protocol

מחקר זה אושר על ידי ועדת האתיקה של האוניברסיטה הרפואית של היינאן. דגימות הרקמה ששימשו במחקר זה אינן נחשבות למחקרים המערבים נבדקים אנושיים. דגימות אלה הושגו לצורך אבחון פתולוגי פורנזי, והשאר שימשו להפקת DNA דיאטומי בניסוי זה. חוקרים אינם יכולים לזהות בקלות אנשים כדי לקבל הסכמה מדעת מבעלי עניין רלוונטיים.

הערה: כדי להבטיח את התחולה הכללית של שיטת המחקר שדווחה בניסוי זה, ניסוי זה פעל למעשה לפי הוראות ההפעלה של הערכה בה נעשה שימוש, ורק כמה שלבים שונו. דגימות המים ששימשו בניסוי הזה נלקחו באופן אקראי מבריכות ליד המעבדה (איור משלים 1A). בניסוי הזה, רקמת הריאה של הגוף הטבוע אושרה כרקמת המחקר כדי להדגים את פרוטוקול המיצוי (א....

תוצאות

מכיוון שתמיסת הדנ"א המופקת בשיטת מיצוי הדנ"א הנהוגה כיום מכילה את כל רכיבי הדנ"א ממקורות שונים בדגימה, הדנ"א המתקבל בפרוטוקול זה לא היה יוצא מן הכלל. לכן, פתרון הדנ"א לא היה רק פתרון של דנ"א גנומי דיאטומי. הפריימרים שיכולים להגביר באופן ספציפי מקטעי rDNA diatom 18S נבחרו על ידי עיון בספרות 22,23,24.

Discussion

תאי דיאטום מוגנים על ידי דפנות תאים סיליקיות קשות¹⁷, ויש להרוס מבנה זה כדי לחלץ דנ"א דיאטומי. ערכות רגילות אינן הורסות בקלות את הקליפה הסיליקית של דיאטומים; לכן קשה לחלץ בהצלחה DNA דיאטום²¹. המעבדה שלנו שיפרה את ערכת מיצוי הדנ"א בדם הנפוצה ביותר, והוסיפה חרוזי זכוכית ב.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Binding Buffer	BioTeke	B010006022	rapidly lysing cells
ChemoHS qPCR Mix	Monad	00007547-120506	qPCR Mix
D2000 DNA ladder	Real-Times(Beijing) Biotechnology	RTM415	Measure the position of electrophoretic bands
D512	Taihe Biotechnology	TW21109196	forword primer
D978	Taihe Biotechnology	TW21109197	reverse primer
Elution buffer	BioTeke	B010006022	A low-salt elution buffer washes off the DNA
Glass bead	Yingxu Chemical Machinery(Shanghai)	70181000	Special glass beads for dispersing and grinding
Import adsorption column	BioTeke	B2008006022	Adsorption column with silica matrix membrane
Inhibitor Removal Buffer	BioTeke	B010006022	Removal of Inhibitors in DNA Extraction
Isopropanol	BioTeke	B010006022	Precipitate or isolate DNA
MIX-30S Mini Mixer	Miulab	MUC881206	oscillatory action
Proteinase K	BioTeke	B010006022	Inactivation of intracellular nucleases and other proteins
Rotor-Gene Q 5plex HRM	Qiagen	R1116175	real-time fluorescence quantification PCR
Speed Micro-Centrifuge	Scilogex	9013001121	centrifuge
Tanon 3500R Gel Imager	Tanon	16T5553R-455	gel imaging
Taq Mix Pro	Monad	00007808-140534	PCR Mix
Thermo Cycler	Zhuhai Hema	VRB020A	ordinary PCR
Wash Buffer	BioTeke	B010006022	Remove impurities such as cell metabolites