מערכת בדיקת דורסיפלקסיה פסיבית בקרסול למודל In Vivo של טנדינופתיה הנגרמת על ידי שימוש יתר

Summary

פרוטוקול זה מציג מערכת בדיקה המשמשת לגרימת פציעות עייפות ניתנות לכימות ומבוקרות בגיד אכילס של חולדה עבור מודל in-vivo של טנדינופתיה הנגרמת על ידי שימוש יתר. ההליך מורכב מהצמדת קרסול החולדה למפעיל מפרק המבצע דורסיפלקסיה פסיבית של הקרסול עם סקריפט MATLAB בהתאמה אישית.

Abstract

טנדינופתיה היא מצב גידים כרוני הגורם לכאבים ולאובדן תפקוד ונגרם כתוצאה מעומס יתר חוזר ונשנה של הגיד וזמן החלמה מוגבל. פרוטוקול זה מתאר מערכת בדיקה המפעילה באופן מחזורי עומסים מכניים באמצעות דורסיפלקסיה פסיבית על גיד אכילס של החולדה. הקוד הכתוב בהתאמה אישית מורכב ממדידות טעינה לפני ואחרי מחזוריות כדי להעריך את ההשפעות של פרוטוקול הטעינה יחד עם משטר העמסת עייפות מחזורית מבוסס בקרת משוב.

במחקר הזה השתמשנו ב-25 חולדות של ספראג-דולי, כאשר 5 חולדות בכל קבוצה קיבלו 500, 1,000, 2,000, 3,600 או 7,200 מחזורים של עומסי עייפות. חושבו ההבדלים באחוזים בין מדידות ההעמסה לפני ואחרי ההעמסה המחזורית של ההיסטרזיס, שיא הלחץ ומודולי ההעמסה והפריקה. התוצאות מראות כי המערכת יכולה לגרום דרגות שונות של נזק לגיד אכילס בהתבסס על מספר העומסים המופעלים. מערכת זו מציעה גישה חדשנית להפעלת דרגות שונות ופיזיולוגיות של עומסים מחזוריים על גיד אכילס עבור מודל in vivo של פגיעה בגיד כתוצאה מעייפות.

Introduction

מכיוון שגידים מחברים שריר לעצם וחווים תנועות חוזרות ונשנות מדי יום במהלך חייהם, הם נוטים מאוד לפציעות שימוש יתר שהן כואבות ומגבילות וגורמות לתפקוד מכני לקוי, המשפיעות על 30-50% מהאוכלוסייה¹. טנדינופתיות הן מצבים כרוניים הנחשבים לפציעות שימוש יתר עקב תנועות עייפות חוזרות ונשנות וריפוי לקוי לרמות שלפני הפציעה. הן הגפיים העליונות והן התחתונות מושפעות בדרך כלל, כולל השרוול המסובב, המרפק, גיד אכילס וגיד הפטלר 2,3,4,5. טנדינופתיה אכילס נפוצה בפעילויות הכוללות ריצה וקפיצה, במיוחד ספורטאים המעורבים באתלטיקה קלה, ריצה למרחקים בינוניים וארוכים, טניס וענפי ספורט כדור אחרים, ומשפיעה על 7-9% מהרצים ^6,7. פציעות מריצה וקפיצה עלולות לגרום גם לדורסיפלקסיה מוגבלת בקרסול, המהווה גורם סיכון לאכילס וגידי פטלר ^8,9,10. לפיכך, יש צורך בהערכה ואפיון טובים יותר של גידים, אשר מחקר זה יכול לספק כמודל חולדה של דורסיפלקסיה פסיבית בקרסול עבור שימוש יתר בגיד אכילס.

עבודה קודמת באמצעות מודלים של בעלי חיים קטנים נועדה לחקור את התפתחות וסמנים של טנדינופתיה. אלה כוללים פעילות גופנית על הליכון, הגעה חוזרת, העמסת גיד ישירה, זריקות collagenase, ניתוח, ומחקרי מבחנה 11,12,13,14,15,16. למרות שהספרות נהנתה מזיהוי סמני נזק משימוש במודלים אלה של טנדינופתיה, המגבלות כוללות העמסת הגיד בתנועות מפרקים שאינן רלוונטיות פיזיולוגית, כמו במקרה של העמסה ישירה של הגיד, אי מדידה ישירה של עומסים מופעלים, כגון במחקרי הליכון, ולא שימוש בשימוש יתר פיזיולוגי, כמו במקרה של זריקות קולגנאז, בין היתר. לשם כך, מחקר זה ביקש לפתח מערכת המפעילה עומסים מכומתים באופן לא פולשני על גיד אכילס עם יישום למחקרי טנדינופתיה הנגרמים על ידי שימוש יתר כדי למלא את הפערים במודלים של בעלי חיים קטנים שפותחו בעבר עבור טנדינופתיה. ביצענו מחקר פיילוט כדי להדגים שהמערכת גורמת לשינויים הניתנים לשחזור בתכונות מכניות על פני טווח של מחזורי טעינה. מערכת זו מאפשרת לתנועה ולהעמסה רלוונטיות מבחינה פיזיולוגית לגרום לשימוש יתר ובו זמנית לכמת ולמדוד את הכוחות המופעלים והנחווים על ידי הגיד במהלך משטר ההעמסה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

מחקר זה נערך בהתאם לאישור הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) במרכז הרפואי בית ישראל דיקונס. בעלי חיים הורדמו באמצעות 5% איזופלורן לזירוז ו-2.5% לתחזוקה, וננקטה זהירות כדי למנוע היפותרמיה.

1. הקמת מערך הבדיקות

1. שלוט בסיבוב הקרסול הפסיבי על ידי מנוע צעד כדי להחיל סיבוב ומומנט עקביים. שלוט במנוע הצעד באמצעות מיקרו-בקר. השתמש בכניסות ממערכת המיקום והכיוון התלת-ממדית כדי לסמן את דרגות הסיבוב. השתמש ביציאות מחיישן המומנט כדי לספק בקרת משוב להגדלת זווית הדורסיפלקסיה אם לא מגיעים לגבול הסף.
2. כדי להתחיל, חבר את המיקרו-בקר, חיישן המומנט, המיקום האלקטרומגנטי התלת-ממדי ומערכת הכיוון למחשב ולאספקת החשמל. שלוט במערכת שנבנתה בהתאמה אישית באמצעות קוד MATLAB שפותח בתוך החברה (איור 1). הורד את קובצי הקוד של MATLAB מ- GitHub ופעל בהתאם להוראות ספציפיות להפעלת הקוד מהוראות הדף של GitHub (https://github.com/Nazarian-Lab/PassiveAnkleDorsiflexionSystem).
3. פתחו את MATLAB עם קובצי הקוד. פתח את תוכנת PDImfc כדי לחבר את מערכת המיקום והכיוון האלקטרומגנטית התלת-ממדית לתוכנית MATLAB. לחץ על התחבר | P& רציף | StartSockExport(). השאר את היישום פתוח ברקע.

2. Ex-vivo ופוסט-מורטם

1. הרדימו שש חולדות ספראג-דולי בנות 13 שבועות באמצעות שאיפת_CO2 ושיטה משנית של המתת חסד באמצעות תורקוטומיה. מנתחים את גיד אכילס הימני עם הצומת הקלקניוס והמיוטנדי בשלמותם. יש להקפיא בטמפרטורה של -20°C כדי לבצע בדיקות מכניות במועד מאוחר יותר. לאחר הפשרת הגיד, חתך עדין והכנה לבדיקה מכנית, יש לבצע העמסת מתיחה עד לקבלת חוזק המתיחה האולטימטיבי (UTS) של הגיד (העמסה מוקדמת ל-0.1N, התניה מוקדמת למשך 10 מחזורים מ-0.1 ל-1 N, רמפה לכשל בתזוזה קבועה של 0.1 מ"מ לשנייה). השתמש ב- 15% מה- UTS כקלט עבור המערכת לביצוע התניה מוקדמת לשלב מאוחר יותר, כמתואר בשלב 3.4.
2. הרדימו קבוצה נוספת של חמישה בעלי חיים עם אותו הליך למדידות זרוע ומאמץ מומנטיות. בצע צילום רנטגן של רגל שמאל עם הקרסול ב 90° dorsiflexion ליד סרגל כהפניה. פתח את תמונת רנטגן בפיג'י, באמצעות הסרגל בתמונה כהפניה, מדוד את זרוע מומנט הגיד ממרכז הסיבוב של מפרק הקרסול לחלק האחורי של הקרסול כדי לשמש קלט בקוד MATLAB כדי להמיר את כוח הקלט עבור התניה מוקדמת המתוארת בשלב 2.1 לערך המומנט המתאים וכן המרה בין מומנט פלט וכוח לניתוח נתונים.
3. לשתק את הגפה האחורית השמאלית על ידי הקשה על שני סדים כדי למקם את הברך בהארכה מלאה. דורסיפלקס קלות את הקרסול על ידי לחיצה על הבהונות כדי להבטיח שסיבוב הקרסול יתרחש עקב הגיד המבודד ולא מערב רקמות רכות מסביב ונמצא במתח. אם לא במתח או אם יש תנועה בברך, הדביקו מחדש את הסד.
4. חשוף את הגיד על ידי הסרת העור סביב גיד אכילס. מניחים דבק על חרוז אלומיניום בקוטר 1/32 אינץ', מניחים אותו על הגיד החופשי הקרוב ביותר לצומת המיוטנדי של גיד אכילס, ומשתמשים במקלון צמר גפן עם מי מלח להסרת עודפי דבק. יש למרוח שוב ושוב מי מלח על גיד אכילס לאורך כל ההליך הנותר כדי להבטיח לחות של הרקמה.
5. מדוד את שטח החתך של הגיד באמצעות קליפר דיגיטלי לפני הפעלת עומס כלשהו. נניח שהגיד הוא אליפסה ומודדים את הרוחב והעובי בטריפליקטים.
6. הניחו את החולדה על משטח גוף מלא במצב נוטה. הדקו את הקרסול למפעיל המפרק באמצעות אזיקון סביב הקרסול ועוד אחד סביב אצבעות הרגליים, ואבטחו את פיצול הברך באמצעות שני אזיקונים. סובב את הסרן כך שהקרסול יהיה בפלנטרפלקסיה מלאה.
7. חבר את העט הדיגיטלי של מערכת המיקום והכיוון האלקטרומגנטית התלת-ממדית למחשב והפעל את ספק הכוח.
8. הפעל את קוד המערכת (המתואר בפירוט רב יותר בשלב 3) עבור מספר המחזורים שצוין (במחקר זה, שש חולדות שעברו המתת חסד קיבלו 7,200 מחזורים).
9. במחזורים של 0, 500, 1,000, 2,000, 3,600 ו-7,200 למדידות זן ex vivo, יש להשהות את משטר ההעמסה המחזורי ולמדוד את אורך הגיד מהקלקניוס לחרוז האלומיניום במרווחים של 5° מ-0 עד 40° של דורסיפלקסיה (גבול ההפעלה עקב אילוצים פיזיים של המערכת) באמצעות עט דיגיטציה תלת-ממדי בטריפליקטים לסירוגין.
10. חשב את המאמץ של הגיד בזוויות משתנות באמצעות האורכים המתקבלים משלב 2.9, כאשר האורך ההתחלתי הוא 0° dorsiflexion עבור כל מספר מחזור. בצע התאמה ליניארית כדי לקבל את הקשר בין זווית dorsiflexion ומאמץ בכל מספר מחזור. השתמש בקשר גומלין זה כדי להמיר נתוני זווית גולמיים למאמץ לצורך ניתוח נתונים.
11. חשב את שטח חתך הגידים באמצעות קליפר דיגיטלי ב 40° dorsiflexion בהנחה של אי דחיסות (נפח קבוע) כאשר אורך הגיד מודד ב 0° ו 40° ואת שטח החתך הנמדד ב 0°. השתמש באזור חתך זה בכל מספר מחזורים כדי להמיר כוח ללחץ לצורך ניתוח נתונים (מתח = כוח / שטח חתך).

3. פרוטוקול העמסה מכני

1. בחלק זה של המחקר השתמשנו ב-25 נקבות של חולדות בנות 11 שבועות מספראג-דוולי, כאשר כל אחת מהן חולקה באופן אקראי לקבלת 500, 1,000, 2,000, 3,600 או 7,200 מחזורים של העמסת עייפות.
   הערה: ההתניה המוקדמת, הכיול הראשוני והמדידה לפני ואחרי המדידה אורכים כ-15 דקות, ומשטר העמסת העייפות המחזורית אורך שנייה אחת בכל מחזור. לפיכך, הזמן הארוך ביותר שהחולדה נמצאת תחת הרדמה הוא כשעתיים, אשר בוצע תחת פרוטוקולים שאושרו על ידי IACUC.
2. חבר את המיקרו-בקר, חיישן המומנט, המיקום האלקטרומגנטי התלת-ממדי ומערכת ההתמצאות למחשב ולספק הכוח. שלוט במערכת שנבנתה בהתאמה אישית באמצעות קוד MATLAB שפותח בתוך החברה (איור 1).
3. הפעל את המחשב ופתח את MATLAB עם קבצי הקוד. פתח את תוכנת PDImfc כדי לחבר את מערכת המיקום והכיוון האלקטרומגנטית התלת-ממדית לתוכנית MATLAB. לחץ על התחבר | P& רציף | StartSockExport(). השאר את היישום פתוח ברקע.
4. יש להשרות הרדמה עם איזופלורן 5% באמצעות שאיפה בתא אינדוקציה. לאחר הזירוז, אבטחו את בעל החיים על מצע גוף מלא עם גוף חימום על בסיס מים המחובר כדי לשמור על הטמפרטורה ולקיים הרדמה עם 2.5% איזופלורן באמצעות חיבור חרוט אף. השתמש משחה רטובה על העיניים כדי למנוע יובש במהלך ההרדמה.
5. הניחו את החולדה על משטח גוף מלא במצב נוטה. הדקו את הקרסול למפעיל המפרק באמצעות אזיקון סביב הקרסול ועוד אחד סביב אצבעות הרגליים, ואבטחו את פיצול הברך באמצעות שני אזיקונים. סובב את הסרן כך שהקרסול יהיה בפלנטרפלקסיה מלאה.
   הערה: יש לוודא שהאזיקונים אינם גורמים להתכווצות או לנגעים, יש להקפיד על הידוק ובמידת הצורך להניח גזה בין האזיקון לעור לקבלת שכבת הגנה.
6. לשלבים הבאים הכרוכים בהפעלת קוד המערכת, לחצו על 'הפעל ב- MATLAB' עבור כל מקטע בקוד המתאים לבדיקת הטעינה הספציפית.
7. סובב את הקרסול 50 פעמים עד 15% מלחץ המתיחה האולטימטיבי בהתבסס על הערך של לחץ המתיחה האולטימטיבי של גיד אכילס ממשיכה, ex vivo לבדיקות כישלון כפי שנמדד על בסיס שלב 2.1.
8. בצע כיול ראשוני של הגיד על ידי dorsiflexing אותו שלוש פעמים עד 12°. השתמש בשיפוע האזור הליניארי של אזור הטעינה של עקומת ההיסטרזיס כדי לחשב את האזור המעריכי של העקומה.
9. בהדרגה dorsiflex הקרסול בזוויות עולות עד לקבלת האזור המעריכי של העקומה על ידי חישוב שיפוע שיא אזור ההעמסה של העקומה (מחושב באמצעות קוד MATLAB שפותח בתוך החברה) או עד שהוא מסובב ל 40°, המוקדם מביניהם.
10. בזווית הסופית שהתקבלה, בצע חמש מדידות מכניות מחזוריות כבסיס טעינה מראש.
11. בצע את משטר העמסת העייפות המחזורית עבור מספר מסוים של מחזורים (במחקר זה, עבור 500, 1,000, 2,000, 3,600 או 7,200 מחזורים).
12. כל 50 מחזורים, חשב את שיפוע חלק ההעמסה של עקומת ההיסטרזיס (מחושב באמצעות קוד MATLAB שפותח בתוך החברה) כדי לוודא שהוא עדיין באזור המעריכי. הגדל את זווית הדורסיפלקסיה ב- 1° אלא אם כן היא כבר ב- 40° עד להשגת אזור מעריכי זה.
13. לאחר השלמת משטר ההעמסה המחזורי, בצע חמש מדידות מכניות מחזוריות כמדידות לאחר העמסה בזווית שנבחרה בתחילה למדידת התכונות המכניות של הגידים.
14. הסירו את האזיקונים ואת הסד. החזירו את בעל החיים לחדר ההתאוששות. החיה אינה נותרת ללא השגחה עד שהיא חוזרת להכרה מספקת, ולאחר מכן היא מוחזרת לכלוב שלה. עקוב אחר בעלי החיים מדי יום עבור כל סימנים קליניים שליליים ואם קיים, לנהל buprenorphine במינון של 1.2 מ"ג / ק"ג תת עורית אחת כל 72 שעות או לבצע המתת חסד מוקדמת. יש להרדים את בעלי החיים לאחר 7 ימים של פעילות בכלוב באמצעות שאיפת_CO2 ואמצעי משני להמתת חסד באמצעות תורקוטומיה.
    הערה: יישום ההעמסה המחזורית והמדידות המכניות התקבלו באמצעות ג'יג בהתאמה אישית המורכב מחיישן מומנט, מפעיל מפרק קרסול מודפס בתלת-ממד ומיטת בעלי חיים, מערכת מיקום וכיוון אלקטרומגנטית תלת-ממדית, ומנוע צעד המסובב פיר כדי להשיג דורסיפלקסיה, כפי שדווח בעבר על ידי הקבוצה שלנו¹⁷. מערכת זו נשלטת על ידי סקריפט MATLAB המוזכר בשלב 1.2. חיישן המומנט ומערכת המיקום והכיוון לוכדים נתוני מומנט ומיקום לאורך פרוטוקול הטעינה של המערכת.

4. ניתוח נתונים

1. טענו את הנתונים לפני ואחרי המדידה בנפרד לתוך MATLAB.
2. המר את המומנט ללחץ בהתבסס על זרוע המומנט הנמדדת משלב 2.2 ושטח החתך שנמדד במספר העומסים שצוין שהופעל המתקבל משלב 2.11 באמצעות משוואות (1) ו- (2):
   (1)
   (2)
3. המר את הזווית למאמץ בהתבסס על ההמרה שהתקבלה משלב 2.10.
4. חשב את ממוצע ההיסטרזיס (השטח בין עקומות ההעמסה והפריקה), שיא הלחץ (ערך הלחץ המרבי של המחזור) ומודולי הטעינה והפריקה (התאמה ליניארית של 50% האחרונים של ההעמסה ו-60% הראשונים של עקומות הפריקה) עבור מחזורי המדידה לפני ואחרי המדידה.
5. חשב את אחוז השינוי בתכונות המכניות משלב 4.4 בין מחזורי המדידה שלפני ואחרי המדידה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

עם המספר ההולך וגדל של מחזורים מיושמים, חלה ירידה גדולה יותר בתכונות המכניות של גיד in vivo . הייתה ירידה נמוכה משמעותית בהיסטרזה ובמודולי ההעמסה והפריקה בקבוצת 500 המחזורים בהשוואה לקבוצות המחזור 3,600 ו-7,200 (p < 0.05) (תרשים 2). בעוד שחלה ירידה משמעותית בלחץ השיא למחזור מקבוצת 500 ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

מחקר זה מציג שיטה להעמסה מחזורית של גיד אכילס של חולדה עם מערכת דורסיפלקסיה פסיבית של הקרסול עבור מודל in-vivo המושרה על ידי שימוש יתר בגידים. חשיבותה של המערכת טמונה ביכולתה לבודד את גיד אכילס, להפעיל עומסים הניתנים לכימות ללא גישה כירורגית לגיד ולמדוד תכונות של גיד in-vivo .

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1/32'' Aluminum beads
2.5% isoflurane
3D digitizing pen	Polhemus, Vermont, NH, USA
3D electromagnetic positioning and orientation sensor	Polhemus, Vermont, NH, USA
5% isoflurane
Customized device: 1) Assembly, sensors, 3D printed animal bed and ankle mount actuator			Assembled as described in manuscript
MATLAB code	MATLAB, Natick, MA, USA
Microcontroller	Ivrea, Italy	Arduino UNO, Rev3
Nose cone
Scalpel and scalpel holder			No. 11 scalpel
Sprague-Dawley rats	Charles River Laboratories, Wilmington, MA, USA		11-13 weeks old
Stepper driver	SparkFun Electronics, Niwot, CO 80503	DM542T
Stepper motor	SparkFun Electronics, Niwot, CO 80503	23HE30-2804S
Straight forceps
Torque sensor assembly	Futek Inc., Irvine, CA, USA	FSH03985, FSH04473, FSH03927
Water heating pad