מיקרודיסקציה וצביעה אימונופלואורסצנטית של שרוולי שריר הלב בוורידי ריאה מורין

Summary

פרוטוקול זה מדגים בידוד מונחה מיקרוסקופיה וצביעה אימונופלואורסצנטית של ורידים ריאתיים מורינים. אנו מכינים דגימות רקמה המכילות את אטריום שמאל, ורידים ריאתיים, ואת הריאות המתאימות ומכתימים אותם עבור טרופונין T לב ו Connexin 43.

Abstract

ורידים ריאתיים (PVs) הם המקור העיקרי לפעימות חוץ רחמיות בהפרעות קצב פרוזדוריות וממלאים תפקיד מכריע בהתפתחות ובהתקדמות של פרפור פרוזדורים (AF). PVs מכילים שרוולי שריר הלב (MS) המורכבים קרדיומיוציטים. טרשת נפוצה מעורבת בהפעלה ובתחזוקה של מיקוד אוטומטי, מכיוון שהיא שומרת על דמיון לשריר הלב הפועל בלב, כולל היכולת לייצר דחפים חשמליים חוץ רחמיים. מכרסמים נמצאים בשימוש נרחב ועשויים לייצג מודלים מצוינים של בעלי חיים לחקר שריר הלב של ורידים ריאתיים, שכן קרדיומיוציטים נמצאים באופן נרחב בכל דופן כלי הדם. עם זאת, מיקרודיסקציה מדויקת והכנה של PVs מורין מאתגרת בשל גודל האיבר הקטן והאנטומיה המורכבת.

אנו מדגימים פרוטוקול מיקרודיסקציה מונחה מיקרוסקופיה לבידוד האטריום השמאלי של מורין (LA) יחד עם PVs. צביעה אימונופלואורסצנטית באמצעות נוגדנים Troponin-T (cTNT) ו- connexin 43 (Cx43) מבוצעת כדי להמחיש את LA ו- PVs באורך מלא. הדמיה בהגדלה של 10x ו- 40x מספקת תצוגה מקיפה של מבנה PV, כמו גם תובנות מפורטות על ארכיטקטורת שריר הלב, במיוחד הדגשת נוכחותו של קונקסין 43 בתוך הטרשת הנפוצה.

Introduction

פרפור פרוזדורים (AF) הוא הפרעת הקצב המתמשכת הנפוצה ביותר¹. השכיחות של AF עולה עוד יותר עם מספר צפוי של ~ 17.9 מיליון חולים באירופה בשנת 2060¹. AF חשוב מאוד מבחינה קלינית מכיוון שהוא גורם סיכון חיוני להתפתחות אוטם שריר הלב, אי ספיקת לב או שבץ, וכתוצאה מכך נטל אישי, חברתי וסוציו-אקונומי עצום. למרות שמיקוד אוטומטי ידוע כבר עשרות שנים, הפתופיזיולוגיה של AF עדיין לא מובנת במלואה².

כבר בסוף שנות התשעים, מחקרים הדגימו את ההשפעה הגדולה של ורידים ריאתיים (PVs) בייזום ושמירה על AF, שכן הם המקור העיקרי לפעימות חוץ רחמיות^{המפעילות AF 3}. הוכח כי PVs שונים מבחינה מבנית מכלי דם אחרים. בעוד כלי דם טיפוסיים מכילים תאי שריר חלקים, מדיה טוניקה של PVs מכיל גם cardiomyocytes⁴. במכרסמים, שריר לב זה נמצא בכל מקום בכל PVs, כולל חלקים תוך ריאתיים וחוץ-ריאתיים, כמו גם באזור הפתח⁵. בבני אדם, PVs מכילים גם קרדיומיוציטים, אשר ניתן לראות בתוך שלוחות של שריר הלב השמאלי פרוזדורים (LA) - מה שנקרא שרוולי שריר הלב (MS)^6,7.

לטרשת נפוצה יש דמיון מורפולוגי לשריר הלב הפרוזדורי⁸. הצורה והגודל של קרדיומיוציטים פרוזדורים ו- PV אינם משתנים באופן משמעותי זה מזה ומראים תכונות אלקטרופיזיולוגיות דומות⁸. רישומים אלקטרופיזיולוגיים בתוך PV הוכיחו את הפעילות החשמלית של טרשת נפוצה, והדמיה אנגיוגרפית חשפה התכווצויות המסונכרנות עם פעימות הלב ^9,10.

צמתי פער הם קומפלקסים חלבוניים יוצרי נקבוביות המורכבים משש תת-יחידות קונקסין, המאפשרות מעבר של יונים ומולקולות קטנות¹¹. צמתי מרווחים קיימים באפפוזיציות בין תאים, מחברים קרדיומיוציטים שכנים, ומאפשרים צימוד חשמלי בין-תאי בין קרדיומיוציטים^12,13. מספר איזופורמים של קונקסין מבוטאים בלב, כאשר קונקסין 43 (Cx43) הוא האיזופורם הנפוץ ביותר המתבטא בכל אזורי הלב¹⁴. מחקרים קודמים מספקים ראיות לביטוי של Cx43 בקרדיומיוציטים של PVs^15,16.

זה עדיין מאתגר לחקור טרשת נפוצה בתוך PVs שלמים בשל המבנה העדין שלהם, במיוחד במודלים של בעלי חיים קטנים. במאמר זה אנו מדגימים כיצד לזהות ולבודד PVs יחד עם LA ואונות ריאה בעכברים באמצעות מיקרודיסקציה מונחית מיקרוסקופיה. בנוסף, אנו מדגימים צביעה אימונופלואורסצנטית (IF) של PVs כדי להמחיש קרדיומיוציטים והחיבורים שלהם בתוך PVs.

Protocol

הטיפול בבעלי חיים וכל הליכי הניסוי נערכו בהתאם להנחיות ועדת הטיפול והאתיקה בבעלי חיים של אוניברסיטת לודוויג-מקסימיליאן במינכן, וכל ההליכים באמצעות עכברים אושרו על ידי Regierung von Oberbayern (ROB 55.2-2532. Vet_02-20-215, ROB 55.2-2532. Vet_02-18-46, ROB 55.2-2532. Vet_02-19-86, ROB 55.2-2532. Vet_02-21-178, ROB 55.2-2532. Vet_02-22-170). עכברי C57BL6/N הושגו באופן מסחרי.

1. הכנה

1. הכינו ג'ל אגרוז 3% על ידי ערבוב 3 מ"ג אגרוז ו-100 מ"ל של מלח חוצץ 1x Tris בצלוחית Erlenmeyer בנפח 500 מ"ל. מחממים את התמיסה במיקרוגל ב 600 W במשך 2-3 דקות עד הג'ל הופך הומוגני.
2. הכינו את צלחת הדיסקציה על ידי מזיגה עדינה של הג'ל לצלחת פטרי בקוטר 100 מ"מ. ממלאים את צלחת הפטרי חצי בג'ל. בועות שקופות מהג'ל כדי להבטיח עקביות הומוגנית. השאירו את צלחת הדיסקציה להתקרר עד שהג'ל הופך מוצק.
3. הכינו את כל המאגרים והפתרונות הדרושים, כולל תמיסת קיבוע, תמיסת חלחול, חיץ חוסם וחיץ כביסה בהתאם למתכונים המופיעים בטבלה 1.

2. קצירת איברים והכנת רקמות

הערה: פרוטוקול נרחב המפרט את הליך הרדמת העכבר וקצירת הלב פורסם בעבר^17,18. לפיכך, אנו מציגים רק תיאור קצר של חלק זה. ניסויים בוצעו על עכברים בני 12 עד 16 שבועות C57BL6 (שישה זכרים, ארבע נקבות). משקל הגוף של הזכר גדל מ-26 גרם ל-28 גרם ומשקל הגוף של הנקבה מ-19 גרם ל-22 גרם. השלבים הבאים בוצעו ללא הזרקת הפרין סיסטמית קודמת.

1. מרדימים את העכבר עם איזופלורן (5%, 95% חמצן, זרימה: 1 ליטר/דקה) ומבטיחים עומק הרדמה מספיק.
2. העבר את העכבר לשולחן הניתוח והציב אותו במצב שכיבה. לשמור על הנרקוזיס עם שאיפת איזופלורן (2%, 98% חמצן, זרימה: 1 ליטר לדקה) דרך מסכת הרדמה ולתקן את העכבר עם סרט בגפיים. להזריק פנטניל עבור שיכוך כאבים (0.1 מ"ג / 25 גרם משקל גוף i.p).
3. הרימו את הפרווה בתהליך הקסיפואידלי וקבעו חתך רוחבי של 2 מ"מ. מנתקים את הפרווה מהפאשיה התת עורית באמצעות דיסקציה קהה (אחורי מספריים) ומרחיבים את החתך באופן גולגולתי ורוחבי כדי לחשוף את בית החזה.
4. בזהירות לפתוח את הבטן caudal אל הקשת costal. להרים את התהליך xiphoidal מעט כדי לחתוך את הסרעפת מן caudal ולגרום לריאות לקרוס. לאחר מכן, חתכו את הסרעפת משמאל לימין מבלי לפגוע באיברים כלשהם ופתחו את בית החזה באופן דו צדדי כדי לחשוף את הלב.
5. חותכים את הווריד הנבוב התחתון (IVC) בזמן שהלב עדיין פועם כדי להרגיע את העכבר ולהמשיך לחורר את הלב על ידי חדירה לחדר השמאלי עם מחט 27 G והזרקת 10 מ"ל של מלח חוצץ פוספט קר כקרח (PBS).
6. לאחר ניקוי הדם מלב העכבר, אתר את קשת אבי העורקים, את הווריד הנבוב העליון (SVC) ואת קנה הנשימה. חותכים אותם ~ 3 מ"מ מעל בסיס הלב וקוצרים את הלב יחד עם הריאות המחוברות.
7. השקיעו את האיברים שנקטפו בצינור חרוטי של 10 מ"ל המכיל 2 מ"ל של תמיסת 30% סוכרוז מעוקרת. אפשר לדגימות להתייבש במשך 24 שעות ב 4 ° C.

3. הכנה מונחית מיקרוסקופיה של LA ו- PVs

1. הכניסו את הלב והריאות המיובשים לצלחת דיסקציה המכילה 40-50 מ"ל של 1x PBS. שים אותו תחת מיקרוסקופ שדה בהיר עם הגדלה פי 10 והגדר את התאורה. מניחים את הלב עם המשטח הגבי שלו על צלחת הדיסקציה. זהה את המעבר בין דופן החדר לדופן הפרוזדורים, והפרד בזהירות את החדרים מהאטריה באמצעות מספריים כירורגיים.
   הערה: חתכו כ-1 מ"מ נחותים מהאטריה כדי לשמור על רקמת חדר. זה יהיה נחוץ מאוחר יותר כדי להצמיד את האטריה לצלחת הדיסקציה מבלי לפגוע במבנים בבסיס הלב. אנו ממליצים לשמור על החדרים מכיוון שהם יכולים לשמש כדגימת בקרה חיובית. כדי להטמיע את רקמת החדר, בצע את אותו הליך המתואר להטמעת PVs, כמתואר בסעיף 4.
2. מניחים את האטריה המופרדת עם משטח חיתוך החדר (שלב 3.1) על צלחת הדיסקציה כך שבסיס הלב פונה כלפי מעלה. כוונו את האטריה כך שאונות הריאה יהיו אחוריות, LA ותוספתן פרוזדורים שמאלי (LAA) יהיו בצד ימין, והאטריום הימני (RA) ותוספתן פרוזדורים ימני (RAA) יהיו בצד שמאל. תקן את ההכנה על ידי הצמדת רקמת החדר השמאלי הנותרת לצלחת הדיסקציה. פזרו בעדינות את אונות הריאה מבלי להפעיל כוח מוגזם והצמידו אותן לצלחת הדיסקציה (איור 1A).
3. קבל סקירה כללית של ציוני הדרך האנטומיים בבסיס הלב.
   1. מצא את אבי העורקים עם קשת אבי העורקים במרכז בסיס הלב.
   2. זהה את תא המטען הריאתי (PT) ישירות מימין לאבי העורקים ועקוב אחר מסלולו לכיוון האחורי כדי להבחין בין עורקי הריאה (PAs). אמת את מיקומם על ידי מעקב אחר מסלולם עד לאונה השמאלית ולאונות הימניות העליונות/אמצעיות כדי למצוא את הילום הריאה המתאים (LH).
   3. קבעו את מיקום קנה הנשימה ו/או הסמפונות הראשיים השמאליים והימניים (L Br, R Br), הממוקמים אחוריים לאבי העורקים, וודאו את מיקומם על-ידי מעקב אחר מסלולם לכיוון LH (איור 1A).
   4. מצא את SVC משמאל לאבי העורקים ואמת על ידי ביצוע מסלולו לתוך RA ליד RAA.
4. הסר רקמת חיבור ושומן סביב בסיס הלב תוך שמירה על כל ציוני הדרך שזוהו לעיל. נוסף על כך, הסירו את קשת אבי העורקים ואת קנה הנשימה כדי לקבל מבט חופשי על בסיס הלב (איור 1B).
5. יש להפריד בעדינות את ה-PAs מהמשטח העליון של האטריום על ידי דיסקציה קהה באמצעות מלקחיים עדינים. לאחר מכן, חתכו אותם ב-LH והפכו אותם הצידה כדי לחשוף את הקיר השמאלי נטול הפרוזדורים (LAFW) ואת ה-PVs בממד המלא שלהם. נתקו את הסמפונות הראשיים מה-LH והוציאו את רקמת הסימפונות (איור 1C).
   הערה: ה-LH משמש הן כנקודת הכניסה המשותפת ל-PAs ולדרכי הנשימה לריאות, והן כנקודת היציאה של ה-PVs. חשוב לבצע כל הליך ב- LH בזהירות כדי למנוע נזק ל- PVs.
6. כדי להפריד את LA/RA ואת החדר השמאלי והימני (LV, RV), בצע חתך החל מהחלק הקדמי של RV הנותר כלפי מעלה דרך המסתם הטריקוספיד (TV) עד הצד הקדמי של SVC כדי לפתוח את RA מהצד הקדמי. חתכו את הקיר החופשי האחורי של RA (RAFW) ליד המחיצה הבין-פרוזדורית כדי להפריד בין RA ו-LA. חתכו את דופן החדר הימני האחורי ליד המחיצה הבין-חדרית כדי לנתק לחלוטין את ה-LV וה-RV.
   הערה: פרוטוקול נרחב המתאר בפירוט את הליך ההכנה והבידוד של האטריום הימני פורסם בעבר¹⁹. ההפרדה של RA שימושית כדי להסיר רקמות לא רצויות מקומפלקס רקמות LA-PV ולאסוף רקמות לניסויים נוספים.
7. להקטין את גודל אונות הריאה על ידי חיתוך חלק מרקמת הריאה הבסיסית כך כ 3-4 מ"מ של רקמת הריאה נשאר.
   הערה: שמרו על האפיקים של אונות הריאה כפי שהם משמשים כצפים במהלך שלבי ההטבעה הבאים ואפשרו הטבעה אופקית של PVs בתרכובת O.C.T.

4. הטבעת רקמות

1. העבירו את התכשיר, כולל LA ו-PVs, לקריומולד, וודאו שבסיס הלב וקודקוד הריאה פונים כלפי מעלה. סדרו אותם בתצורה פיזיולוגית - ודאו שה-PVs אינם מעוותים או מתהפכים.
2. מלאו את הקריומולד בתרכובת O.C.T ודחסו בעדינות את ה-PVs במלקחיים עדינים כדי להסיר את האוויר שנותר. לשמור על התצורה הפיזיולוגית שלהם ללא שינוי לאורך כל התהליך.
3. הניחו את הקריומולד עם הרקמה המוטבעת על קרח יבש כדי להקפיא את תרכובת ה-O.C.T. אחסנו את הדגימות בטמפרטורה של -80°C לשימוש עתידי.
   הערה: חיוני לשמור על PVs במצב אופקי כדי להבטיח קבלת חלקים המכילים PVs באורך מלא עבור הליכים הבאים.

5. חיתוך ואיסוף קטעי רקמות קפואים

הערה: כדי לחתוך את בלוקי הרקמות, הגדרות המכונה הותאמו לטמפרטורת דגימה של -18 ° C, וטמפרטורת להב של -25 ° C.

1. התקן בלוק רקמה על מחזיק הדגימה על-ידי החלת שכבה של תרכובת O.C.T. בין בלוק הרקמה למחזיק הדגימה. מקפיאים אותם למשך 3-4 דקות.
2. חסום את ראש הדגימה וטען את מחזיק הדגימה עם בלוק הרקמה על ראש הדגימה על ידי סגירת ידית שחרור הדגימה צ'אק. כוונן בעדינות את מיקום בלוק הרקמה באמצעות ידיות הכוונון העדינות.
3. הסר את הקריומולד מהדגימה. בטל את חסימת ראש הדגימה ואת הבלם החשמלי של ההקפאה.
4. הגדר את הקריוסטט למצב חיתוך עם גודל חיתוך בין 30 מיקרומטר ל- 50 מיקרומטר. חתוך את דגימת הרקמה עד שה- PVs הופכים גלויים.
5. עבור למצב חיתוך חתך עדין והגדר את העובי ל -10 מיקרומטר. התחל לאסוף מקטעים, כולל PVs ורקמות ריאה ופרוזדורים מחוברים. אספו חלקים בעזרת צלחת נגד גלגול או על ידי קיבוע הקצה החופשי של כל חלק למחזיק הלהב בעזרת מברשת קרה עדינה ופרשו אותם.
6. מקם שקופית (נשמרת בטמפרטורת החדר) בסמוך למקטע. שחררו בזהירות את החלק מהמברשת, ואפשרו לחלק להיצמד באופן טבעי לשקופית, כאשר החלק הקפוא ותרכובת ה-O.C.T נמסים עם נגיעה במשטח ההחלקה החם יותר.
   הערה: שמור על מצב יציב ועדין במהלך תהליך החתך כדי למנוע קרעים או קפלים במקטעים. החלף את הלהב בלהב חדש במידת הצורך.
7. אסוף עד שלושה מקטעים בכל שקופית. תייג את השקופיות ואחסן אותן בטמפרטורה של -20°C.
   הערה: אנו ממליצים לאסוף לפחות חמישה מקטעים (שווה ערך לשתי שקופיות) עבור כל PV.

6. צביעת אימונופלואורסנציה של קריוסקציות מה- PVs

1. מסדרים את המגלשות הקפואות על מערכת צביעה ומניחים למקטעים להפשיר כ-20 דקות בטמפרטורת החדר.
   הערה: מלאו את מערכת הצביעה במים כדי לשמור על לחות הדגימות. ייבוש הרקמה עלול לפגוע באנטיגנים, לגרום לקשירת נוגדנים לא ספציפיים ולהכתמת יתר במהלך הליכי הצביעה.
2. לאחר 20 דקות של הפשרה, כסו את המקטעים בכמה טיפות של תמיסת קיבוע (4% פרפורמלדהיד [PFA], טבלה 1) כדי לקבע את הרקמה על המגלשות למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
3. לאחר הקיבוע, העבר את השקופיות למדף השקופיות האנכי וטבול אותן במיכל מלא ב- PBS 1x. הניחו את המיכל על שייקר במהירות נמוכה ושטפו את המגלשות במשך 5 דקות. חזור על מחזור כביסה זה פעמיים נוספות, באמצעות PBS טרי 1 בכל פעם.
4. לאחר הכביסה, הקיפו בעיגול כל חלק בנפרד בכל שקופית בעט חוסם נוזלים המכיל קסילול. סדרו מחדש את השקופיות במערכת הצביעה ומרחו 1 או 2 טיפות של תמיסת חדירה (0.1% Triton X-100, טבלה 1) על כל דגימה עם פיפטה של פסטר. תנו למקטעים לדגור בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות כדי לחדור את קרומי התאים ואברוני התא.
5. לאחר החדירה, הסר את תמיסת Triton X-100 0.1% על-ידי שטיפת המגלשות במשך 3 x 5 דקות ב-PBS אחד, בהתאם לאותו הליך המתואר בשלב 6.3.
6. לאחר הכביסה, סדרו מחדש את השקופיות במערכת הצביעה והחילו טיפה אחת או שתיים של מאגר החסימה (טבלה 1) על כל חלק, כדי לוודא שהן מכוסות במלואן במאגר החסימה. אפשר לדגור על המגלשות במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
7. הכן 1 מ"ל של תערובת הנוגדנים הראשונית על ידי פיפטציה של 5 μL של נוגדן נגד cTNT עכבר (מדולל 1:200) ו 1 μL של נוגדן ארנב נגד Cx43 (מדולל 1:1,000) לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל מלא 994 μL של מאגר חוסם. פיפטה את התערובת למעלה ולמטה כדי להבטיח ערבוב יסודי.
   הערה: התאם את כמות תערובת הנוגדנים המיושמת בהתאם לגודל המקטע. ודא כי החלקים מכוסים במלואם על ידי תערובת נוגדנים. הריכוז, זמן הדגירה וטמפרטורת הדגירה האופטימלית של נוגדנים יכולים להשתנות בהתאם לגורמים כגון סוג הנוגדן, שיבוט נוגדנים ומאפייני הרקמות. אנו ממליצים לבדוק ולייעל את תנאי הכתמים בנפרד עבור כל נוגדן.
8. לאחר שלב החסימה (שלב 6.6), הסר את מאגר החסימה הנותר ומרח ישירות 2 או 3 טיפות של תערובת הנוגדנים העיקרית על כל מקטע. אפשר למגלשות לדגור לילה ב 4 מעלות צלזיוס.
9. לאחר הדגירה הראשונית של הנוגדנים, שטפו את המגלשות במשך 3X5 דקות עם חיץ כביסה תחת ניעור עדין (טבלה 1).
10. הכינו 1 מ"ל של תערובת הנוגדנים המשנית על ידי פיפטציה של 1 μL של נוגדן משני נגד עכבר עז מצומד AF488 (מדולל ביחס של 1:1,000) ו-1 μL של נוגדן משני נגד ארנב עז מצומד AF568 (מדולל ביחס של 1:1,000) לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל מלא ב-998 מיקרו-ליטר של חיץ כביסה. פיפטה את התערובת למעלה ולמטה כדי לערבב היטב.
11. לאחר שלב הכביסה (שלב 6.9), סדרו מחדש את המגלשות במערכת הצביעה ומרחו 2 או 3 טיפות מתערובת הנוגדנים המשנית על כל חלק עם פיפטה. אפשר לנוגדנים לדגור במשך 45 דקות בטמפרטורת החדר תוך הגנה על הדגימות מפני אור כדי למנוע מרווה פלואורופורית. לאחר הדגירה השניונית של הנוגדנים, שטפו את המגלשות במשך 3X5 דקות עם חיץ כביסה תחת ניעור עדין (טבלה 1).
12. סדרו מחדש את השקופיות במערכת הצביעה. הכתימו את המקטעים עם Hoechst-33342 (בדילול של 1:1,000 ב-1x PBS) על ידי מריחת 2 עד 3 טיפות של תמיסת Hoechst-33342 על כל קטע. אפשר לדגור על המגלשות במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
13. לאחר הדגירה, שטפו את המגלשות 3X5 דקות עם חיץ כביסה תחת ניעור עדין (טבלה 1). הרכבה של המגלשות על-ידי החלת טיפה אחת או שתיים של אמצעי הרכבה פלואורסצנטי על כל שקופית. כסו את המגלשות בכיסויים.
    הערה: ודא שמכסה הכיסוי שטוח בעת הנחתו. אם קיימות בועות אוויר, הפעילו בעדינות לחץ על צד הבועה כדי להסיר אותן.
14. אחסן את השקופיות המותקנות בשומר שקופיות ב- 4 °C.
    הערה: מומלץ לצלם את השקופיות מוקדם ככל האפשר. פרוטוקול זה אינו תקף באופן בלעדי עבור הנוגדנים שהוזכרו. ניתן להחליף או לשנות אנטיגנים ונוגדנים ממוקדים בהתאם לדרישות הניסוי הבודד או אסטרטגיות זיהוי אנטיגן חלופיות.

7. הדמיה של פרוסות צביעת immunofluorescence

1. הגדר את המיקרוסקופ.
   1. הפעל את המיקרוסקופ עם מקור אור הלייזר, המחשב המחובר והתוכנה הנלווית בהתאם למדריך היצרן.
   2. הזן את תפריט תצורה . לחץ כדי לבחור את סוג המצלמה המתאים לצילום פלואורסצנטי (למשל, מצלמת מונוכרום DFC365FX).
   3. היכנסו לתפריט 'רכישה' וצרו שלושה ערוצים.
   4. בחר ערוץ FCr1 לזיהוי Hoechst-33342, תייג אותו ובחר את קוביית מסנן DAP במקטע הבחירה. הגדר את זמן החשיפה ל- 200 אלפיות השנייה, את הרווח האלקטרוני ל- 2 ואת עוצמת האור ל- 17%.
   5. בחר ערוץ FCr2 לזיהוי cTNT (מוכתם בנוגדן מצומד AF488), תייג אותו ובחר את קוביית המסנן L5 במקטע הבחירה. הגדר את זמן החשיפה ל- 200-300 אלפיות השנייה, את הרווח האלקטרוני ל- 1.8 ואת עוצמת האור ל- 100%.
   6. בחר ערוץ FCr3 לזיהוי Cx43 (מוכתם בנוגדן מצומד AF568), תייג אותו ובחר את קוביית מסנן TXR במקטע הבחירה. הגדר את זמן החשיפה ל- 150 אלפיות השנייה, את הרווח האלקטרוני ל- 2 ואת עוצמת האור ל- 100%.
      הערה: המאפיינים הספקטרליים של קוביות המסנן מפורטים בטבלה 2.
2. טען את השקופית על במת המיקרוסקופ.
3. בצע הדמיה כללית בהגדלה של 10x:
   1. בחר במטרה 10x ופתח את תריס הלייזר על-ידי לחיצה על Live. כאשר ערוץ FCr1 נבחר, השתמש בפונקציית הנווט כדי לנווט בשקופית עד לזיהוי אות. מקדו בערך את הדגימה עד שניתן יהיה להבחין בין גרעיני התא.
   2. הפעל את מצב הסריקה הספירלית כדי ללכוד תצוגה מקדימה מלאה של הדגימה. בטל את ההפעלה החיה על-ידי לחיצה נוספת על הלחצן כדי להגן על הדגימה. זהה את LA, PVs ורקמת הריאה.
   3. הגדר את תחום העניין לסריקת האריחים הבאה; בחר נקודות מיקוד מרובות באזור העניין. לחץ על שידור חי בערוץ FCr1 והתאם את המיקוד עבור כל נקודת מיקוד. שמור את מיקומי Z המתאימים, המייצגים את מיקום המיקוד המדויק עבור כל נקודת מיקוד. התחל את סריקת האריחים בהגדלה של 10x כדי ללכוד תמונת סקירה מלאה של הדגימה.
   4. לאחר השלמת הסריקה, פתח את סריקת האריחים ומיזג את התמונות הבודדות. כדי לשפר את הבהירות והניגודיות של ערוצים בודדים, בחר אותם בסרגל האובייקטים והתאם את טווח האות שלהם באמצעות המחוונים כרצונך.
4. קבל תמונות מוגדלות בהגדלה של 40x :
   1. בחר את המטרה 40x. התאם את זמן החשיפה ואת הגדרות הרווח עבור כל ערוץ באופן הבא: FCr1: קוביית מסנן DAP: זמן חשיפה: 50 אלפיות השנייה, רווח: 1.5; FCr2: קוביית מסנן L5: זמן חשיפה: 80 אלפיות השנייה, רווח: 1.8; FCr3: קוביית מסנן TXR: זמן חשיפה: 20 אלפיות השנייה, רווח: 2.
   2. השתמש בתמונת הסקירה של שלב 7.3 כדי לאתר את פתח ה- PV (PVO), כמו גם אזורי PV חוץ-ריאתיים ותוך-ריאתיים (PV_ex, PV_in). הגדר אזור זה לסריקה.
   3. פתח את תפריט המשנה תמונה ולחץ על z כדי להפעיל Z-Stack.
      1. בחר את ערוץ FCr1 ופתח את תריס הלייזר כדי לקבל תצוגה מקדימה חיה .
      2. עבור לתפריט המשנה Z-Stack וקבע את נקודות ההתחלה והסיום של Z-Stack על ידי סיבובידית הכוונון העדין f ocus בכיוון השעון ונגד כיוון השעון עד שהאות הכולל מתחיל לאבד את המיקוד.
      3. לאחר הגדרת טווח המיקוד, בחר במצב Z-Stack ממוטב של המערכת והפעל את האפשרות חשב עומק שדה מורחב של תמונות (EDF). בהתאם למידת השטוחות של הרקמה, צפו לכ-20 שכבות עם מרווח צעדים של כ-0.5 מיקרומטר.
   4. התחל את סריקת האריח. לאחר הסריקה, פתח את סריקת האריח ומיזג רק את תמונת ה- EDF. כדי לשפר את הבהירות והניגודיות של ערוצים בודדים, בחר אותם בסרגל האובייקטים והתאם את טווח האות שלהם באמצעות המחוונים לפי הצורך (ראה שלב 7.3.4).
5. לאחר יצירת התמונות, שמור את הפרויקט וייצא את שניהם, את הגרסה הממוזגת ואת ערוצי הגלם של כל תמונה כקובץ TIFF.
   הערה: שמירת הקבצים כ- TIFF קריא של ImageJ מאפשרת ל- ImageJ לייבא את גודל האריח המקורי במיקרומטר במקום בפיקסלים. סגור תמיד את תריס הלייזר בכל פעם שאין צורך באות לייזר כדי למנוע הלבנה של הנוגדנים המשניים.

8. עריכת תמונות עם ImageJ

1. טען את קובצי הערוצים הגולמיים המתאימים ב- ImageJ. לחץ על תמונה | צבע | מזג ובחר את הצבע הרצוי לכל ערוץ.
2. צור סרגל קנה מידה על-ידי בחירה באפשרות נתח | כלים | סרגל קנה מידה והדבק אותו בפינה השמאלית התחתונה. המשך בעיבוד וניתוח נוספים בהתאם לדרישות התמונה. שמרו את התמונות הממוזגות בסיום.

תוצאות

ביצענו מיקרודיסקציה, צביעה והדמיה של PVs ב-10 עכברים בני 12-16 שבועות. בעקבות הפרוטוקול, חתכנו בהצלחה PVs יחד עם LA בכל עכברי הניסוי והשגנו חלקים עם תצוגה מקיפה של PVs בשמונה עכברים. תמונות סקירה צולמו בהגדלה של פי 10 כדי לזהות את אזור פתח ה-PV (PVO) בצומת LA-PV, את ה-PVs החוץ-ריאתיים (PV_ex) (PVs בין הילום הרי?...

Discussion

עם פרוטוקול זה, אנו חולקים שיטה להבחין ולבודד את PVs של לב העכבר ולבצע צביעה immunofluorescence עליהם. לאחר קצירת האיברים, הלב והריאות התייבשו בתמיסת סוכרוז מעוקרת, ולאחר מכן הפרדת החדרים מהאטריום ואונות הריאה בהנחיה מיקרוסקופית. לאחר מכן, בסיס הלב היה מוכן לדמיין את PVs ואחריו לחתוך אותם מן הריאות בה?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adhesion slides	Epredia	10149870
AF568-secondary antibody	Invitrogen	A11036	Host: Goat, Reactivity: Rabbit
Agarose	Biozym LE	840104
Alexa Fluor 488-secondary antibody	Cell Signaling Technology	4408S	Host: Goat, Reactivity: Mouse
Anti-Connexin 43 /GJA1 antibody	Abcam	ab11370	Polyclonal Antibody, Clone: GJA1, Host: Rabbit
Anti-cTNT antibody	Invitrogen	MA5-12960	Monoclonal Antibody, Clone: 13-11, Host: Mouse
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A2153
Brush	Lukas	5486	size 6
Cover slips	Epredia		24 mm x 50 mm
Cryotome Cryo Star NX70	Epredia		Settings: Specimen temperature: -18 °C, Blade Temperature: -25 °C
DFC365FX camera	Leica
DM6 B fluorescence microscope	Leica
Dry ice
Dubecco's phosphate-buffered saline (DPBS) 1x conc.	Gibco	14040133	500 mL
Dumont #5FS Forceps	F.S.T.	91150-20	2 pieces needed
Fine Scissors	F.S.T.	14090-09
Fluorescence mounting medium	DAKO	S3023
Graefe Forceps	F.S.T.	11052-10
Hoechst 33342	Invitrogen	H3570	Cell nuclei counterstaining
ImageJ	FIJI		analysis and processing software
LAS X	Leica		Imaging software for Leica DM6 B
Microtome blades S35	Feather	207500000
Microwave
Normal goat serum	Sigma-Aldrich	S26-M
O.C.T. compound	Tissue-Tek	4583
Paraformaldehyde 16%	Pierce	28908	methanol-free
Pasteur pipettes	VWR	612-1681
Petri dish	TPP	93100	100 mm diameter
Rocker 3D digital	IKA Schüttler	00040010000
Slide staining jars	EasyDip	M900-12
Specimen Molds	Tissue-Tek Cryomold	4557	25 mm x 20 mm x 5 mm
StainTray M920 staining system	StainTray	631-1923	Staining system for 20 slides
Sterican Needle	Braun	4657705	G 27 - used for injection (step 2) and pinning (step 3 and 4) in the protocol
Student Vannas Spring Scissors	F.S.T.	91500-09
Super PAP Pen Liquid Blocker	Super PAP Pen	N71310-N
Syringes	Braun	4606108V	10 mL
Tris base	Roche	TRIS-RO	component for 1x Tris-Buffered Saline (TBS)
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Tween 20	Sigma-Aldrich	P2287